一种制备稀有人参皂苷的方法与流程

1.本发明涉及皂苷制备领域，具体涉及一种制备稀有人参皂苷的方法。


背景技术：

2.作为著名中草药人参属植物的标志性成分，人参皂苷一直以来受到多领域学者的关注。人参是由苷元和糖基通过糖苷键连接而成。苷元以四环三萜达玛烷型为主，包括二醇类皂苷和三醇类皂苷。糖基的种类有葡萄糖基、木糖基、鼠李糖基、阿拉伯糖基。二醇类皂苷在3-o-位和20-o-位上连接有糖基，三醇类皂苷则在6-o-位和20-o-位上连接有糖基。天然的原型皂苷带有3-4个糖基，它们作为前体药，进入生物体内后并不能直接被吸收利用起药效，而是首先被代谢成1-2个糖基的次级皂苷后才被吸收输送到各个靶点起药效。因此，低糖基的人参皂苷活性更高，但是在自然界中含量极低，因此也被称为稀有人参皂苷。
3.数十年来，研究者们一直在致力于制备稀有人参皂苷的研究。无论是物理化学法还是近些年新兴的生物转化法，都是以多糖基原型皂苷为原料，依次切掉糖基制备稀有人参皂苷。
4.现有技术生产稀有人参皂苷，对底物的要求很高，需要针对目的产物使用单一底物做原料，例如要生产cmx，就要用高纯度的rb3做原料；要生产高纯度的cmc，就要用高纯度的rc做原料；要生产高纯度的f1，就要用高纯度的rg1做原料；要生产高纯度的ck，就要用高纯度的二醇类皂苷做原料（且不能含有二醇类皂苷rg3）。这样就对原料要求极高，无法大规模生产，大大增加了生产成本，难以商业化。


技术实现要素：

5.针对以上技术问题，本发明提供一种制备稀有人参皂苷的方法，并要达到以下发明目的：对底物要求低，不需要针对目的产物使用单一底物做原料，反应过程中副产物少，反应单一，产物纯度高，易于大规模生产。
6.为实现以上发明目的，本发明采用技术方案如下：一种制备稀有人参皂苷的方法，包括以下步骤：步骤1、制备酶i（1）制备培养基a：配方为1%蛋白胨、0.1-1%葡萄糖、10-20mm zncl2，余量为水。将上述组分配制成培养基a，灭菌，备用。
7.（2）向培养基a中接入菌种，菌种为米曲霉。接种量为1-9%。
8.接种完成后，于25-30℃、常压条件下培养，并通入无菌空气，无菌空气通入量为0.5-1.5m
³
/小时；培养3-4d。
9.（3）向培养基a中加入的甘油、ppd皂苷（二醇类人参皂苷），培养3-4d。
10.所述甘油的加入量为基础培养基质量的0.1-0.2%；所述ppd皂苷的加入量为基础培养基质量的0.1-1%。所述ppd皂苷由人参皂苷rb1、rb2、rb3、rc、rd按照（0.2-1）:（0.2-1）：（0.2-1）：（0.2-1）：（0.2-1）的比例混合而成。
11.（4）再向培养基a中加入ppt皂苷（三醇类人参皂苷），培养3-4d。
12.所述ppt皂苷的加入量为基础培养基质量的0.1-1%，所述ppt皂苷由人参皂苷r1、re、rg1按照（0.2-1）:（0.2-1）：（0.2-1）的比例混合而成。
13.（5）离心除去菌体，加入乙醇，乙醇加入量为培养基质量的3-4倍，离心或过滤收集沉淀，得酶i。
14.步骤2、制备酶ii（1）制备培养基b：配方为1%蛋白胨，0.1-1%葡萄糖，10-20mm zncl2，10-20mm mgcl2，5-10mm k2hpo4，余量为水。将上述组分配制成培养基b，灭菌，备用。
15.（2）向培养基b中接入菌种，菌种为米曲霉。接种量为1-9%。接种完成后，20-26℃培养3-5d。
16.（3）向培养基b中加入无菌的葡聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖，28-35℃培养3-5d。所述葡聚糖的加入量为培养基b质量的1-3%；所述木聚糖的加入量为培养基b质量的1-3%；所述阿拉伯聚糖的加入量为培养基b质量的1-3%。
17.（4）离心除去菌体，加入乙醇，乙醇加入量为培养基质量的3-4倍，离心或过滤收集沉淀，得酶ii。
18.步骤3、制备苷元将ppd皂苷或ppt皂苷或二者的混合物制备成皂苷溶解液，皂苷溶解液中皂苷的质量浓度为0.1-5%。将皂苷溶解液与酶i混合，皂苷与酶i的质量比为1:1-2，于40-45℃反应24-72h，制得苷元。
19.所述ppd皂苷为二醇类人参皂苷；ppt皂苷为三醇类人参皂苷。
20.步骤4、制备皂苷将苷元溶于乙醇，苷元与乙醇的质量比为1：3-5，然后加入缓冲液形成悬液后，与酶ii混合，再通过加入糖，并控制反应温度，获得稀有人参皂苷。所述酶ii与皂苷的质量比为1:1-2。
21.加入的糖为葡萄糖、鼠李糖、木糖以及阿拉伯糖中的一种或多种。
22.所述反应温度为30-45℃。
23.所述反应温度在30-33℃时，苷元的20号碳上连接糖基；反应温度在40-45℃时，二醇苷元的3号碳和三醇苷元的6号碳上连接糖基。
24.所述糖的加入量为苷元摩尔数的1-2倍时，苷元可连接一个糖基。所述糖的加入量为苷元摩尔数的3-4倍时，苷元可连接2个糖基。
25.本发明采用的菌种也可以为酱油曲霉、黑曲霉、土曲霉、乳酸菌中的一种。
26.采用本发明技术方案，具有以下有益效果：本发明先用水解酶水解ppd皂苷或ppt皂苷或上述两类皂苷的混合物生成苷元，再用合成酶将苷元连接各种糖基制备稀有皂苷。
27.本发明采用任意二醇类人参皂苷或三醇类人参皂苷或二者的组合为底物，均可制备稀有人参皂苷；制备的稀有人参皂苷包括ck、cmx、cmc、（r,s）-rg3、f1、rg1、re等稀有人参皂苷；且制得的稀有人参皂苷纯度达到70%以上，副产物少，商业价值高。
附图说明
28.附图1为实施例1中s-ppd和r-ppd的分子结构式；附图2为实施例1中s-ppt和r-ppt的分子结构式。
29.附图3为实施例1制得产品的hplc色谱图；附图4为实施例1中稀有人参皂苷ck的分子结构式；附图5为实施例2制得产品的hplc色谱图；附图6为实施例2中稀有人参皂苷cmx的分子结构式；附图7为实施例3制得产品的hplc色谱图；附图8为实施例3中稀有人参皂苷cmc的分子结构式；附图9为实施例4制得产品的hplc色谱图；附图10为实施例4中稀有人参皂苷r-rg3和s-rg3的分子结构式；附图11为实施例5制得产品的hplc色谱图；附图12为实施例5中稀有人参皂苷f1的分子结构式；附图13为实施例6制得产品的hplc色谱图；附图14为实施例6中稀有人参皂苷rg1的分子结构式；附图15为实施例7制得产品的hplc色谱图；附图16为实施例7中稀有人参皂苷re的分子结构式。
具体实施方式
30.实施例1一种制备稀有人参皂苷的方法步骤1、制备酶i（1）称取10g蛋白胨、5g葡萄糖、2gzncl2、983g水，混合溶解；经121℃灭菌20min，降温至25℃，制得培养基a，备用。
31.（2）向培养基a中接入菌种，菌种为米曲霉，拉丁学名：aspergillus oryzae，菌种保藏号：cgmcc 3.13904。接种量为8%。接种完成后，于28℃、常压条件下培养，并通入无菌空气，无菌空气通入量为1m
³
/小时；培养3d。
32.（3）培养3d后，向培养基a中加入1g甘油、1gppd皂苷（二醇类人参皂苷），继续培养3d。所述ppd皂苷由人参皂苷rb1、rb2、rb3、rc、rd按照1:1：1：1：1的比例混合而成。
33.（4）培养3d后，向培养基a中加入1gppt皂苷（三醇类人参皂苷），培养3d，培养过程中根据水分损失情况适量补充无菌水。
34.（5）离心除去菌体，保留液相，并向液相中加入纯度95%（体积百分数）的食用乙醇，乙醇加入量为培养基质量的3-4倍；离心并收集沉淀，得酶i。
35.步骤2、制酶ii（1）称取10g蛋白胨、5g葡萄糖、2gzncl2、2g mgcl2、1g k2hpo4、980g水，混合溶解；经121℃灭菌20min，降温至25℃，制得培养基b，备用。
36.（2）向培养基b中接入菌种，菌种为米曲霉，拉丁学名：aspergillus oryzae，菌种保藏号：cgmcc 3.13904。接种量为5%。接种完成后，于26℃、常压条件下培养，并通入无菌空气，无菌空气通入量为1m
³
/小时；培养4d。
37.（3）培养4d后，向培养基b中加入无菌的葡聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖，32℃培养4d。
所述葡聚糖的加入量为培养基b质量的1%；所述木聚糖的加入量为培养基b质量的3%；所述阿拉伯聚糖的加入量为培养基b质量的2%。
38.（4）离心除去菌体，加入纯度95%（体积百分数）的食用乙醇，乙醇加入量为培养基质量的3-4倍；离心并收集沉淀，得酶ii。
39.步骤3、制备苷元（1）用2000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解20g酶i，制得酶i溶解液。
40.用2000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解40g二醇类人参皂苷（ppd），制得ppd溶解液。
41.将制备的酶i溶解液与ppd溶解液混合，酶i与ppd的质量比为1:2，于45℃反应65h，然后离心收集反应液中的沉淀。
42.将沉淀用酒精溶解，加水至浑浊，上预先处理好的大孔吸附树脂柱，吸附完全后水洗除去糖等水溶性成分，再用80%酒精将苷元洗脱下来。浓缩干燥后，得二醇人参皂苷元（固体）15.2g。二醇人参皂苷元包括s-ppd和r-ppd，分子结构式如附图1所示。
43.（2）用2000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解20g酶i，制得酶i溶解液。
44.用2000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解20g三醇类人参皂苷（ppt），制得ppt溶解液。
45.将制备的酶i溶解液与ppt溶解液混合，酶i与ppt的质量比为1:1，于45℃反应65h，然后离心收集反应液中的沉淀。
46.将沉淀用酒精溶解，加水至浑浊，上预先处理好的大孔吸附树脂柱，吸附完全后水洗除去糖等水溶性成分，再用80%酒精将苷元洗脱下来。浓缩干燥后，得三醇人参皂苷元（固体）8.4g。三醇人参皂苷元包括s-ppt和r-ppt，分子结构式如附图2所示。
47.步骤4、制备皂苷用1000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解5g酶ii，制得酶ii溶解液，备用。
48.称取0.001mol二醇人参皂苷元，溶于2g酒精，然后加入47g缓冲液使其成为悬液。所述缓冲液为ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液。
49.向悬液中加入50g酶ii溶解液，并加入0.0015mol葡萄糖，在反应温度30℃条件下，边搅拌边反应48h。
50.反应结束后，向反应液中加入350ml 95%（体积百分数）乙醇中，离心，上清液浓缩除去乙醇，用大孔吸附树脂纯化，洗脱后即得产品。对产品进行hplc检测, hplc色谱图如图3所示。
51.从hplc色谱图可知，产品为稀有人参皂苷ck。检测产品的纯度为85.2%。
52.从结构上看，ck在20号碳上连接一个葡萄糖基。稀有人参皂苷ck的分子结构式如附图4所示。
53.实施例2一种制备稀有人参皂苷的方法与实施例1的制备方法相同，只改变步骤4制备皂苷。具体如下：步骤4、制备皂苷用1000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解6g酶ii，制得酶ii溶解液，备用。
54.称取0.001mol二醇人参皂苷元，溶于2g酒精，然后加入47g缓冲液使其成为悬液。所述缓冲液为ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液。
55.向悬液中加入50g酶ii溶解液，并加入0.0015mol葡萄糖，在反应温度30℃条件下，边搅拌边反应48h。然后，再向反应液中加入0.004mol木糖，在反应温度30℃条件下，继续反应72h。
56.反应结束后，向反应液加入350ml 95%（体积百分数）乙醇中，离心，上清液浓缩除去乙醇，用大孔吸附树脂纯化，洗脱后即得产品。对产品进行hplc检测, hplc色谱图如图5所示。
57.从hplc色谱图可知，产品为稀有人参皂苷cmx。检测产品的纯度为87.7%。从结构上看，cmx在20号碳上连接一个葡萄糖基和一个木糖基。稀有人参皂苷cmx的分子结构式如附图6所示。
58.实施例3一种制备稀有人参皂苷的方法与实施例2的制备方法相同，只改变步骤4制备皂苷中的“木糖”替换为“呋喃阿拉伯糖”。具体如下：步骤4、制备皂苷用1000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解6g酶ii，制得酶ii溶解液，备用。
59.称取0.001mol二醇人参皂苷元，溶于2g酒精，然后加入47g缓冲液使其成为悬液。所述缓冲液为ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液。
60.向悬液中加入50g酶ii溶解液，并加入0.0015mol葡萄糖，在反应温度30℃条件下，边搅拌边反应48h。然后，再向反应液中加入0.004mol呋喃阿拉伯糖，在反应温度30℃条件下，继续反应72h。
61.反应结束后，将反应液加入350ml95%（体积百分数）乙醇中，离心，上清液浓缩除去乙醇，用大孔吸附树脂纯化，洗脱后得到产品。对产品进行hplc检测, hplc色谱图如图7所示。
62.从hplc色谱图可知，产品为稀有人参皂苷cmc；从结构上看，cmc在20号碳上连接一个葡萄糖基和一个呋喃阿拉伯糖基。检测产品的纯度为91.3%。
63.稀有人参皂苷cmc的分子结构式如附图8所示。
64.实施例4一种制备稀有人参皂苷的方法与实施例1的制备方法相同，只改变步骤4制备皂苷。具体如下：步骤4、制备皂苷用1000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解10g酶ii，制得酶ii溶解液，备用。
65.称取0.002mol二醇人参皂苷元，溶于4g酒精，然后加入47g缓冲液使其成为悬液。所述缓冲液为ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液。
66.向悬液中加入50g酶ii溶解液，并加入0.008mol葡萄糖，在反应温度40℃条件下，边搅拌边反应72h。
67.反应结束后，将反应液加入350ml 95%（体积百分数）乙醇中，离心，上清液浓缩除去乙醇，用大孔吸附树脂纯化，洗脱后即得产品。对产品进行hplc检测, hplc色谱图如图9
所示。
68.从hplc色谱图可知，产品为稀有人参皂苷rg3。从结构上看，rg3在3号碳上带有2个葡萄糖基，有r和s两种异构体，即r-rg3和s-rg3。
69.经检测，稀有人参皂苷rg3的总含量为92.4%。
70.稀有人参皂苷r-rg3和s-rg3的分子结构式如附图10所示。
71.实施例5一种制备稀有人参皂苷的方法与实施例1的制备方法相同，只改变步骤4制备皂苷。具体如下：步骤4、制备皂苷用1000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解20g酶ii，制得酶ii溶解液，备用。
72.称取0.004mol三醇人参皂苷元，溶于6g酒精，然后加入47g缓冲液使其成为悬液。所述缓冲液为ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液。
73.向悬液中加入50g酶ii溶解液，并加入0.006mol葡萄糖，在反应温度30℃条件下，边搅拌边反应48h。
74.反应结束后，向反应液加入350ml95%乙醇中，离心，上清液浓缩除去乙醇，用大孔吸附树脂纯化，洗脱后即得产品。对产品进行hplc检测, hplc色谱图如图11所示。
75.从hplc色谱图可知，产品为稀有人参皂苷f1。从结构上看，f1在20号碳上连接一个葡萄糖基。
76.检测产品的纯度为78.5%。
77.稀有人参皂苷f1的分子结构式如附图12所示。
78.实施例6一种制备稀有人参皂苷的方法与实施例1的制备方法相同，只改变步骤4制备皂苷。具体如下：步骤4、制备皂苷用1000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解20g酶ii，制得酶ii溶解液，备用。
79.称取0.004mol三醇人参皂苷元，溶于6g酒精，然后加入47g缓冲液使其成为悬液。所述缓冲液为ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液。
80.向悬液中加入50g酶ii溶解液，并加入0.008mol葡萄糖，在反应温度30℃条件下，边搅拌边反应48h。然后，将反应温度升高至40℃，再向反应液中加入0.008mol葡萄糖，反应72h。
81.反应结束后，将反应液加入350ml95%（体积百分数）乙醇中，离心，上清液浓缩除去乙醇，用大孔吸附树脂纯化，洗脱后得到产品。对产品进行hplc检测, hplc色谱图如图13所示。
82.从hplc色谱图可知，产品为稀有人参皂苷rg1。从结构上看，rg1在20和6号碳上各连有一个葡萄糖基。检测产品的纯度为90.1%。
83.稀有人参皂苷rg1的分子结构式如附图14所示。
84.实施例7一种制备稀有人参皂苷的方法与实施例1的制备方法相同，只改变步骤4制备皂苷。具体如下：步骤4、制备皂苷
用1000ml ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解6g酶ii，制得酶ii溶解液，备用。
85.称取0.001mol三醇人参皂苷元，溶于2g酒精，然后加入47g缓冲液使其成为悬液。所述缓冲液为ph5.5、0.02m的醋酸-醋酸钠缓冲液。
86.向悬液中加入50g酶ii溶解液，并加入0.0015mol葡萄糖，在反应温度30℃条件下，边搅拌边反应48h。然后，将反应温度升高至40℃，再向反应液中加入0.0011mol葡萄糖，反应72h；再向反应液中加入0.003mol鼠李糖，继续反应72h。
87.反应结束后，将反应液加入350ml 95%（体积百分数）乙醇中，离心，上清液浓缩除去乙醇，用大孔吸附树脂纯化，洗脱后即得产品。对产品进行hplc检测, hplc色谱图如图15所示。
88.从hplc色谱图可知，产品为稀有人参皂苷re。从结构上看，re在20号碳上连接一个葡萄糖基，3号碳上连接一个葡萄糖基和一个鼠李糖基。
89.经检测，产品的纯度为72.3%，有f1、rg1等少量副产物。
90.稀有人参皂苷re的分子结构式如附图16所示。
91.本发明中所述的hplc检测的控制条件如下：检测波长203nm。流动相乙腈（a）-水（b）：0-20min，20%a，20-31min，20%-32%a，31-40min，32%-43%a，40-47min，43%-100%a。柱温35℃。
92.除特殊说明的外，本发明所述的比例均为质量比，所述的百分数均为质量百分数。
93.显然的是，在本发明的构思下，可以变化的具体实施方法还有很多，在此，应该声明，在本发明的发明构思下所做出的任何改变都将落入本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：包括制备酶i、制备酶ii、制备苷元以及制备皂苷步骤；所述酶i为水解酶；所述酶ii为合成酶。2.根据权利要求1所述的一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：所述制备苷元：采用的原料为ppd型皂苷或ppt型皂苷或上述两种皂苷的混合物。3.根据权利要求1所述的一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：所述制备苷元：将ppd型皂苷或ppt型皂苷或上述两种皂苷的混合物制备成皂苷溶解液，将皂苷溶解液与酶i混合，于40-45℃反应24-72h，制得苷元。4.根据权利要求1所述的一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：所述制备酶i：采用的培养基a配方为1%蛋白胨、0.1-1%葡萄糖、10-20mm zncl2，余量为水；采用菌种为米曲霉。5.根据权利要求4所述的一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：所述制备酶i：接种后，培养3-4d；然后向培养基a中加入的甘油、ppd皂苷，培养3-4d；再向培养基a中加入ppt皂苷，培养3-4d。6.根据权利要求1所述的一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：所述制备酶ii：采用的培养基b配方为1%蛋白胨、0.1-1%葡萄糖、10-20mm zncl2、10-20mm mgcl2、5-10mm k2hpo4，余量为水；采用菌种为米曲霉。7.根据权利要求6所述的一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：所述制备酶ii：接种完成后，20-26℃培养3-5d；向培养基b中加入无菌的葡聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖，28-35℃培养3-5d。8.根据权利要求3所述的一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：所述皂苷溶解液中皂苷的质量浓度为0.1-5%；所述酶i与皂苷的质量比为1:1-2。9.根据权利要求1所述的一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：所述制备皂苷：将苷元溶于乙醇，然后加入缓冲液形成悬液后，与酶ii混合，加入糖，反应后获得稀有人参皂苷；所述糖为葡萄糖、鼠李糖、木糖以及阿拉伯糖中的一种或多种；所述酶ii与皂苷的质量比为1:1-2。10.根据权利要求9所述的一种制备稀有人参皂苷的方法，其特征在于：所述制备皂苷：反应温度为30-45℃。

技术总结
本发明提供一种制备稀有人参皂苷的方法，包括制备酶I、制备酶II、制备苷元、制备皂苷步骤。所述酶I为水解酶；所述酶II为合成酶。所述制备苷元：采用的原料为PPD皂苷或PPT皂苷或上述两种皂苷的混合物。所述制备皂苷：将苷元溶于乙醇，然后加入缓冲液形成悬液后，与酶II混合，加入糖，反应后获得稀有人参皂苷。本发明采用任意二醇类人参皂苷或三醇类人参皂苷或二者的组合为底物，均可制备稀有人参皂苷。均可制备稀有人参皂苷。均可制备稀有人参皂苷。


技术研发人员：肖永坤 王东明 刘晓奕
受保护的技术使用者：三蚁科技（广州）有限公司
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/8/28