一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法。


背景技术：

2.灌木小甘菊（cancrinia maximowiczii）为菊科（asteraceae）小甘菊属（cancrinia）的小半灌木，具有极强的耐寒耐旱性，通常分布在戈壁、山坡或荒地，生于海拔约2100—3600米的多砾石的山坡及河岸冲积扇上，在我国主要分布于青海、甘肃、新疆等区域。
3.灌木小甘菊抗逆性极强，但一般分布于高海拔地区，较难采集，引种后由于与原产地条件相差较大，移栽后不易成活。目前尚无针对灌木小甘菊组织培养技术的相关报道，因此系统地研究适合灌木小甘菊的快速繁殖的培养基，建立高效稳定的组培扩繁体系，对于灌木小甘菊野生种质资源的保存以及进一步的开发利用等具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种灌木小甘菊叶片组培再生体系建立的方法。
5.本发明目的通过以下方案实现：一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，包括以下步骤：步骤一，外植体消毒：选择灌木小甘菊叶片作为外植体，置于流水下冲洗干净后转移至超净工作台中，依次用酒精浸泡，无菌水冲洗，再用次氯酸钠溶液震荡消毒，无菌水冲洗，最后用无菌滤纸吸干水分；步骤二，愈伤组织诱导：将步骤一处理后的叶片在无菌滤纸上用刀片切成小块并在背部划出数个伤口，之后将叶片正面向上接种到诱导培养基中培养20～25 d后得到愈伤组织；所述诱导培养基包括4.74 g/l ms培养基、6苄氨基腺嘌呤(6-ba) 1.0 mg/l、萘乙酸(naa) 0.05 mg/l、蔗糖30 g/l和琼脂7 g/l；步骤三，分化培养：将步骤二获得的愈伤组织转移至分化培养基中培养25～30d，培养出灌木小甘菊不定芽；所述分化培养基包括4.74 g/l ms培养基、6-ba 0.5 mg/l、naa 0.1 mg/l、蔗糖30 g/l和琼脂7 g/l；步骤四，生根培养：将步骤三中获得的丛生不定芽切成单株，转移至生根培养基中培养25～30 d后诱导生根，培养出灌木小甘菊无菌再生苗；所述生根培养基包括1/2ms培养基、naa 0.2 mg/l、蔗糖30 g/l、琼脂7 g/l 。
6.本发明所述组培以灌木小甘菊叶片为外植体，直接诱导愈伤分化得到完整的植株，克服了传统育苗的季节限制，可进行室内大量繁殖，解决了灌木小甘菊种苗移栽成活率低以及大量需求的问题，为生产实践及理论研究奠定了基础。
7.进一步的，步骤一中，选择灌木小甘菊顶芽下部3-8片无病虫害嫩叶作为外植体；将外植体灌木小甘菊叶片置于网袋中自来水下清洗30～40 min，之后转移至超净工作台；
采用75％乙醇溶液消毒30s；采用4％的次氯酸钠(naclo)溶液中消毒10min。
8.上述步骤二至四中培养环境中温度为（25
±
2）℃、湿度为60%~70％、光照时间为12~14h/d、光照强度为1500~2000lx。
9.所述诱导培养基、分化培养基和生根培养基的ph值均为5.8-6.0。
10.本发明所提供的一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，主要包括以下步骤：步骤一，外植体消毒：选择灌木小甘菊叶片作为外植体，放入盛有洗洁精溶液的玻璃瓶中浸泡1min，瓶口用纱布包住，置于流水下冲洗30min。然后将洗干净后的外植体移至超净工作台中，用75%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3~4次，再用4%的次氯酸钠溶液震荡消毒10分钟，无菌水冲洗3~4次，最后用无菌滤纸吸干水分；步骤二，愈伤组织诱导：将步骤一处理后的叶片放入无菌滤纸上吸干水分，用刀片切成小块并在背部划出数个伤口，之后将叶片正面向上接种到诱导培养基中培养20～25d后得到愈伤组织；所述诱导培养基包括4.74g/lms培养基、6苄氨基腺嘌呤(6-ba)1.0mg/l萘乙酸(naa)0.05mg/l、蔗糖30g/l和琼脂7g/l；步骤三，分化培养：将步骤二获得的愈伤组织转移至分化培养基中光照培养25～30d，培养出灌木小甘菊不定芽；所述分化培养基包括4.74g/lms培养基、6-ba0.5mg/l、naa0.1mg/l、蔗糖30g/l和琼脂7g/l；步骤四，生根培养：将步骤三中获得的丛生不定芽切成单株，转移至生根培养基中经光照培养25～30d后诱导生根，培养出灌木小甘菊无菌再生苗；所述生根培养基包括1/2ms培养基、naa0.3mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7g/l；本发明提供了灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，通过在不同培养阶段选用不同培养基种类和激素配比，提高灌木小甘菊叶片脱分化和再分化比例，以实现灌木小甘菊的快速繁殖，缩短其育种年限，为选育灌木小甘菊优良无性繁殖品种和遗传转化体系构建提供技术参考。
附图说明
11.图1是灌木小甘菊叶片作为外植体诱导培养形成的愈伤组织效果图；图2和图3为灌木小甘菊叶片为外植体分化培养获得不定芽的生长效果图；图4灌木小甘菊外植体诱导生根形成的效果图。
具体实施方式
12.为了更好理解本发明的技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步说明。
13.本发明所涉及的术语：6-ba为6-苄基腺嘌呤；naa为萘乙酸；ms基本培养基为4.43g/l；1/2ms培养基是在ms培养基的基础上，将其中大量元素和钙盐减少为全量的1/2；本发明实施例所用的试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
14.本实施例提供一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的构建方法包括以下操作步
骤：1、外植体选择和消毒选择灌木小甘菊顶芽下部3～8片幼嫩叶片作为外植体，将叶片置于盛有洗洁精溶液的玻璃瓶中，瓶口纱布包裹，将其在自来水下冲洗30min，随后转移至超净工作台上，依次用75％乙醇溶液消毒30 s，无菌水清洗3次，4％的naclo消毒10 min，无菌水清洗3次；2、愈伤组织的诱导将经过消毒并切好的外植体叶片置于无菌滤纸上吸干水分，用无菌解剖刀将叶片切成5 mm
×
5 mm的小块并在叶片背部划出数个伤口，接种到诱导培养基ms+（0.5-2.0）mg/l 6-ba+0.05 mg/l naa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂中，处理接种5瓶，每瓶接种6个外植体，总计处理30个外植体，然后放置于组培室光照培养，培养环境为温度（25
±
2）℃、湿度60％、光照时间14 h/d、光照强度1500～2000 lx，培养出愈伤组织。20～25d之后统计愈伤组织的诱导率及观察记录愈伤生长状态。
15.从表1可以看出，叶片接种到a2诱导培养基ms+1.0 mg/l 6-ba+0.05 mg/l naa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂中，愈伤组织的诱导率最高为85.56%，且愈伤组织质地致密，固体化，状态良好。图1为以叶片为外植体诱导培养获得愈伤组织的结果图，可以看到愈伤组织生长状态良好。
16.3、愈伤组织诱导产生不定芽分化培养主要作用是使愈伤组织再分化为芽，有利于形成完整的再生体系，将形成的愈伤组织切成数个小块后转移至分化培养基ms+（0.5-2.0）mg/l 6-ba+（0.05-0.1）mg/l naa+30 g/l蔗糖+7 g/l琼脂中，处理接种5瓶，每瓶接种6块愈伤组织，总计处理30块愈伤组织，然后置于组培室20～25 d，培养环境为温度（25
±
2）℃、湿度60％、光照时间14h/d、光照强度1500～2000 lx，培养出不定芽。
17.表2为灌木小甘菊愈伤组织分化实验结果，从中可以看出在b4分化培养基ms+0.5 mg/l 6-ba+0.1 mg/l naa+30 g/l蔗糖+7 g/l琼脂中，诱导出的不定芽生长状态最好，生长健壮，叶片生长正常，是较为适合的不定芽诱导培养基。图2和图3为不同生长时间的不定芽生长效果图，从图中可看到不定芽生长状态良好。
18.4、不定芽诱导生根，产生再生植株将形成的1～3cm高的丛生不定芽切成单株后转移至生根培养基ms+（0.1-0.3）mg/l naa+30 g/l蔗糖+7 g/l琼脂中，每处理接种5瓶，每瓶接种3个外植体，每处理总计15个外植体，之后置于组培室，培养环境设置为温度（25
±
2）℃、湿度60％、光照时间14 h/d、光照强度1500～2000 lx，诱导形成不定根。30天后统计根系生长状况和生根率。
19.灌木小甘菊生根培养实验结果如表3所示，发现在c3生根培养基ms+0.3 mg/l naa+30 g/l蔗糖+7 g/l琼脂中，灌木小甘菊生根率和平均根数均最高且根系生长健壮，生长状态良好，是最为合适的培养基。
20.灌木小甘菊试验数据如下表3所示：。

技术特征：
1.一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一，外植体消毒：选择灌木小甘菊叶片作为外植体，置于流水下冲洗干净后转移至超净工作台中，依次用酒精浸泡，无菌水冲洗，再用次氯酸钠溶液震荡消毒，无菌水冲洗，最后用无菌滤纸吸干水分；步骤二，愈伤组织诱导：将步骤一处理后的外植体叶片在无菌滤纸上用刀片切成小块并在背部划出数个伤口，之后将叶片正面向上接种到诱导培养基中培养20～25d后得到愈伤组织；其中，所述诱导培养基包括4.74g/lms培养基、6苄氨基腺嘌呤(6-ba)1.0mg/l、萘乙酸(naa)0.05mg/l、蔗糖30g/l和琼脂7g/l；步骤三，分化培养：将步骤二中获到的愈伤组织转移至分化培养基中培养25～30d，培养出灌木小甘菊不定芽；所述分化培养基包括4.74g/lms培养基、6-ba0.5mg/l、naa0.1mg/l、蔗糖30g/l和琼脂7g/l；步骤四，生根培养：将步骤三中获得的丛生不定芽切成单株，转移至生根培养基中培养25～30d后诱导生根，培养出灌木小甘菊无菌再生苗；所述生根培养基包括1/2ms培养基、naa0.2mg/l、蔗糖30g/l、琼脂7g/l。2.根据权利要求1所述的一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于：在步骤一中，选择灌木小甘菊顶芽下部3-8片无病虫害嫩叶作为外植体；将该灌木小甘菊叶片置于网袋中自来水下清洗30～40min，之后转移至超净工作台；采用75％乙醇溶液消毒30s；采用4％的次氯酸钠(naclo)溶液中消毒10min。3.根据权利要求1所述的一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于，步骤二至四中培养环境为：温度为（25
±
2）℃、湿度为60%~70％、光照时间为12~14h/d、光照强度为1500~2000lx。4.根据权利要求1至3任一所述的一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于：所述诱导培养基、分化培养基和生根培养基的ph值均为5.8-6.0。5.根据权利要求1所述的一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于：诱导培养基ms+1.0mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂。6.根据权利要求1所述的一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于：分化培养基ms+0.5mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂。7.根据权利要求1所述的一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，其特征在于：生根培养基ms+0.3mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂。

技术总结
本发明提供了一种灌木小甘菊叶片组培再生体系的建立方法，包括以下步骤：首先选择无病虫害、幼嫩的灌木小甘菊叶片为外植体，将叶片灭菌消毒后接种于诱导培养基中培养20～25 d得到愈伤组织，接着将愈伤组织转移到分化培养基中培养25～30 d，最后将诱导出的芽转移到生根培养基中生根培养25～30 d形成完整植株。通过上述方法建立的灌木小甘菊叶片组培再生体系能够高效地获得其外植体再生苗，为构建灌木小甘菊的高效遗传转化体系奠定基础，为优良品种的培育繁殖提供技术参考。品种的培育繁殖提供技术参考。


技术研发人员：崔大祥 周园园 彭家伟 崔明青
受保护的技术使用者：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司
技术研发日：2023.07.06
技术公布日：2023/8/28