一种抗炎水凝胶及其制备方法和用途

1.本发明属于生物医药领域技术领域，具体涉及一种抗炎水凝胶及其制备方法和用途。


背景技术：

2.脊髓损伤（spinal cord injury）常会导致病人截瘫，使患者长久丧失劳动力，严重影响患者生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。据报道，全世界有近2700万人患有脊髓损伤，预计每年将新增脊髓损伤患者92万人，然而目前并无修复脊髓损伤的有效方法。脊髓损伤病理机制涉及原发性损伤和继发性损伤两部分，其中炎症反应在继发性损伤中起重要作用，会导致损伤加剧。小胶质细胞（microglia）和巨噬细胞（macrophage）是参与脊髓损伤后炎症反应的重要免疫细胞，二者分泌的多种因子直接参与炎症微环境的调控。小胶质细胞是存在于神经系统中的固有免疫细胞，巨噬细胞来源于从血管内皮进入损伤部位的单核细胞，在脊髓损伤部位由于具有相同的形态学特征和表面蛋白标志物无法区分二者，通常将这群细胞称作小胶质细胞/巨噬细胞群。在损伤区域，小胶质细胞/巨噬细胞存在两个基本亚型：“经典活化”型，即m1型，分泌促炎因子，有明显的神经毒性；“替代活化”型，即m2型，分泌抗炎因子和神经营养因子，能促进脊髓功能重塑。小胶质细胞和巨噬细胞在炎症反应过程中扮演重要角色，通过调控小胶质细胞和巨噬细胞表型改善炎症微环境从而进促组织再生已成为脊髓损伤修复领域的研究热点。在继发性病理生理反应的过程中，脊髓中固有的小胶质细胞和浸润的巨噬细胞会从静止状态m0转变到促炎m1表型。m1小胶质细胞/巨噬细胞通过连续表达和释放炎症趋化因子和促炎细胞因子（例如诱导性一氧化氮合酶（inos），白细胞介素-1β（il-1β），白细胞介素-6（il-6）和肿瘤坏死因子-α（tnf-α）来诱导神经炎症，从而引发炎症级联反应，导致产生更多的炎症和延长的促炎反应，进一步加剧神经元损伤并阻碍脊髓修复。因此，抑制小胶质细胞/巨噬细胞向m1的极化或许是治疗脊髓损伤的有效策略。
3.盐酸米诺环素（mh）可以在体外和体内选择性地抑制小胶质细胞向m1极化。盐酸米诺环素属于酚类化合物和第二代半合成四环素衍生物，具有抗氧化、抗炎、神经保护活性并能穿过血脑屏障。研究表明，盐酸米诺环素可以抑制脂多糖（lps）介导的巨噬细胞产生炎性细胞因子，并抑制关键炎症相关蛋白（如inos）的表达。然而，在以往的米诺环素递送系统中，米诺环素的释放缺乏微环境响应性，这将会导致超剂量或亚治疗剂量的米诺环素释放。脊髓损伤后，由于损伤部位持续缺血缺氧，导致损伤部位的微环境为微酸性。cn103797160a公开了一种用于牙周炎的盐酸米诺环素纳米缓释凝胶，该凝胶不具有微环境响应性，其制备过程中需要使用有机溶剂且步骤繁琐。
4.文献“wang z , nong j , shultz r b ,et al.local delivery of minocycline from metal ion-assisted self-assembled complexes promotes neuroprotection and functional recovery after spinal cord injury[j]. biomaterials, 2017, 112:62-71.”记载了以氯化镁、2x hbss、琼脂糖、米洛环素构成的水
凝胶递送系统，在脊髓修复中有较好的效果。但该递送系统需要严格控制温度，操作繁琐。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种抗炎水凝胶，进一步提供了该抗炎水凝胶的制备方法和用途，通过本发明的抗炎水凝胶可以得到具有酸响应性释放米诺环素的缓释体系，而该体系能够响应脊髓损伤酸性微环境释放抗炎药物米诺环素，改善脊髓损伤处的免疫微环境，减少脊髓损伤处瘢痕组织并增加，促进神经轴突的再生和生长，进而促进运动功能恢复；另外，该抗炎水凝胶的制备操作方便、无有害副产物。
[0006]
第一方面，本发明提供一种抗炎水凝胶，该抗炎水凝胶是由四臂聚乙二醇巯基、八臂聚乙二醇马来酰亚胺和金属配位纳米粒子分别溶解或分散于pbs缓冲液中，而后混合交联而得；所述金属配位纳米粒子由修饰有巯基的双膦酸盐、盐酸米诺环素和mg
2+
金属配位组成；所述修饰有巯基的双膦酸盐的制备方法包括如下步骤：s1、制备修饰有双键的双膦酸盐：首先将氨基双膦酸盐溶于naoh溶液中，随后加入丙烯酰氯，冰浴反应后萃取、浓缩、沉淀、离心收集、干燥后即可得到修饰有双键的双膦酸盐；s2、制备修饰有巯基的双膦酸盐：将步骤s1制得的修饰有双键的双膦酸盐溶于去离子水中，加入dl-二硫苏糖醇并调整ph值至碱性，溶液在室温下搅拌过夜，通过浓缩、沉淀、离心收集、干燥后即可得到修饰有巯基的双膦酸盐。
[0007]
在抗炎水凝胶成型过程中，四臂聚乙二醇巯基上的巯基和八臂聚乙二醇马来酰亚胺上的马来酰亚胺基团通过点击化学反应（迈克尔加成反应）交联形成水凝胶；金属配位纳米粒子表面上的巯基与八臂聚乙二醇马来酰亚胺上的马来酰亚胺基团通过点击化学反应（迈克尔加成反应）形成共价键将金属纳米粒子负载到水凝胶中。
[0008]
进一步地，步骤s1中，所述氨基双膦酸盐、naoh溶液、丙烯酰氯的质量体积比为400mg～600mg∶20ml～30ml∶460μl～650μl，所述naoh溶液的质量浓度为1％～3％，所述冰浴反应的时间为1h，加入丙烯酰氯后的反应在常温条件下进行60min～120min，所述萃取采用乙酸乙酯进行萃取，所述沉淀采用甲醇进行处理。
[0009]
进一步地，步骤s2中，所述修饰有双键的双膦酸盐、去离子水、dl-二硫苏糖醇的质量体积比为200mg～300mg∶20ml～30ml∶750mg～1500mg，所述碱性ph值为7.5～9.0，调整ph值后的反应在常温条件下进行8h～15h。
[0010]
第二方面，本发明还提供一种上述的抗炎水凝胶的制备方法，包括以下具体步骤：s3、制备金属配位纳米粒子：将步骤s2制得的修饰有巯基的双膦酸盐、氯化镁、盐酸米诺环素分别溶于pbs缓冲液并混合，在室温条件下搅拌一段时间后，离心收集沉淀，将合成产物在冷冻干燥机中进行冻干，即可得到金属配位纳米粒子；在金属配位纳米离子中，镁离子会与盐酸米诺环素上的酚羟基通过金属配位结合，双膦酸盐上的双膦酸根会通过金属配位与镁离子结合。
[0011]
s4、制备水凝胶：将四臂聚乙二醇巯基、八臂聚乙二醇马来酰亚胺、步骤s3制得的金属配位纳米粒
子分别溶解或分散于pbs缓冲液中，混合均匀即可制得抗炎水凝胶。
[0012]
进一步地，步骤s3中，所述修饰有巯基的双膦酸盐、氯化镁、盐酸米诺环素的质量比为200 mg～400mg∶200 mg～400mg∶2mg～4mg，所述修饰有巯基的双膦酸盐在pbs缓冲液中的浓度为0.075mol/l～0.125mol/l，所述氯化镁在pbs缓冲液中的浓度为0.075mol/l～0.125mol/l，所述搅拌的时间为30min～60min，所述离心的转速为3500r/min～4000r/min，所述离心的时间为5min～15min。
[0013]
进一步地，步骤s4中，所述四臂聚乙二醇巯基与pbs缓冲液的质量体积比为3mg～10mg∶30μl～100μl，所述八臂聚乙二醇马来酰亚胺与pbs缓冲液的质量体积比为3mg～10mg∶30μl～100μl；所述金属配位纳米粒子与pbs缓冲液的质量体积比为2mg～10mg∶10μl～20μl。
[0014]
进一步地，所述四臂聚乙二醇巯基/pbs溶液、八臂聚乙二醇马来酰亚胺/pbs溶液、金属配位纳米粒子/pbs悬浮液的体积比为1～1 .5∶1～1 .5∶0.25～0.75。
[0015]
第三方面，本发明进一步提供一种上述的抗炎水凝胶在制备脊髓损伤抗炎药物中的用途。
[0016]
与现有技术相比，本发明的优点在于：在以往的米诺环素递送系统中，米诺环素的释放缺乏微环境响应性，这将会导致超剂量或亚治疗剂量的米诺环素释放；脊髓损伤后，由于损伤部位持续缺血缺氧，导致损伤部位的微环境为微酸性。而本技术构建了一种由抗炎药物米诺环素参与形成的金属配位纳米粒子，将该纳米粒子负载到具有神经保护功能的聚乙二醇水凝胶中，得到具有酸响应性释放米诺环素的缓释体系；该体系能够响应脊髓损伤酸性微环境释放抗炎药物米诺环素，改善脊髓损伤处的免疫微环境，减少脊髓损伤处瘢痕组织并增加，促进神经轴突的再生和生长，进而促进运动功能恢复；同时，本发明构建的米诺环素递送系统，不仅仅降低tnf-α基因表达，还能够降低il-6、il-1β等炎症相关因子的基因表达。
附图说明
[0017]
图1为本发明提供的金属配位纳米粒子的粒径和形貌结果；其中，a、mh@bp nps的粒径测量结果；b、mh@bp nps的电位测量结果；c、扫描电镜观察mh@bp nps形貌结果。
[0018]
图2为本发明提供的抗炎水凝胶的扫描电镜结果。
[0019]
图3为本发明提供的抗炎水凝胶的米诺环素释放结果；其中，a、不同水凝胶的体外释放结果；b、mh@bp gel在不同ph条件下的释放结果。
[0020]
图4为本发明提供的抗炎水凝胶的体外抗炎结果；其中，a、通过免疫荧光观察不同水凝胶浸提液处理bv2后inos的表达情况；b、通过qrt-pcr评估不同水凝胶浸提液处理bv2后m1相关基因的表达情况；c、通过western blot评估不同水凝胶浸提液处理bv2后inos的表达情况。
[0021]
图5为本发明提供的抗炎水凝胶的体内抗炎结果；其中，a、通过免疫荧光观察inos的表达情况；b、通过western blot评估inos的表达情况；c、通过western blot评估cd86的表达情况。
[0022]
图6为本发明提供的抗炎水凝胶的体内促进脊髓损伤修复情况；其中，a、sd大鼠术后运动功能评分；b、sd大鼠术后电生理检测结果；c、脊髓损伤处gfap的表达情况；d、脊髓损
伤处tuj-1的表达情况。
具体实施方式
[0023]
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1
[0024]
本实施例提供了一种抗炎水凝胶，该抗炎水凝胶是由四臂聚乙二醇巯基、八臂聚乙二醇马来酰亚胺和金属配位纳米粒子分别溶解或分散于pbs缓冲液中，而后混合交联而得；所述金属配位纳米粒子由修饰有巯基的双膦酸盐、盐酸米诺环素和mg
2+
金属配位组成。具体地，所述金属配位纳米粒子是由修饰有巯基的双膦酸盐、氯化镁和盐酸米诺环素组成，镁离子与盐酸米诺环素上的酚羟基通过金属配位结合，双膦酸盐上的双膦酸根再通过金属配位与镁离子结合制备而成。该抗炎水凝胶材料为水凝胶状态。
实施例2
[0025]
在实施例1的基础上，本实施例进一步提供一种基于其的制备方法，包括以下步骤：s1、制备修饰有双键的双膦酸盐：将氨基双膦酸盐(abp)593 mg溶于20ml2wt%naoh溶液中，冰浴0℃反应，随后分四次在45min内加完丙烯酰氯，每次162 μl。加完后从冰浴中拿出，室温反应90min。然后将乙酸乙酯与样品溶液按1:1体积混合磁力搅拌6min，萃取留水相，重复四次。最后将所留水相旋转蒸发至体积小于10 ml，加入适量甲醇后出现大量白色沉淀，使用离心机4000rpm离心10min后弃去上清，干燥后即可得到修饰有双键的双膦酸盐（bp-acrylamide）。
[0026]
s2、制备修饰有巯基的双膦酸盐：将修饰有双键的双膦酸盐(250mg，0.87 mmol)溶于去离子水(25ml，8.7 mmol)中，加入dl-二硫苏糖醇(1335mg)。待完全溶解后将上述溶液的ph值调整至8。溶液在室温下搅拌过夜，用真空旋转蒸发仪浓缩。然后用丙酮沉淀过夜，离心(4000rpm，10min)后弃去上清，干燥后即可得到修饰有巯基的双膦酸盐。
[0027]
s3、制备金属配位纳米粒子：将修饰有巯基的双膦酸盐300mg、氯化镁300mg、盐酸米诺环素300mg分别溶于pbs缓冲液制得200mm、200mm、12.15mm溶液，混合后在室温下搅拌1小时。离心(4000rpm，5分钟)收集沉淀。最后将合成产物在冷冻干燥机中进行冻干，即可得到金属配位纳米粒子，命名为mh@bp nps。图1为金属配位纳米粒子的制备示意图及其表征结果。
[0028]
s4、制备水凝胶：首先将四臂聚乙二醇巯基5 mg和八臂聚乙二醇马来酰亚胺5 mg分别溶于pbs缓冲液中，均制得12.5%溶液。然后将mh@bp纳米粒子均匀悬浮于pbs缓冲液中，制得20%悬液。最后，将以上三种溶液混合均匀即可制得抗炎水凝胶。
[0029]
第一，考察本发明所述的金属配位纳米粒子材料的粒径及形貌，具体采用实施方案s3中制得的金属配位纳米粒子，包括以下步骤：将制备的金属配位纳米粒子重悬于pbs后，通过纳米粒度仪测定了mh@bp纳米粒子的粒径和zeta电位；将mh@bp 纳米粒子重新悬浮于水中并滴在硅片上，待干燥后使用扫描电子显微镜观察mh@bp纳米粒子的微观结构。
[0030]
如，图1为本发明实施方案步骤s3中制得的金属配位纳米粒子的粒径和形貌结果。根据纳米粒度仪测试结果可知，mh@bp nps的水合粒径为307.60
±
8.80nm (图1a)，多分散指数(pdi)为0.19
±
0.02 (图1a)；mh@bp nps的zeta电位为-20.73
±
0.50mv (图1b)，mh@bp nps之所以带负电主要因为形成纳米粒子的bp具有带负电荷的磷酸盐基团；扫描电子显微镜(sem)图像显示mh@bp nps具有均匀的球形形貌，大约205.6
±
23.2nm的直径(图1c)。
[0031]
第二，考察本发明所述的抗炎水凝胶材料的形貌，具体采用实施方案s4中制得的抗炎水凝胶材料，包括以下步骤：首先将制备好的水凝胶放-80
°
c冰箱预冻置于冷冻干燥机中冻干；然后将冻干的水凝胶使用液氮脆断后暴露出断面，喷金60s后使用扫描电镜观察了冻干的形貌。
[0032]
如，图2为本发明实施方案步骤s4中制得的抗炎水凝胶扫描电镜结果。从图中可看到，冻干后的水凝胶均呈现连续的多孔结构，但只有在抗炎水凝胶的内部壁上附着有大量的颗粒状mh@bp纳米粒子。
[0033]
第三，考察本发明抗炎水凝胶材料的米诺环素释放情况，具体采用实施方案s4中制得的抗炎水凝胶材料，包括以下步骤：将水凝胶浸泡于磷酸盐缓冲溶液中并置于37
°
c恒温摇床中；在预先确定的时间点取样并检测其在244nm处的紫外吸收。
[0034]
如，图3为本发明实施方案步骤s4中制得的抗炎水凝胶的米诺环素释放结果。体外药物释放结果显示，直接将盐酸米诺环素负载到水凝胶后，其在24小时内基本释放完全；而由盐酸米诺环素制成的mh@bp nps负载到水凝胶(mh@bp gel)能够持续11天，这样的一个释放结果能够与脊髓损伤后的急性期(《48小时)和亚急性期(48小时至14天)匹配，能够很好地调控脊髓损伤后的炎症反应。此外，在酸性条件下，米诺环素的释放速度明显加快，表明该水凝胶具有酸性响应性，能够响应脊髓损伤微酸环境释放米诺环素。
[0035]
第四，考察本实施例抗炎水凝胶材料的体外抗炎情况，具体采用实施方案s4中制得的抗炎水凝胶材料，包括以下步骤：使用bv2细胞来评价水凝胶材料的抗炎能力。将bv2细胞接种于孔板中；过夜后，在lps存在条件下使用水凝胶浸提液处理细胞。24小时后，通过免疫荧光、western blot、qrt-pcr来评价水凝胶的抗炎能力。
[0036]
如，图4为本发明实施方案步骤s4中制得的抗炎水凝胶的体外抗炎结果。根据免疫荧光、rt-qpcr以及western blot结果显示mh@bp gel能够显著降低小胶质细胞m1型相关基因和蛋白的表达，抑制小胶质细胞向m1型极化。
[0037]
第五，考察本发明抗炎水凝胶材料的体内抗炎情况，具体采用实施方案s4中制得的抗炎水凝胶材料，包括以下步骤：sd大鼠麻醉后剃去背部鼠毛并用75%乙醇消毒。切开大鼠背部中线皮肤和皮下肌肉，显露t8-t10椎体。然后，在t9处行椎板切除术并暴露脊髓。使用3mm宽的镊子夹伤t9节段
的脊髓并持续10秒，损伤部位用明胶海绵止血。水凝胶组老鼠在其损伤部位施加50μl水凝胶，对照组的损伤部位不做任何处理。最后将肌肉和皮肤依次缝合。将sd大鼠随机分为对照组、纯水凝胶组、水凝胶负载裸药组、水凝胶负载纳米粒子组。每组6只。对照组脊髓夹伤后不进行任何处理，其余组根据分组特点使用不同水凝胶材料。3天后取材检测体内抗炎情况。
[0038]
如，图5为本发明实施方案步骤s4中制得的抗炎水凝胶的体内抗炎结果。同时，还利用大鼠脊髓夹伤模型研究了水凝胶的体内抗炎情况。根据免疫荧光和western blot结果显示mh@bp gel能够显著降低m1型蛋白inos和cd86的表达，表明mh@bp gel在体内能够抑制小胶质细胞/巨噬细胞向m1型极化。
实施例3
[0039]
在实施例1的基础上，本实施例进一步提供一种基于其的制备方法，包括以下步骤：s1、制备修饰有双键的双膦酸盐：将氨基双膦酸盐(abp)400 mg溶于30ml 1wt%naoh溶液中，冰浴0℃反应，随后分四次在45min内加完丙烯酰氯，每次132 μl。加完后从冰浴中拿出，室温反应90min。然后将乙酸乙酯与样品溶液按1:1体积混合磁力搅拌6min，萃取留水相，重复四次。最后将所留水相旋转蒸发至体积小于10 ml，加入适量甲醇后出现大量白色沉淀，使用离心机4000rpm离心10min后弃去上清，干燥后即可得到修饰有双键的双膦酸盐（bp-acrylamide）。
[0040]
s2、制备修饰有巯基的双膦酸盐：将修饰有双键的双膦酸盐(200mg，0.704 mmol)溶于去离子水(20ml，7.04 mmol)中，加入dl-二硫苏糖醇(750 mg)。待完全溶解后将上述溶液的ph值调整至8。溶液在室温下搅拌过夜，用真空旋转蒸发仪浓缩。然后用丙酮沉淀过夜，离心(4000rpm，10min)后弃去上清，干燥后即可得到修饰有巯基的双膦酸盐。
[0041]
s3、制备金属配位纳米粒子：将修饰有巯基的双膦酸盐200mg、氯化镁200mg、盐酸米诺环素2mg分别溶于pbs缓冲液制得200mm、200mm、12.15mm溶液，混合后在室温下搅拌1小时。离心(4000rpm，5分钟)收集沉淀。最后将合成产物在冷冻干燥机中进行冻干，即可得到金属配位mh@bp纳米粒子。
[0042]
s4、制备水凝胶：首先将四臂聚乙二醇巯基3mg和八臂聚乙二醇马来酰亚胺3mg分别溶于pbs缓冲液中，均制得12.5%溶液。然后将mh@bp纳米粒子均匀悬浮于pbs缓冲液中，制得20%悬液。最后，将以上三种溶液混合均匀即可制得抗炎水凝胶。
实施例4
[0043]
在实施例1的基础上，本实施例进一步提供一种基于其的制备方法，包括以下步骤：：s1、制备修饰有双键的双膦酸盐：将氨基双膦酸盐(abp)593 mg溶于20ml2wt%naoh溶液中，冰浴0℃反应，随后分四次在45min内加完丙烯酰氯，每次162 μl。加完后从冰浴中拿出，室温反应90min。然后将乙
酸乙酯与样品溶液按1:1体积混合磁力搅拌6min，萃取留水相，重复四次。最后将所留水相旋转蒸发至体积小于10 ml，加入适量甲醇后出现大量白色沉淀，使用离心机4000rpm离心10min后弃去上清，干燥后即可得到修饰有双键的双膦酸盐（bp-acrylamide）。
[0044]
s2、制备修饰有巯基的双膦酸盐：将修饰有双键的双膦酸盐(300 mg，1.044 mmol)溶于去离子水(30 ml，10.44 mmol)中，加入dl-二硫苏糖醇(1500 mg)。待完全溶解后将上述溶液的ph值调整至8。溶液在室温下搅拌过夜，用真空旋转蒸发仪浓缩。然后用丙酮沉淀过夜，离心(4000rpm，10min)后弃去上清，干燥后即可得到修饰有巯基的双膦酸盐。
[0045]
s3、制备金属配位纳米粒子：将修饰有巯基的双膦酸盐400 mg、氯化镁400 mg、盐酸米诺环素400 mg分别溶于pbs缓冲液制得200mm、200mm、12.15mm溶液，混合后在室温下搅拌1小时。离心(4000rpm，5分钟)收集沉淀。最后将合成产物在冷冻干燥机中进行冻干，即可得到金属配位纳米粒子，命名为mh@bp nps。图1为金属配位纳米粒子的制备示意图及其表征结果。
[0046]
s4、制备水凝胶：首先将四臂聚乙二醇巯基10 mg和八臂聚乙二醇马来酰亚胺10 mg分别溶于pbs缓冲液中，均制得12.5%溶液。然后将mh@bp纳米粒子均匀悬浮于pbs缓冲液中，制得20%悬液。最后，将以上三种溶液混合均匀即可制得抗炎水凝胶。
[0047]
需要说明的是，实施例3和实施例4所制得的水凝胶，其物相和性能与实施例2相似或相同。
实施例5
[0048]
本实施例进一步提供一种实施例1所述的抗炎水凝胶的用途：该抗炎水凝胶在脊髓损伤抗炎药物中的应用。
[0049]
考察本发明抗炎水凝胶材料的体内促进脊髓损伤修复情况，具体采用实施方案s4中制得的抗炎水凝胶材料，包括以下步骤：sd大鼠麻醉后剃去背部鼠毛并用75%乙醇消毒。切开大鼠背部中线皮肤和皮下肌肉，显露t8-t10椎体；然后，在t9处行椎板切除术并暴露脊髓，使用3mm宽的镊子夹伤t9节段的脊髓并持续10秒，损伤部位用明胶海绵止血；水凝胶组老鼠在其损伤部位施加50μl水凝胶，对照组的损伤部位不做任何处理；最后将肌肉和皮肤依次缝合。将sd大鼠随机分为对照组、纯水凝胶组、水凝胶负载裸药组、水凝胶负载纳米粒子组。每组6只；对照组脊髓夹伤后不进行任何处理，其余组根据分组特点使用不同水凝胶材料。6周后取材检测脊髓修复及运动功能恢复情况。
[0050]
如，图6为本发明实施方案步骤s4中制得的抗炎水凝胶应用于体内促进脊髓损伤修复情况示意图。手术后，对大鼠下肢运动功能恢复情况进行评分，结果显示mh@bp gel组的大鼠在各个时间点的运动功能恢复情况较好，表明mh@bp gel能显著促进脊髓损伤大鼠的运动功能恢复；手术6周后，使用电生理仪检测sd大鼠的运动诱发电位，得到与运动功能评分一致的结果，显示出mh@bp gel能显著促进脊髓损伤修复，使得损伤后的脊髓建立更好的信号传导。
[0051]
进一步本发明研究了胶质纤维酸性蛋白和硫酸软骨素在水凝胶治疗后的分布及
形成情况。结果显示mh@bp gel能够显著降低胶质纤维酸性蛋白和硫酸软骨素在脊髓损伤处的表达，表明mh@bp gel能够减少脊髓损伤后瘢痕组织的产生。脊髓损伤后功能恢复往往是由神经元再生引起的，上述结果证明mh@bp gel能改善脊髓损伤大鼠的运动功能。因此本发明还研究了mh@bp gel治疗后体内神经元细胞再生情况，免疫荧光结果显示mh@bp gel能够显著增加成熟神经元的保留和促进新生神经元的产生，表明mh@bp gel能够促进神经元的再生。
[0052]
综上，本发明提供了一种抗炎水凝胶及其制备方法和用途，通过本发明的抗炎水凝胶可以得到具有酸响应性释放米诺环素的缓释体系，而该体系能够响应脊髓损伤酸性微环境释放抗炎药物米诺环素，改善脊髓损伤处的免疫微环境，减少脊髓损伤处瘢痕组织并增加，促进神经轴突的再生和生长，进而促进运动功能恢复；另外，该抗炎水凝胶的制备操作方便、无有害副产物。
[0053]
在现有技术中，在以往的米诺环素递送系统中，米诺环素的释放缺乏微环境响应性，这将会导致超剂量或亚治疗剂量的米诺环素释放；脊髓损伤后，由于损伤部位持续缺血缺氧，导致损伤部位的微环境为微酸性。而本技术将纳米粒子负载到具有神经保护功能的聚乙二醇水凝胶中，得到具有酸响应性释放米诺环素的缓释体系；该体系能够响应脊髓损伤酸性微环境释放抗炎药物米诺环素，改善脊髓损伤处的免疫微环境，减少脊髓损伤处瘢痕组织并增加，促进神经轴突的再生和生长，进而促进运动功能恢复；同时，本发明提供的抗炎水凝胶构建的米诺环素递送系统，不仅仅降低tnf-α基因表达，还能够降低il-6、il-1β等炎症相关因子的基因表达，使得该抗炎水凝胶在脊髓损伤抗炎药物方面具有良好的应用前景。
[0054]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

技术特征：
1.一种抗炎水凝胶，其特征在于，该抗炎水凝胶是由四臂聚乙二醇巯基、八臂聚乙二醇马来酰亚胺和金属配位纳米粒子分别溶解或分散于pbs缓冲液中，而后混合交联而得；所述金属配位纳米粒子由修饰有巯基的双膦酸盐、盐酸米诺环素和mg
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金属配位组成；其中，所述修饰有巯基的双膦酸盐的制备方法包括如下步骤：s1、制备修饰有双键的双膦酸盐：首先将氨基双膦酸盐溶于naoh溶液中，随后加入丙烯酰氯，冰浴反应后萃取、浓缩、沉淀、离心收集、干燥后即可得到修饰有双键的双膦酸盐；s2、制备修饰有巯基的双膦酸盐：将步骤s1制得的修饰有双键的双膦酸盐溶于去离子水中，加入dl-二硫苏糖醇并调整ph值至碱性，溶液在室温下搅拌过夜，通过浓缩、沉淀、离心收集、干燥后即可得到修饰有巯基的双膦酸盐。2.根据权利要求1所述的抗炎水凝胶，其特征在于，步骤s1中，所述氨基双膦酸盐、naoh溶液、丙烯酰氯的质量体积比为400mg～600mg∶20ml～30ml∶460μl～650μl，所述naoh溶液的质量浓度为1％～3％，所述冰浴反应的时间为1h，加入丙烯酰氯后的反应在常温条件下进行60min～120min，所述萃取采用乙酸乙酯进行萃取，所述沉淀采用甲醇进行处理。3.根据权利要求2所述的抗炎水凝胶，其特征在于，步骤s2中，所述修饰有双键的双膦酸盐、去离子水、dl-二硫苏糖醇的质量体积比为200mg～300mg∶20ml～30ml∶750mg～1500mg，所述碱性ph值为7.5～9.0，调整ph值后的反应在常温条件下进行8h～15h。4.一种如权利要求1-3任一项所述的抗炎水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：s3、制备金属配位纳米粒子：将步骤s2制得的修饰有巯基的双膦酸盐、氯化镁、盐酸米诺环素分别溶于pbs缓冲液并混合，在室温条件下搅拌一段时间后，离心收集沉淀，将合成产物在冷冻干燥机中进行冻干，即可得到金属配位纳米粒子；s4、制备水凝胶：将四臂聚乙二醇巯基、八臂聚乙二醇马来酰亚胺、步骤s3制得的金属配位纳米粒子溶解或分散于pbs缓冲液时，混合均匀即可制得抗炎水凝胶。5.根据权利要求4所述的抗炎水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s3中，所述修饰有巯基的双膦酸盐溶液、氯化镁溶液、盐酸米诺环素的的质量比为200mg～400mg∶200mg～400mg∶2mg～4mg ，所述巯基的双膦酸盐溶液的浓度为0.075mol/l～0.125mol/l，所述氯化镁溶液的浓度为0.075mol/l～0.125mol/l，所述搅拌的时间为30min～60min，所述离心的转速为3500r/min～4000r/min，所述离心的时间为5min～15min。6.根据权利要求5所述的抗炎水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s4中，所述四臂聚乙二醇巯基与pbs缓冲液的质量体积比为3mg～10mg∶30μl～100μl，所述八臂聚乙二醇马来酰亚胺与pbs缓冲液的质量体积比为3mg～10mg∶30μl～100μl；所述金属配位纳米粒子与pbs缓冲液的质量体积比为2mg～10mg∶10μl～20μl。7.根据权利要求6所述的抗炎水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤s4中，所述四臂聚乙二醇巯基/pbs溶液、八臂聚乙二醇马来酰亚胺/pbs溶液、金属配位纳米粒子/pbs悬浮液的体积比为1～1.5∶1～1.5∶0.25～0.75。
8.权利要求1-3任一项所述的抗炎水凝胶在制备脊髓损伤抗炎药物中的用途。

技术总结
本发明公开了一种抗炎水凝胶及其制备方法和用途；该抗炎水凝胶是由四臂聚乙二醇巯基、八臂聚乙二醇马来酰亚胺和金属配位纳米粒子在PBS缓冲液中交联而得；所述金属配位纳米粒子由修饰有巯基的双膦酸盐、盐酸米诺环素和Mg


技术研发人员：李亚 刘佳铭 施李杨 戴建武 张璨 吴直彦
受保护的技术使用者：湖南大学
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/8/28