一种适应无血清全悬浮培养的F81细胞株及其构建方法、应用与流程

一种适应无血清全悬浮培养的f81细胞株及其构建方法、应用
技术领域
1.本发明涉及兽医生物学技术领域，具体涉及一种适应无血清全悬浮培养的f81细胞株及其构建方法、应用。


背景技术：

2.悬浮培养工艺已经广泛应用于生物制药领域，而且已经在生物制药领域展现出了明显的优势。与转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术的最大优势在于：第一、单位面积内有效工作细胞数量增加；第二、全封闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动力强度的同时减少人为操作因素影响；第三、生物反应器容积的扩大，提升了终端产品的均一性，结合后期纯化工艺，不但产品产量明显提高，产品的质量也获得提高；第四、生产疫苗所用的劳动力和车间、水、电、原材料、能源等成本远低于传统转瓶培养工艺，综合成本大大降低。
3.全悬浮培养工艺是一种载体的细胞培养工艺。利用悬浮培养驯化的方法将f81贴壁细胞驯化为无血清全悬浮培养的f81细胞，并通过筛选获得高病毒产量的悬浮细胞株，应用于兽用fcv、fhv、fpv的无血清全悬浮生产，实现抗原生产工艺和质量的提升，生产成本的降低。该方法是当前国际上生物制品生产的主流模式，最大优势是通过精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。随着我国畜牧产业集约化程度提高和养殖规模的扩大，兼具低成本、高质量的疫苗必然顺应时代的需求，利用细胞悬浮培养技术进行疫苗生产是我国兽用生物制品行业发展的必然趋势。现有技术中已有部分适应无血清全悬浮培养的f81细胞出现，但现有的f81细胞仅适用于某一种病毒的培养，应用局限性较大，而且培养效果一般。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中的问题，本发明专利设计了一种适应无血清全悬浮培养的f81细胞株及其构建方法，该f81细胞株可以满足fcv、fhv、fpv三种疫苗病毒的培养要求，培养产率高。
5.本发明公开了一种适应无血清全悬浮培养的f81细胞株，所述f81细胞株名称为猫肾细胞f81-04株，建议分类命名为猫肾细胞，于2023年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.45452。
6.进一步的，本发明还公开了一种获得如上所述的适应无血清全悬浮培养的f81细胞株的构建方法，所述构建方法步骤为：
7.(1)制备用贴壁细胞的传代与培养：
8.将复苏后的f81细胞置于含8％胎牛血清的mem-nea培养液中进行培养，待f81细胞长满单层时，加入适量0.25％胰蛋白酶-edta 37℃消化3～5min，当细胞呈细沙状流下时,加入含8％fbs mem-nea细胞培养液终止，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，按照1：3的比例分到培养瓶中进行传代培养，培养2～3代；
9.(2)驯化贴壁细胞适应低血清悬浮培养基：
10.取长满单层的f81贴壁细胞，用适量0.25％胰蛋白酶-edta 37℃消化3～5min，待细胞圆缩开始脱落时，加入含8％fbs mem-nea细胞培养液终止，并吹散细胞，将消化好的细胞转移到无菌离心管中，800r/min离心5min，弃上清；
11.用含1％fbs的f806悬浮培养基重悬细胞，混匀，计数，制备细胞悬液，将细胞转移到摇瓶中，于37℃、5％co2细胞培养箱内的摇床上培养，摇床转速设为140r/min，观察并计数，连续传代2～3代；
12.(3)驯化细胞适应无血清悬浮培养环境：
13.将适应低血清培养的f81细胞接种于无血清的f806培养基中，放于温度为37℃，5％co2的培养箱中以140r/min的转速培养，每三天传一代，直至细胞生长和状态稳定，即得到无血清全悬浮培养的f81细胞；
14.(4)单克隆细胞株筛选：
15.取100μl的1
×
106cells/ml的适应无血清悬浮培养的f81细胞悬液，加入200ml细胞生长液，充分混匀后铺至10块96孔板中，每孔200μl，将96孔板置于温度为37
±
0.5℃的二氧化碳培养箱中培养6d后，显微镜下观察，筛选出仅有唯一一个单群落的细胞孔；将筛选出的f81细胞株分别进行扩增，选取生长状况较佳的细胞株接种fcv、fhv和fpv病毒，筛选出产对3种病毒均有高产能力的一株细胞株，并命名为猫肾细胞f81-04株。
16.进一步的，本发明还公开了一种如上所述的适应无血清全悬浮培养的f81细胞株在培养疫苗病毒中的应用。所述疫苗病毒包括fcv、fhv、fpv。
17.进一步的，所述步骤(4)中筛选出的f81细胞株的扩增方法为：将筛选出的单克隆f81细胞株对应的96孔板中的细胞培养液吸出、弃掉；用pbs洗2次，确保没有残存原培养基及血清；取edta-tryspin分散滴加至96孔板中筛选出的单克隆f81细胞株中，加完轻轻晃动，让每一个位置的细胞都可以与edta-tryspin充分接触，将容器放入5％的co2培养箱中消化5～10min；显微镜下观察细胞从静止纺锤形变为动态圆形即为消化完毕，消化的同时将所需扩增的24孔板内放入新鲜的细胞培养液，后将24孔板放入5％的co2培养箱中预热，吸取一定量的24孔板中细胞培养液，移至消化的细胞中吹吸混悬，吹散细胞，再将细胞悬液吸取移回至24孔板中，反复2次，确保细胞完全转移干净，将转移完的24孔板放至显微镜下观察是否有细胞，此时细胞为动态、圆形，观察确定转移成功后将24孔板放入培养箱中静置培养；待24孔板中细胞长满后，按照上述方法将细胞移至6孔板中，待6孔板中细胞长满后，按照上述方法移至t25中，待t25中细胞长满后，按照上述方法将细胞移至t75中，待t75中细胞长满后，将细胞移至细胞摇瓶中进行悬浮培养驯化；细胞状态饱满圆润，清晰透明，1
×
106cells/ml接种，3天后长到4-6
×
106cells/ml，倍增时间约30h。
18.本发明公开的上述的适应无血清全悬浮培养的f81细胞株能够应用在培养疫苗病毒中，培养效果好、产毒能力高，所述疫苗病毒包括fcv、fhv和fpv。
19.进一步的，本发明还公开了一种如上所述的适应无血清全悬浮培养的f81细胞株用于fcv、fhv和fpv疫苗病毒的培养方法，所述培养方法为：用病毒培养液分别将毒种接种到生产用种子贴壁细胞单层中进行培养，至细胞80％发生病变时分别收获毒液；将此毒液作为种毒，收获的毒液作为种毒液f1代；取适应无血清全悬浮培养的f81-04细胞置于f806培养液培养液中，于37℃、含5％的co2培养箱中的摇床上培养72h，摇床转速设为140r/min，
待f81-04细胞株的活率》95％，细胞生长稳定，活细胞数达到4
×
106cells/ml后，分别按fcv、fpv 0.1％(v/v)、fhv 1％(v/v)的比例接入种毒液f1代，吸附1小时后，加入f806培养基作为维持液；然后置于37℃、含5％的co2培养箱中培养，培养转速为140r/min。
20.相对于现有技术，本发明专利设计的一种适应无血清全悬浮培养的f81细胞株的进步之处在于：本发明提供了无血清悬浮驯化f81贴壁细胞成为全悬浮f81细胞的方法，并提供了利用驯化后全悬浮无血清培养的f81细胞生产疫苗病毒的方法。而且本发明所公开的全悬浮无血清培养的f81细胞可以满足fcv、fhv、fpv三种疫苗病毒的培养，而且培养效果较传统细胞培养方式均有显著的提高，应用范围更加的广泛。因此，本发明提供无血清悬浮培养f81细胞用于疫苗病毒的培养可以显著降低生产成本，并且能够快速稳定的扩大生产规模，质量易于实现均衡稳定。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，所描述的实施例仅仅是本发明创造一部分的实施例，而不是全部。基于本发明创造中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明创造保护的范围。
22.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
23.实施例1
24.在f81细胞低血清悬浮驯化过程中，所采用的mem-nea培养基和f806悬浮培养基均购自壹生科(浙江)有限公司，胰蛋白酶购自gibco公司。
25.将冻存的f81细胞复苏后，置于有血清培养液中培养，并采用逐步降低血清含量的驯化方法驯化f81细胞。具体包括如下步骤：
26.步骤1，细胞复苏：
27.从液氮罐中取出冻存的f81贴壁细胞，在37℃水浴中快速摇动使其迅速融化，以800r/min离心5min，弃上清，用适量含8％胎牛血清的mem-nea细胞培养液重悬，移入细胞瓶中，于37℃、5％co2培养箱中培养至长满单层。
28.步骤2，制备用贴壁细胞的传代与培养：
29.将复苏后的f81细胞置于含8％胎牛血清的mem-nea培养液中进行培养，待f81细胞长满单层时，加入适量0.25％胰蛋白酶-edta 37℃消化3～5min，当细胞呈细沙状流下时,加入含8％fbs mem-nea细胞培养液终止，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，按照1：3的比例分到培养瓶中进行传代培养，培养2～3代。
30.步骤3，驯化贴壁细胞适应低血清悬浮培养基：
31.取长满单层的f81贴壁细胞，用适量0.25％胰蛋白酶-edta 37℃消化3～5min，待细胞圆缩开始脱落时，加入含8％fbs mem-nea细胞培养液终止，并吹散细胞，将消化好的细胞转移到无菌离心管中，800r/min离心5min，弃上清。
32.用含1％fbs的f806悬浮培养基重悬细胞，混匀，计数，制备细胞悬液，将细胞转移到摇瓶中，于37℃、5％co2细胞培养箱内的摇床上培养，摇床转速设为140r/min，观察并计数，连续传代2～3代，待细胞密度大于2
×
106cells/ml，活率》95％，细胞生长稳定，认为f81细胞已适应低血清培养基培养。将已适应低血清悬浮培养的f81悬浮细胞，于无血清的f806
培养基中连续传多代，获得适应无血清悬浮培养的f81悬浮细胞。
33.步骤4，将f81细胞株连续传代5代，冻存部分细胞，按照现行版《中国兽药典》进行生物学特性检验。
34.步骤5，单克隆细胞株筛选：
35.摇瓶中取样200μl，使用细胞计数仪计数，以稀释方法取100个细胞/96孔板，例如：计数结果为1
×
106cells/ml，取100μl细胞悬液，即1
×
105cells/100μl，稀释到10ml的贴壁培养基当中，此时细胞密度为1
×
104cells/ml，取100μl细胞悬液即为1000个细胞。将待用的96孔板标序，以防筛选时单克隆名称重复，同时标记所铺细胞名称、铺板培养条件、操作人姓名、操作时间等信息。计算后，吸取细胞悬液，加入200ml细胞生长液，充分混匀后铺至10块96孔板中，每孔200μl，将96孔板置于温度为37
±
0.5℃的二氧化碳培养箱中培养6d后，显微镜下观察，筛选出仅有唯一一个单群落的细胞孔，在孔板对应孔上加以标记，标记好所有的孔后将孔板放回至培养箱中继续静置培养至第10天后进行细胞扩增操作。最终筛选出15株单克隆细胞株(f81-01、f81-02、f81-03、f81-04、f81-05、f81-06、f81-07、f81-08、f81-09、f81-10、f81-11、f81-12、f81-13、f81-14、f81-15)。
36.将筛选出的15株f81细胞株对应的96孔板中的细胞培养液吸出、弃掉，用pbs反复吹吸清洗孔板后弃去，pbs洗2次，确保没有残存原培养基及血清；取edta-tryspin分散滴加至孔板中，加完轻轻晃动容器，让每一个位置的细胞都可以与edta-tryspin充分接触，将容器放入5％的co2培养箱中消化10min。将容器至于显微镜下观察细胞从静止纺锤形变为动态圆形即为消化完毕，消化的同时将所需扩增的24孔板内放入新鲜的细胞培养液，后将24孔板放入5％的co2培养箱中预热，消化完毕后将96孔板与24孔板同时移至生物安全柜中，按细胞名称对应，吸取一定量的24孔板中细胞培养液，移至消化的细胞中吹吸混悬，吹散细胞，再将细胞悬液吸取移回至24孔板中，反复2次，确保细胞完全转移干净，将转移完的24孔板放至显微镜下观察是否有细胞，此时细胞为动态、圆形，观察确定转移成功后将24孔板放入培养箱中静置培养。待24孔板中细胞长满后，按照上述方法将细胞移至6孔板中，待6孔板中细胞长满后，按照上述方法移至t25中，待t25中细胞长满后，按照上述方法将细胞移至t75中，待t75中细胞长满后，将细胞移至细胞摇瓶中进行悬浮培养驯化。细胞状态饱满圆润，清晰透明，1
×
106cells/ml接种，3天后长到6
×
106cells/ml，倍增时间约30h。15株f81细胞株在细胞胞摇瓶中连续5代的生长数据如表1所示，
37.表1
38.[0039][0040]
依据15株f81细胞株的生长情况，选取生长状况较佳的三株细胞f81-04、f81-02、f81-06细胞株，分别向3株细胞的第五代细胞培养液中接种fcv、fhv和fpv种毒，细胞密度控制在4.0
×
106cells/ml，并对各株细胞的产毒能力进行检测，三株细胞的病毒接种量及产毒结果如表2所示，
[0041]
表2：细胞第五代时接毒数据
[0042][0043]
另外将三株细胞扩大传代培养至第六代分别接种fcv、fhv和fpv病毒进行二次验证，细胞接种密度控制在4.0
×
106cells/ml，三种病毒的病毒接种量及收获情况如表3所示，
[0044]
表3：细胞第六代时接毒数据
[0045]
[0046][0047]
经对比，选取f81-o4株作为最终所需的细胞株，并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。
[0048]
实施例2
[0049]
fcv、fhv、fpv在无血清培养系统中的增殖培养方法所采用的试剂
[0050]
1.病毒：fcv、fhv、fpv由北京鼎持生物技术有限公司鉴定、保管和供应，也可采购市售种毒。
[0051]
2.细胞：全悬浮f81-04细胞株。
[0052]
3.培养基：名称为培养基f806无血清悬浮培养基和mem-nea培养基，由壹生科(浙江)有限公司供应。
[0053]
具体包括如下步骤：
[0054]
步骤1，fcv、fhv、fpv贴壁细胞毒种的繁殖：
[0055]
用病毒培养液将fcv、fhv、fpv毒种按一定的比例接种到生产用种子贴壁细胞单层中进行培养，至细胞80％发生病变时收获毒液；将此毒液作为种毒，收获的毒液作为fcv、fhv、fpv种毒液f1代。
[0056]
步骤2，fcv、fhv、fpv的悬浮培养：
[0057]
将实施例1所述的驯化方法培养得到的猫肾细胞f81-04株细胞置于f806培养液中，于37℃、含5％的co2培养箱中的摇床上培养72h，摇床转速设为140r/min。待f81细胞活率》95％，细胞生长稳定，活细胞数达到4
×
106cells/ml后，分别按0.1％、1％、0.1％(v/v)的比例接入fcv、fhv、fpv病毒液f1代，吸附1小时后，加入f806培养基作为维持液；然后置于37℃体积百分数为5％的co2培养箱中培养，培养转速为140r/min，分别在培养后48h，72h和96h取样进行细胞计数，并留样冻融2-3次后进行tcid
50
检测，检测数据如表4所示：f81-04细胞株生产3种毒不同时间点计数数据。
[0058][0059]
表中所记载的原工艺效价，是采用市售的fcv、fhv、fpv三种病毒分别用原始f81细胞株培养后的收毒检测结果，通过检测数据可以看出，本发明所公开的f81-04细胞培养获得的三种病毒较现有的f81细胞培养获得的病毒的测毒结果均有明显的提升。本发明实施例公开的f81-04细胞可作为fcv、fhv、fpv三种病毒的靶细胞，丰富了fcv、fhv、fpv的培养生产方式，采用无血清的培养基即可实现fcv、fhv、fpv在f81-04细胞中的全悬浮培养，大大提
高了病毒培养规模和效率，三种病毒效价均比原工艺提高1-2个滴度，同时也降低了生产成本，符合现代疫苗工业生产的需求。基于上述优点，本发明公开的f81-04细胞可以用于培养制备fcv、fhv、fpv全病毒并按照适当方法制备疫苗。
[0060]
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。

技术特征：
1.一种适应无血清全悬浮培养的f81细胞株，其特征在于，所述f81细胞株名称为猫肾细胞f81-04株，建议分类命名为猫肾细胞，于2023年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.45452。2.一种如权利要求1所述的适应无血清全悬浮培养的f81细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法步骤为：(1)制备用贴壁细胞的传代与培养：将复苏后的f81细胞置于含8％胎牛血清的mem-nea培养液中进行培养，待f81细胞长满单层时，加入适量0.25％胰蛋白酶-edta37℃消化3～5min，当细胞呈细沙状流下时,加入含8％fbsmem-nea细胞培养液终止，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，按照1：3的比例分到培养瓶中进行传代培养，培养2～3代；(2)驯化贴壁细胞适应低血清悬浮培养基：取长满单层的f81贴壁细胞，用适量0.25％胰蛋白酶-edta37℃消化3～5min，待细胞圆缩开始脱落时，加入含8％fbsmem-nea细胞培养液终止，并吹散细胞，将消化好的细胞转移到无菌离心管中，800r/min离心5min，弃上清；用含1％fbs的f806悬浮培养基重悬细胞，混匀，计数，制备细胞悬液，将细胞转移到摇瓶中，于37℃、5％co2细胞培养箱内的摇床上培养，摇床转速设为140r/min，观察并计数，连续传代3代；(3)驯化细胞适应无血清悬浮培养环境：将适应低血清培养的f81细胞接种于无血清的f806培养基中，放于温度为37℃、5％co2的培养箱中以140r/min的转速培养，每三天传一代，直至细胞生长和状态稳定，即得到无血清全悬浮培养的f81细胞；(4)单克隆细胞株筛选：取100μl的1
×
106cells/ml的适应无血清悬浮培养的f81细胞悬液，加入200ml细胞生长液，充分混匀后铺至10块96孔板中，每孔200μl，将96孔板置于温度为37
±
0.5℃的二氧化碳培养箱中培养6d后，显微镜下观察，筛选出仅有唯一一个单群落的细胞孔；将筛选出的f81细胞株分别进行扩增，选取生长状况较佳的细胞株接种fcv、fhv和fpv病毒，筛选出产对3种病毒均有高产能力的一株细胞株，并命名为猫肾细胞f81-04株。3.根据权利要求2所述的适应无血清全悬浮培养的f81细胞株的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中筛选出的f81细胞株的扩增方法为：将筛选出的单克隆f81细胞株的96孔板中的细胞培养液吸出、弃掉；用pbs洗2次，确保没有残存原培养基及血清；取edta-tryspin分散滴加至96孔板中，加完轻轻晃动，让每一个位置的细胞都可以与edta-tryspin充分接触，将容器放入5％的co2培养箱中消化5～10min；显微镜下观察细胞从静止纺锤形变为动态圆形即为消化完毕，消化的同时将所需扩增的24孔板内放入新鲜的细胞培养液，后将24孔板放入5％的co2培养箱中预热，吸取一定量的24孔板中细胞培养液，移至消化的细胞中吹吸混悬，吹散细胞，再将细胞悬液吸取移回至24孔板中，反复2次，确保细胞完全转移干净，将转移完的24孔板放至显微镜下观察是否有细胞，此时细胞为动态、圆形，观察确定转移成功后将24孔板放入培养箱中静置培养；待24孔板中细胞长满后，按照上述方法将细胞移至6孔板中，待6孔板中细胞长满后，按照上述方法移至t25中，待t25中细胞长满后，按照上述方法将细胞移至t75中，待t75中细胞长满后，将细胞移至细胞摇瓶中进行悬浮培
养驯化；细胞状态饱满圆润，清晰透明，1
×
106cells/ml接种，3天后长到4～6
×
106cells/ml，倍增时间约30h。4.一种如权利要求1所述的适应无血清全悬浮培养的f81细胞株在培养疫苗病毒中的应用。5.根据权利要求4所述的一种适应无血清全悬浮培养的f81细胞株在培养疫苗病毒中的应用，其特征在于，所述疫苗病毒包括fcv、fhv和fpv。6.一种如权利要求1所述的适应无血清全悬浮培养的f81细胞株用于fcv、fhv、fpv疫苗病毒的培养方法，其特征在于，所述培养方法为：用病毒培养液分别将3种病毒的毒种接种到生产用种子贴壁细胞单层中进行培养，至细胞80％发生病变时分别收获毒液；将此毒液作为种毒，收获的毒液作为种毒液f1代；取适应无血清全悬浮培养的f81-04细胞置于f806培养液培养液中，于37℃、含5％的co2培养箱中的摇床上培养72h，摇床转速设为140r/min，待f81-04细胞株的活率>95％，细胞生长稳定，活细胞数达到4
×
106cells/ml后，按0.1～1％的比例接入种毒液f1代，吸附1小时后，加入f806培养基作为维持液；然后置于37℃、含5％的co2培养箱中培养，培养转速为140r/min。

技术总结
本发明涉及一种适应无血清全悬浮培养的F81细胞株及其构建方法、应用，属于兽医生物学技术领域。所述F81细胞株名称为猫肾细胞F81-04细胞株，于2023年01月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45452。该细胞传代性状稳定，能应用于FCV、FHV、FPV(猫杯状、猫疱疹、猫瘟病毒)三种病毒的培养产率高，可显著降低生产成本，提高下游纯化的效率，能够快速稳定的扩大生产规模，质量实现均衡稳定。质量实现均衡稳定。


技术研发人员：宋春雨 马玉鑫 司欢欢 侯野
受保护的技术使用者：北京鼎持生物技术有限公司
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/8/28