一种植物化学物质包覆金纳米颗粒的共轭化合物及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种植物化学物质包覆金纳米颗粒的共轭化合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.由于结核分枝杆菌(mtb)耐药菌株的出现，结核病(tb)是一个主要的公共卫生问题。耐药结核病对任何药物都有耐药性，耐多药结核病(mdr-tb)对异烟肼(inh)和利福平(rif)有耐药性。从技术上讲，所有耐药结核分枝杆菌分离株都需要足够的时间来治疗，但有些会失败，导致死亡。因此迫切需要替代药物的开发方法和改善靶向传递。
3.纳米药物是靶向传递、治疗和诊断的良好替代抗结核药物。耐多药结核病是全球结核病控制计划的一个主要问题和障碍。本发明对敏感的mdr mtb分离物非常有效。尽管结核分枝杆菌分离株具有耐药性，但有时该药物无法到达结核分枝杆菌的靶点。
4.目前，只有合成药物用于结核治疗，而mtb分离株(结核的病原体)对其表现出耐药性，尚未有文献报道有关f.arabica被用于与gnps结合以对抗mtb分离物的研究。
5.本发明使用金纳米颗粒靶向传递fagonia arabica(f.arabica)的植物化学成分。这也将减少结合分支杆菌在人群中的传播时间。


技术实现要素：

6.发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种植物化学物质包覆金纳米颗粒的共轭化合物及其制备方法与应用，具体是一种新的生物和化学合成的金纳米颗粒的共轭化合物(gnps-f)的配方，其在己烷、甲醇和水中与f.arabica的植物化学成分结合，用于评估其对结核分枝杆菌的抑制能力。
7.技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
8.本发明的第一个目的是，提供一种共轭化合物gnps-f的制备方法，所述方法包括，由植物化学物质包覆金纳米颗粒gnps形成共轭化合物gnps-f，其中，所述植物化学物质为f.arabica提取物，记作f。
9.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述f.arabica提取物由f.arabica植株原料溶于溶剂中溶解、过滤所得，其中，所述f.arabica植株原料包括f.arabica植株粉末或f.arabica植株研磨后的植物糊，所述溶剂包括极性溶剂或非极性溶剂，分别得到极性基植物提取物f
极
、非极性基植物提取物f
非极
。
10.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述极性溶剂包括水，所述非极性溶剂包括甲醇或己烷。
11.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述极性基植物提取物f
极
的制备方法包括：绿色植物f.arabica洗涤后研磨成糊状得植物糊，按0.1-1.0mg/ml的比例将所述植物糊加入到极性溶剂中，加热10-30分钟，室温下冷却，过滤得极性基植物提取物f
极
。
12.优选的，按0.1-0.5mg/ml的比例将所述植物糊加入到极性溶剂中，更优选的，按0.4mg/ml的比例添加。
13.可选的，在本发明的一种实施方式中，当极性溶剂为水时，所述f.arabica提取物为水基植物提取物f3。
14.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述非极性基植物提取物f
非极
的制备方法包括：按0.05-0.5mg/ml的比例将f.arabica植株粉末加入非极性溶剂中，室温下持续摇晃一周，过滤得非极性基植物提取物f
非极
。优选的，室温下持续摇晃一周时间。
15.优选的，按0.1-0.3mg/ml的比例将f.arabica植株粉末加入非极性溶剂中，更优选的，按0.2mg/ml的比例添加。
16.可选的，在本发明的一种实施方式中，当非极性溶剂包括甲醇或己烷时，对应得到甲醇植物提取物f2、己烷植物提取物f1。
17.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述极性基植物提取物f
极
与金纳米颗粒gnps采用绿色合成法进行包覆，包括以下步骤：将3-6ml极性基植物提取物f
极
与0.7-1.0m金盐溶液在室温下混合，合成极性基共轭化合物gnps-f
极
，所述金盐包括氯金酸钠。
18.可选的，在本发明的一种实施方式中，所述非极性基植物提取物f
非极
与金纳米颗粒gnps采用化学合成法进行包覆，包括以下步骤：
19.(1)用半胱氨酸cys作链接器覆盖gnps，得带接头的金纳米颗粒gnps-cys；
20.(2)在有机溶剂中，带接头的金纳米颗粒gnps-cys通过接头结合所述非极性基植物提取物f
非极
中的羧基或碳基或羟基，合成非极性基共轭化合物gnps-cys-f
非极
，其中，所述有机溶剂包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺、氰硼氢化钠、羰基二咪唑-四氢呋喃悬浮液其中任意一种。
[0021]
进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述结合所述非极性基植物提取物f
非极
中的羧基的方法包括：在2.5ml gnps-cys水溶液中加入0.5-5ml 20mg/ml edc水溶液及30-80mg冻干的非极性基植物提取物f
非极
进行交联，在25-45℃的黑暗中不断搅拌1-5小时，离心、清洗后，得与非极性基植物提取物f
非极
的羧基结合的非极性基共轭化合物gnps-cys-f
非极-羧基
。
[0022]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，加入0.5-3ml edc水溶液，优选为1ml。
[0023]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述edc水溶液的ph为6-7，优选ph为6.4。
[0024]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，加入40-60mg冻干的非极性基植物提取物f
非极
，优选为加入50mg。
[0025]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，在30-40℃搅拌，优选为37℃。
[0026]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，以70-150rpm的转速不断搅拌，优选为100rpm。
[0027]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述搅拌时间为1-3小时，优选为2小时。
[0028]
进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述结合所述非极性基植物提取物f
非极
中的碳基的方法包括：将gnps-cys、非极性基植物提取物f
非极
以1:(1-5)的摩
尔比，用1-10mg/ml的浓度溶解在碳酸钠-柠檬酸钠缓冲液中，得共轭溶液，ph保持7-10，将每毫升含有5m氰硼氢化钠的共轭溶液中加入氢氧化钠中，静置1-3小时后，加入乙醇胺阻断未反应的醛，透析纯化后，得与非极性基植物提取物f
非极
的碳基结合的非极性基共轭化合物gnps-cys-f
非极-碳基
。
[0029]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述碳酸钠-柠檬酸钠缓冲液由0.05m碳酸钠和0.1m柠檬酸钠，在ph为9.5的条件下制备。
[0030]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述gnps-cys、非极性基植物提取物f
非极
以1:4的摩尔比为1:(3-5)，优选为1:4。
[0031]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述每毫升共轭溶液中加入3-6m氰硼氢化钠，优选为5m。
[0032]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述静置时间为2小时。
[0033]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述静置后，在每毫升共轭溶液中加入1-5m乙醇胺来阻断未反应的醛，优选为3m乙醇胺。
[0034]
进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，所述结合所述非极性基植物提取物f
非极
中的羟基的方法包括：将冻干的非极性基植物提取物f
非极
以3-8％w/v悬浮在含有30-70mg/ml羰基二咪唑的四氢呋喃悬浮液中，室温下搅拌1-3小时后，依次用thf、水洗涤，将其以8-20mg/ml重悬于冷耦合缓冲液中；然后加入1～10mg gnps-cys，在0-10℃下搅拌至少18小时，最后加入0.1-0.3m乙醇胺，搅拌1-3小时，颗粒离心后洗涤，得与非极性基植物提取物f
非极
的羟基结合的非极性基共轭化合物gnps-cys-f
非极-羟基
。
[0035]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述颗粒离心后洗涤具体包括，颗粒离心后悬浮于0.1m碳酸钠偶联缓冲液中，用0.1m碳酸钠偶联缓冲液洗涤，所述碳酸钠偶联缓冲液为ph 9.5的0.1-0.2m碳酸钠偶联缓冲液，优选为0.1m碳酸钠偶联缓冲液。
[0036]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述冷耦合缓冲液为0.01m吡啶-hcl，0.1m nacl，ph6.0。
[0037]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述羰基二咪唑的四氢呋喃悬浮液中，羰基二咪唑的浓度为40-55mg/ml，优选为50mg/ml。
[0038]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述非极性基植物提取物f
非极
以4-6％w/v悬浮在羰基二咪唑的四氢呋喃悬浮液中，优选为5％w/v。
[0039]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述加入gnps-cys后，在2-6℃下搅拌，优选为在4℃下搅拌。
[0040]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述四氢呋喃悬浮液以8-15mg/ml重悬于冷耦合缓冲液中，优选为10mg/ml。
[0041]
更进一步可选的，在本发明的一种实施方式中，所述加入乙醇胺为0.1-0.2m，优选为0.1m乙醇胺。
[0042]
本发明的第二个目的是，提供一种共轭化合物gnps-f，根据上述任意所述的方法制备得到。
[0043]
本发明的第三个目的是，提供一种药物组合物，包含如以上所述的共轭化合物gnps-f或其药学上可接受的形式。
[0044]
本发明的第四个目的是，提供一种药剂盒，包含如以上所述的共轭化合物gnps-f
或其药学上可接受的形式和一种或多种药学上可接受的载体，或包含如以上所述的药物组合物或其药学上可接受的形式和一种或多种药学上可接受的载体。
[0045]
本发明的第五个目的是，提供如以上所述的共轭化合物gnps-f、药物组合物、药剂盒，应用于抗结核分枝杆菌活性，或者应用于制备治疗结核病的药物。
[0046]
有益效果：
[0047]
(1)我们的新型f.arabica植物化学物质模型以及与gnps偶联治疗结核病，对结核分枝杆菌的耐药和mdr株具有良好的抑制作用。
[0048]
(2)这种植物提取物对肝脏、心脏和肾脏没有任何明显的毒性作用。
[0049]
(3)f.arabica植物化学物质很容易获得，而且成本效益高。
[0050]
(4)目前的模式可以减轻耐药病例的负担。
附图说明
[0051]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0052]
图1为gnps及其共轭化合物的紫外-可见吸收光谱图，其中，(a)为纯gnps，(b)为半胱氨酸包封的gnps，(c)为绿色合成的gnps-f3；
[0053]
图2为gnps-cys与不同植物提取物结合形成的共轭化合物的uv-vis吸收光谱图，其中，(d)为甲醇植物提取物中的羧基，(e)为己烷植物提取物中的羟基，(f)为甲醇植物提取物的羰基、(g)为己烷植物萃取物中的羰基，(h)为甲醇植物萃取物中的羟基，(i)为己烷植物提取物中的羟基；
[0054]
图3、图4为gnps及其共轭化合物的ftir透射图，其中，(a)为纯gnps，(b)为半胱氨酸封端gnps，(c)为绿色合成的gnps-f3，(d)为甲醇植物提取物中植物化学物质的羧基，(e)为己烷植物提取物中植物化学物质的羧基，(f)为甲醇植物提取物中植物化学物质的羰基，(g)为与己烷植物提取物中植物化学品羰基，(h)为与甲醇植物提取物中植物化学物质的羟基，(i)为与己烷植物提取物中植物化学物质的羟基共轭的gnps的ftir透射图；
[0055]
图5为纯gnps(a)、半胱氨酸封端gnps(b)和绿色合成的gnps-f3(c)的dls图，与甲醇植物提取物中植物化学物质的羧基(d)、己烷植物提取物中植物化学物质的羧基(e)、甲醇植物提取物中植物化学物质的羰基(f)、己烷作物提取物中植物化学物质的羰基(g)、甲醇植物提取物中植物化学物质的羟基(h)和己烷植物提取物中植物化学物质的羟基(i)共轭的gnps的dls图；
[0056]
图6为纯gnps(a)、半胱氨酸封端gnps(b)和绿色合成gnps(c)的xrd衍射图；
[0057]
图7为gnps的sem图；
[0058]
图8为1μm、400nm、200nm、100nm和30nm尺度上半胱氨酸封端的gnps的sem图像；
[0059]
图9为1μm、400nm、200nm、100nm和30nm尺度下绿色合成gnps的sem图像；
[0060]
图10为肝脏的组织病理学结果。
[0061]
图11.一个肾脏的组织病理学结果。pic2423：幻灯片的第一部分。pic2424：幻灯片第2部分pic2425：幻灯片部分pic2426：第4部分。pic2587：正常滑块的第一部分。pic2588：
正常滑块的第二部分。
[0062]
图12.心脏的组织病理学检查。
[0063]
图13:lj斜面显示阳性对照组的生长(p)。阴性对照组无生长(n)。f1、f2、f3、f4：植物提取物。m2和m6:gnps与植物化学物质结合，显示5至50μl剂量的mtb生长。标记为m1、m3、m4和m5的小瓶在50μl gnps的情况下没有生长。
[0064]
图14：lj小瓶显示f1、f2、f3、f4、m1、m2、m3、m4、m5和m6中没有生长，100μl纳米共轭植物提取物和浓度为4.28μg/μl的gnps。
[0065]
图15.150μl和200μl浓度(4.28μg/μl)的绿色合成gnps颗粒对mdr菌株的抗分枝杆菌作用。f1、f2、f3、f4、f5、f6代表m1、m2、m3、m4、m5、m6(见表1)。gc：生长控制(阳性)。
具体实施方式
[0066]
下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0067]
本发明实施例采用傅里叶变换红外光谱(ftir)、紫外可见光谱(uv-vis)、能量色散x射线光谱(edx)、动态光散射(dls)、扫描电子显微镜(sem)和x射线衍射(xrd)对合成的gnps进行了表征，并且设计了体外模型，用lowenstein jensen斜率法和世界卫生组织推荐的mgit培养法测定f.arabica conjugated结合gnps的抗结核能力。
[0068]
实施例
[0069]
1.植物提取物制备
[0070]
具有抗菌活性的植物化学物质通过煎煮、浸渍和浸液进行提取。将f.arabica在阴凉处干燥1至2周。用研钵将干燥的植物研磨成细粉末。在水、甲醇和己烷中制备了f.arabica提取物。
[0071]
1.1水基提取物
[0072]
从巴基斯坦中部城镇德利加兹汗收集绿色植物(f.arabica)，用去离子水洗涤，然后研磨成糊状。将约40mg的植物糊加入到100ml的去离子水中，并在热板上加热20分钟。将混合物在室温下冷却。收集约60ml植物提取物，通过过滤进行纯化。植物水提物在-20℃下保存，以备将来使用。
[0073]
1.2甲醇提取物
[0074]
将巴基斯坦拉合尔大学分子生物学和生物技术实验室研究所提取的约100克粉末状的f.arabica植物(将f.arabica在阴凉处干燥1至2周，用研钵将干燥的植物研磨成细粉末)加入500毫升甲醇中。将混合物放在室温下，持续摇晃一周。过滤混合物，将80ml甲醇植物提取物冻干，在-20℃保存以备将来使用。
[0075]
1.3己烷提取物
[0076]
将巴基斯坦拉合尔大学分子生物学和生物技术实验室研究所提取的约100克粉末状的f.arabica的植物(将f.arabica在阴凉处干燥1至2周，用研钵将干燥的植物研磨成细粉末)加入500ml己烷中。将混合物放在室温下，持续摇晃一周。过滤混合物，将40ml的己烷植物提取物冻干，在-20℃保存以备将来使用。
[0077]
2.共轭化合物gnps-f的合成
[0078]
共轭化合物gnps-f通过两种方法制备：绿色合成、化学合成。其中，第一种方法即绿色合成法中，gnps被植物化学物质封端，而半胱氨酸没有用作接头，因为有许多植物化学物质以不同的位置和不同的比例附着在gnps上。
[0079]
在第二种方法即化学合成中，gnps首先与半胱氨酸连接被其覆盖，再由半胱氨酸作为连接体，以固定比例连接植物化学物质中的各官能团。
[0080]
这两种方法描述如下。
[0081]
2.1极性基共轭化合物gnps-f
极
的绿色合成
[0082]
绿色合成的方法为将植物提取物加入金盐溶液(四氯金酸，haucl4)中制备gnps-f。本实施例对该程序进行了优化(浓度、ph值和温度)。
[0083]
具体方法如下：
[0084]
(1)整个f.arabica植物用于制备gnps-f的生物技术，包括叶、皮、茎、根等。植物用蒸馏水洗涤，磨成糊状，然后在通用溶剂(去离子水)中煮沸，制成水基植物提取物f3，提取物经过滤纯化。
[0085]
(2)使用不同比例的金盐和提取物(0.93mol/5ml、0.95mol/4ml、0.75mol/3ml、0.83mol/3ml和0.85mol/6ml)在不同温度(100℃至110℃)和ph水平(ph5至6.4)下合成gnps。将约3ml的植物提取物与0.83m的金盐溶液在室温下混合，合成gnps。植物化学物质具有还原性和稳定性，因此，不需要外部添加密封剂。目视监测反应混合物的颜色变化，然后收集gnps-f3，在10,000rpm下高速离心分离后进一步使用。
[0086]
根据试验结果，后续的相关测试实验中，采用0.83m：3ml的比例获取的水基共轭化合物gnps-f3。即将3ml植物提取物与0.83m金盐溶液混合，ph＝6.4，合成水基共轭化合物gnps-f3(记为f4)，然后按照第2.1.1节的描述对合成的共轭化合物进行表征，结果如图1(c)所示。
[0087]
2.1.1特性描述；
[0088]
用紫外可见光谱、ftir、dls、sem和xrd对合成的gnps进行了表征。gnps的液体样品用紫外光谱和dls，粉状gnps用xrd、sem和ftir。
[0089]
2.1.1.1紫外可见光谱
[0090]
这种定量技术测量通过样品的光的强度与通过空白的光的强度进行比较。用于纳米复合材料分析的分光光度计(bk-uv1900pc，biobase)提供了准确、高性能的结果。
[0091]
2.1.1.2ftir光谱学
[0092]
ftir光谱，称为红外光谱，用于鉴定有机、无机和高分子材料。红外光通过测试样品，测量其化学性质。红外光谱显示了各种官能团，并提供了测试样品的化学成分和物理状态。
[0093]
2.1.1.3dls光谱学
[0094]
dls是一种评估溶液中的粒子反射了多少光的方法。当粒子由于布朗运动而离开其起始位置时，反射光会随着时间的推移而改变。根据粒子的流体动力半径，这将以不同的速率存在。因此，可以通过对反射光的变化率的测量来确定悬浮粒子的大小。反射光强度与颗粒大小的关系图用于显示dls的结果。
[0095]
2.1.1.4xrd技术
[0096]
基于布拉格定律(n＝2dsin)，采用xrd技术来确定材料的结晶性质。xrd是一种广泛的而非歧视的表征材料的晶体性质的方法。它检测了纳米复合材料的结构性能数据，包括首选晶体取向(纹理)、相纯度和其他结构指标，包括平均晶粒度、结晶度、应变和晶体缺陷。当样品中的单色x射线以特定的角度从每一对晶格平面扩散时，通过积极的干涉产生xrd峰。峰值强度是基于晶格平面内的原子位置决定的。粉末xrd分析用于检测地质、材料科学、环境科学和工程等领域的未知晶体化合物。
[0097]
2.1.1.5sem显微镜
[0098]
这种技术对于表征颗粒的大小和生成放大的图像非常有用。电子束扫描样本以产生放大图像进行分析。它也被称为sem显微镜。它提供了关于样品的表面形貌和组成的信息，具有多种优点。因为与分析块状基板上的纳米颗粒相比，它可以在透射模式(t-sem)下分析至少10nm的尺寸。sem显微镜用于表征纳米复合材料是非常值得推荐的、有价值的、可追溯的和准确的。在电子样品相互作用的过程中，sem显示了关于结构、化学成分、尺寸和表面形态的信息。edx分析了纳米颗粒的组成(能量色散x射线)，尖峰代表纳米颗粒。
[0099]
2.1.1.6edx光谱学
[0100]
edx微量分析仪可以测定样品中的元素及其浓度。这种方法依赖于受加速电子的材料发射的独特的x射线信号。样品中的原子可能会被高能入射电子击碎，从而导致原子电离。当外层电子充满内层电子时，就会产生x射线光子。
[0101]
2.2极性基共轭化合物gnps-f
极
的化学合成
[0102]
首先，需要先合成金纳米颗粒gnps，本实施例中作为示例，使用turkevich方法制备化学gnps。在本发明其实实施例方式中，金纳米颗粒gnps的合成方式不作限制。
[0103]
正如turkevich和frens所描述的，标准方法是在100℃下还原柠檬酸盐，具体包括：通过在加热板上的烧杯中使金溶液沸腾，用12.5ml 1％柠檬酸钠将12.5ml 25mm的氢氯酸金溶液还原。在本实施例中，不使用回流以避免在液体中存在温度梯度，当溶液开始沸腾时，加入约12.5ml温热的1％柠檬酸钠溶液(为了产生不同的粒径，我们调整了柠檬酸盐的含量(用柠檬酸盐代替半胱氨酸))。15分钟后，当溶液变成砖红色时，将液体冷却至室温，得金纳米颗粒gnps，记为纯gnps，然后按照第2.1.1节的描述对合成的gnps进行表征，结果如图1(a)所示。
[0104]
2.2.1用链接器覆盖gnps
[0105]
半胱氨酸cys被用作化学制备的gnps的接头
·
。
[0106]
制备约49.95m半胱氨酸溶液(调节ph 7.4)，将约2.5ml的半胱氨酸溶液添加到化学合成的gnps中，并在37℃的黑暗中保持2小时，以100rpm的速度持续振荡，随后静置24小时，得半胱氨酸覆盖的gnps，即gnps-cys，并按照上一节所述进行表征。
[0107]
gnps用半胱氨酸覆盖，以结合植物化学物质的羧基、醛基和羟基。
[0108]
2.2.2植物化学物质与羧基的结合：
[0109]
利用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(edc)技术将植物化学物质与半胱氨酸连接的gnps进行交联。
[0110]
具体方法包括：在1ml去离子水中溶解50mg半胱氨酸覆盖的gnps(使用1m氢氧化钠将ph调节至8)；对于羧基活化，加入1ml edc(20mg/ml去离子水)(用1mhcl调节ph：6.4)。将反应混合物在黑暗中以100rpm连续搅拌30分钟后，添加1毫升edc(10mg/ml去离子水)和
50mg冻干的甲醇植物提取物f2或己烷植物提取物f1，并将混合物在37℃的黑暗中以100rpm不断搅拌2小时，再通过以14000rpm离心20分钟分离共轭颗粒，然后用去离子水洗涤2次，清洗后得到的与非极性基植物提取物f
非极
的羧基结合的非极性基共轭化合物gnps-cys-f2-羧基(记为m1)或gnps-cys-f1-羧基(记为m2)，存储在4℃的环境中。然后按照第2.1.1节的描述进行表征。
[0111]
2.2.3植物化学物质与醛基的结合
[0112]
使用0.05m碳酸钠和0.1m柠檬酸钠，在ph为9.5的条件下制备缓冲液。将含有必须与具有醛基的植物化学物质缀合的gnps的胺，与甲醇植物提取物f2或己烷植物提取物f1，以1:4的摩尔比用1-10mg/ml的浓度溶解在缓冲液中，将ph保持在7-10。共轭溶液中加入氰硼氢化钠，得到每毫升包含5m氰硼氢化钠的共轭溶液，再置于氢氧化钠中。静置2小时后，在每毫升的共轭溶液中加入3m的乙醇胺来阻断未反应的醛。通过透析15分钟后纯化颗粒，然后保存在4℃中环境下。这些合成的与非极性基植物提取物f
非极
的碳基结合的非极性基共轭化合物gnps-cys-f2-碳基(记为m3)或gnps-cys-f1-碳基(记为m4)，按照前一节所述的方法进行表征。
[0113]
2.2.4植物化学物质与羟基的结合
[0114]
制备约0.1m的碳酸钠偶联缓冲液，其ph值为9.5。将冷冻的甲醇植物提取物f2或己烷植物提取物f1以5％w/v悬浮在含有50mg/ml羰基二咪唑(cdi)的四氢呋喃(thf)悬浮液中，在室温下搅拌2小时。用thf洗涤活化颗粒以去除过量cdi和副产物，再用冰冷的去离子水洗涤以除去任何溶剂后，将其以10mg/ml重悬于冷耦合缓冲液(0.01m吡啶-hcl，ph:6.00，0.1m nacl)中。然后加入1～10mg含胺的gnps(即gnps-cys)，在4℃下搅拌至少18小时进行反应，最后加入0.1m乙醇胺，搅拌2小时，颗粒离心后悬浮于0.1m碳酸钠偶联缓冲液中，用0.1m碳酸钠偶联缓冲液洗涤3次。得与非极性基植物提取物f
非极
的羟基结合的非极性基共轭化合物gnps-cys-f2-羟基(记为m5)或gnps-cys-f1-羟基(记为m6)，然后按照前面第2.1.1节的描述进行表征。
[0115]
3.结果
[0116]
3.1紫外可见分光光度法
[0117]
对9个样品(纯gnps(a)、半胱氨酸包封的gnps即gnps-cys(b)、绿色合成的gnps-f3即f4(c)、甲醇植物提取物中植物化学物质的羧基即m1(d)、己烷植物提取物中植物化学物质的羧基即m2(e)、甲醇植物提取物的植物化学物质的醛基即m3(f)、己烷作物提取物中植物化学物质的醛基即m4(g)、甲醇植物提取物中植物化学物质的羟基即m5(h)和己烷植物提取物中植物化学物质的羟基即m6(i))进行了uv-vis测试。
[0118]
由三柠檬酸钠制备的gnps在500.5nm处观察到峰值(图1a)，用半胱氨酸包被的gnps的峰值在529nm处(图1b)。使用f.arabica还原金合成的gnps在493nm处升高(图1c)。考虑到误差，gnps的最大吸光度在500nm、529nm和493nm(图1)。gnps与植物化学物质结合形式的吸收峰显示出显著变化(图2)。
[0119]
发现m1的单分散体增加(表1)，在312nm、352nm、546nm和672nm处具有最大吸光度(图2d)。m2共轭显示276nm和294nm峰(图2e)。相比之下，m3显示了426nm和384nm处的最大吸收率(图2f)。m4和m5的吸收峰分别在286nm和400nm(图2g)以及274nm和292nm(图2h)处获得。在m6中，gnps与己烷植物提取物的羟基共轭，在282nm处获得最大吸光度(图2i)。
[0120]
3.2 gnps的ftir分析
[0121]
对9个样品进行了gnps的ftir分析，以分析参与偶联半胱氨酸封端gnps合成的植物化学物质的f.arabica提取物的不同官能团。
[0122]
光谱显示gnps在1621.85cm-1
处的相关峰，显示c＝c拉伸(共轭烯烃基团)，3261.91cm-1
，显示o-h拉伸(羧酸基团)(图3a)。半胱氨酸封端的gnps显示了许多峰(图3b)，包括3564.39cm-1
处的o-h峰和1733.13cm-1
处c＝o拉伸，证实了羧基的存在，而2884.59cm-1
的c-h峰和1715.24cm-1
处的c＝o峰证实了醛基的存在。除了羧基和醛基，我们还观察到羟基在3617cm-1
处形成峰(图3)。
[0123]
在植物化学物质与半胱氨酸封端的gnps偶联过程中，使用碳二亚胺激活羧基。它与f.arabica的甲醇和己烷提取物缀合(图3d；图3e)，在此期间，我们观察到两种提取物缀合的gnps中的o-h拉伸(3564.39cm-1
)消失，并在3255.25cm-1
和3393.68cm-1
处下降。同时，c＝c峰值在1734.11cm-1
和1734.20cm-1
处保持不变(图4)。
[0124]
氰基硼氢化钠用于激活半胱氨酸封端的gnps的醛基。当这些活化的gnps与f.arabica的甲醇和己烷提取物缀合时(图3f和g)，我们在2884.59cm-1
处观察到c-h峰。
[0125]
相比之下，在甲醇提取物结合的gnps中仅在1734.42cm-1
处观察到c＝o峰(图4)。随着使用羰基咪唑激活半胱氨酸封端的gnps的羟基，共轭甲醇和己烷提取物(图4h，图4i)显示o-h从3617cm-1
下降至3391.06cm-1
和3247.91cm-1
，证实了羟基的消失。绿色合成gnps的ftir光谱证实了胺和酚的存在，n-h峰位于3232.17cm-1
，c-n峰位于1579.58cm-1
，o-h峰位于3444.42cm-1
，c-o峰位于1077.55cm-1
(确认图3c)。
[0126]
3.3.dls分析
[0127]
使用dls测定gnps的大小和分散度。
[0128]
颗粒尺寸为球形，直径为34nm(图5a)，而282nm的较小峰值显示了由于颗粒形成后的延迟表征而导致的颗粒聚集。类似地，由于聚集，半胱氨酸封端的gnps的图b(图5)显示出25nm至168.8nm的尺寸范围。相比之下，绿色合成的gnps具有f.arabica植物的还原能力，其大小为2nm(图5c)。有非常小的颗粒和更多的聚集，因为它们都是半胱氨酸封端的gnp，涂有不同的植物化学物质，显示了与甲醇植物提取物植物化学物质的羧基共轭的gnps(图5d-h)。由于共轭和颗粒聚集，所有这些共轭gnps的直径从0.2nm到数千nm不等(图5)。
[0129]
3.4 xrd
[0130]
衍射峰xrd衍射图显示(111)、(200)、(220)和(311)晶面内的2θ＝38.12
°
、44.32
°
、64.54
°
和77.72
°
(图6)。晶体gnps已经用对应于面心立方晶格的标准布拉格反射(111)、(200)、(220)和(311)的四个峰值表示。38.12处的强烈峰值代表(111)方向上的优先增长。
[0131]
此外，au+信号在2θ＝38.12
°
时的特征峰证实了gnps纳米复合材料中存在au+。然而，在(311)处存在au+信号与纤锌矿平面的重叠。2θ＝38.12
°
、44.32
°
和64.54
°
处的峰被分配给金属金的(111)、(200)和(220)平面(图6)。gnps的xrd峰表明形成了清晰、不同的相。gnps离散相的出现揭示了结晶gnps的合成。所鉴定的峰代表gnps的纯度。
[0132]
3.5 sem
[0133]
图8、9和10使用配备edx的sem说明了纳米复合材料和元素组成的形态特征。它们显示了纳米复合材料在30nm、100nm、200nm、400nm和1μm不同放大倍数下的表面形态。该放大图像显示了直径约为30-40nm的gnps的不规则球形(图7)。当高能电子束形成聚焦在目标
样品上的信号阵列时，sem揭示了固体样品的信息。在sem下观察的半胱氨酸封端的gnps显示出直径约为35-40nm的不规则立方形态(图8)。绿色合成的gnps显示出不同大小的聚集颗粒。颗粒的近似直径小于10nm(图9)。
[0134]
3.6 edx
[0135]
使用edx分析获得合成的gnps的元素组成。edx证实了au和其他元素的存在(表1)。
[0136]
纯gnps中存在的金占所形成的纯gnps总重量的13.5％；gnps中存在的其他元素(重量百分比更大)是氧、氮和碳。
[0137]
半胱氨酸封端的gnps(gnps-cys)中存在的金的总重量百分比为53.19％，而碳、氧和钠的元素存在的重量百分比分别为12.9％、14.5％和14.3％。
[0138]
绿色合成gnps-f3中的金的重量百分比为4.3％，与gnps一起，碳、氧和钠等其他元素也以18.0％、25.6％和2.6％的重量百分比存在。
[0139]
表1.gnps类型内的元素及其重量％
[0140]
[0141]
4.f.arabica和gnps纳米偶联物的体内细胞毒性评估
[0142]
在大鼠模型中研究了合成的f.arabica和gnps纳米偶联物的细胞毒性。在大鼠肝脏、心脏和肾脏中检查了纳米偶联毒性的影响。进行血液测试和组织病理学检查，以观察与标准对照相比的毒性水平。所有大鼠组均用f.arabica提取物处理，并合成不同浓度(5μl、50μl、100μl和150μl)的gnps。15只白化大鼠被安排在a、c和d组，每组包含5只大鼠。每组四只大鼠用f.arabica和合成的gnps处理，每组一只(总数＝5)备用，以防大鼠死亡。
[0143]
表2.gnps类型内的元素及其重量％
[0144]
组大鼠数量剂量类型a组5f.arabica和gnps纳米偶联c组5f.arabica植物提取物d组5阴性对照组(没有用f.arabica和/或gnps纳米偶联处理)
[0145]
肝脏的组织病理学结果图10所示，在显微镜检查期间，每张幻灯片被分成不同的部分。pic2409：幻灯片的第1部分。pic2410：幻灯片的第2部分。pic2411：幻灯片的第3部分。pic2412：幻灯片的第4部分。下面的其他幻灯片是正常/对照组pic2394的幻灯片：正常幻灯片的部分1和pic2394：正常幻灯片部分。
[0146]
肝脏的组织病理学结果显示，正常组(对照组)和用与f.arabica植物化学物质结合的gnps处理的大鼠，对大鼠肝脏的影响没有显著差异。
[0147]
一个肾脏的组织病理学结果如图11所示，pic2423：幻灯片的第一部分。pic2424：幻灯片第2部分pic2425：幻灯片部分pic2426：第4部分。pic2587：普通幻灯片的第一部分。pic2588：普通幻灯片的第二部分。
[0148]
肾脏的组织病理学结果显示，正常组(对照组)和用与f.arabica植物化学物质结合的gnps治疗的大鼠对肝脏的影响没有显著差异
[0149]
心脏的组织病理学检查如图12所示，
[0150]
上面的四个部分是：pic2439：幻灯片的第1部分；pic2441：幻灯片的第2部分；pic2438：幻灯片的第3部分；pic2440：第4部分。下面的两个是：pic2582：普通幻灯片的第1部分。pic2581：普通幻灯片的第2部分
[0151]
心脏的组织病理学结果显示，正常组(对照组)和用与f.arabica植物化学物质结合的gnps治疗的大鼠对肝脏的影响没有显著差异。
[0152]
5.lowenstein-jenson培养基上阿拉伯粉和gnps纳米偶联的抗真菌(抑制)活性
[0153]
为了避免污染，使用生物安全3级(bsl-3)实验室检查合成gnps和f.arabica提取物的抗真菌活性。
[0154]
层流柜用乙醇消毒，并用紫外线消毒。在穿上实验室外套、口罩和手套并完成bsl-3实验室的所有协议后，取下一些高压灭菌瓶并贴上标签。然后用标准方案制备lj培养基，并制备含有8ml lj培养液的斜面。lj培养基的固体斜面接种mtb的h37rv和耐药菌株，阴性对照除外。斜面保持水平几乎48至72小时，以使接种的mtb均匀分布在松散的lj培养基上。
[0155]
mtb显示出具有粗糙和干燥纹理的无色素菌落，涂片显微镜和免疫色谱(ict)测试进一步证实了这一点。在涂片显微镜下，制备锌染色涂片并在显微镜下观察；脐带因子(cf)的存在证实了mtb。对于ict测试，使用tb ag mpt64快速测试装置，将200μl培养的mtb添加到样品垫中，15分钟后，通过显示测试线和对照线确认存在mtb。
[0156]
在观察培养基上的mtb生长后，用f.arabica提取物诱导培养物并合成gnps，如表3所示，浓度分别为5μl、50μl和100μl。25至45天后观察到mtb的生长。
[0157]
lj斜面显示阳性对照组的生长(p)如图13所示，阴性对照组无生长(n)；f1、f2、f3、f4：植物提取物。m2和m6:gnps与植物化学物质结合，显示5至50μl剂量的mtb生长。标记为m1、m3、m4和m5的小瓶在50μl gnps的情况下没有生长。
[0158]
f.arabica粗提取物和结合植物化学物质的gnps的抗分枝杆菌活性结果如所示(图13、14)。己烷、甲醇和f.arabica水提取物在100μl的剂量下抑制了细菌的生长。相比之下，小于100μl的剂量对lj培养基上的分枝杆菌没有显著抑制作用。当以5μl和50μl的量使用时，除了f4、m2和m6外，绿色合成和偶联的gnps表现出较低的抑制作用，而使用100μl的浓度时，所有lj小瓶斜面都没有显示出耐药mtb的生长。。
[0159]
如图14所示，lj小瓶显示f1、f2、f3、f4、m1、m2、m3、m4、m5和m6中没有生长，100μl纳米共轭植物提取物和浓度为4.28μg/μl的gnps。
[0160]
如图15所示为150μl和200μl浓度(4.28μg/μl)的绿色合成gnps颗粒对mdr菌株的抗分枝杆菌作用，f1、f2、f3、f4、f5、f6代表m1、m2、m3、m4、m5、m6(见表3)。gc：生长控制(阳性)。
[0161]
将在150μl和200μl体积(浓度4.28μg/μl)下与的不同gnps结合的f.arabica提取物倒入每个mgit管中。各mgit试管培养的结果表明，与gnps结合的f.arabica植物化学物质对mdr菌株具有良好的抑制活性。生长对照(gc)(图15)有较多的mtb生长，而含有f.arabica提取物与gnps结合的其他mgit管即使在8至25天后也没有显示mtb生长。这些结果表明，我们的新配方gnps与f.arabica植物化学物质结合，对结核分枝杆菌的mdr菌株具有潜在的抑制活性，因此有可能用作抗结核药物，以更好地控制耐药菌株。
[0162]
6.针对mgit中的多药耐药性的f.arabica和gnps纳米共轭抗菌(抑制)活性
[0163]
为了进一步确认抗真菌活性，在mgit管中培养并诱导mtb的多药耐药菌株(mdr)，并用f.arabica的提取物合成具有150μl和200μl(4.28μg/μl)两种不同浓度的gnps(表3)。每天监测mgit管的mtb生长，持续16天。
[0164]
表3.f.arabica和gnps提取物的描述
[0165]
序号标签描述01f1己烷植物提取物02f2甲醇植物提取物03f3水植物提取物04f4f.arabica(绿色合成)gnps05m1gnps与羧基甲醇共轭06m2gnps与己烷的羧基结合07m3gnps与甲醇中的碳基结合08m4gnps与己烷的碳基结合09m5gnps与甲醇中的羟基基团结合10m6gnps与己烷的羟基结合
[0166]
将200μl mdr mtb阳性培养物倒入每个mgit管中(图15)。将与150μl和200μl体积(浓度4.28μg/μl)的不同gnps偶联的f.arabica提取物也倒入每个mgit管中。每个mgit管培
养的结果表明，与gnps结合的f.arabica植物化学制剂对mdr菌株具有良好的抑制活性。
[0167]
生长控制(gc)(图14，图15)具有足够的mtb生长，而含有f.arabica提取物与gnps结合的其他mgit管即使在8至25天后(包括空白)也没有显示mtb生长。这些结果表明，我们的新型gnps与f.arabica植物化学物质偶联，对mtb的mdr菌株具有潜在的抑制活性。它们可以用作抗结核药物，以更好地管理耐药菌株。
[0168]
综上，本发明使用了一种生物和化学合成的金纳米粒子共轭化合物(gnps-f)的新配方，在己烷、甲醇和水溶剂中与f.arabica中的植物化学物质共轭，以确定其对mtb的抑制潜力。通过在大鼠模型中检测了体内毒性，验证了这种植物提取物对肝脏、心脏和肾脏没有任何明显的毒性作用。此外，当在lowenstein-jenson培养基和世界卫生组织mgit培养基中与gnps一起作为靶向递送物时，阿拉伯木霉提取物的抗mtb潜力显著增加(图11、12、13)。充分说明，与gnps偶联的f.arabica植物化学物质对结核分枝杆菌的耐药株和mdr菌株具有良好的抑制作用。这些结果表明，我们的新型gnps制剂与f.arabica植物化学制剂结合，可用于对抗mtb耐药菌株。
[0169]
通过以上实验分析，本发明可以得出以下结论：
[0170]
a.本发明首次提出了f.arabica对结核分枝杆菌菌株具有抑制能力。
[0171]
b.甲醇、己烷和水基提取物的比较效果表明，己烷提取物的抑制潜力比甲醇提取物更显著，甲醇提取物的抑制能力大于水基提取物。
[0172]
c.f.arabica对抗结核分枝杆菌的能力可以通过使用水基提取物(gnps的绿色合成)植物制造金纳米颗粒(gnps)来增强。
[0173]
d.通过与甲醇提取的含羧基植物化学品(m1)、己烷提取的含羧基植物化学品(m2)、甲醇提取的含有醛基植物化学品(m3)、己烷萃取的含有醛基的植物化学品(m4)、甲醇提取的含羟基植物化学品(m5)、己烷萃取含羟基的植物化学物质(m6)，合成了6种纳米制剂。
[0174]
e.所有基于甲醇提取物的纳米制剂对结核分枝杆菌耐药菌株具有强大的抑制潜力。
[0175]
f.在低浓度(50μl)下，基于己烷提取物的纳米制剂m4(醛基共轭纳米制剂)具有比其他两种基于己烷提取物的纳米制剂m2和m6具有更强的抑制潜力。
[0176]
g.在低浓度下，基于甲醇提取物的植物化学纳米制剂(m1、m3和m5)比基于己烷提取物的植物化学纳米制剂(m2、m4和m6)具有更强的效果。
[0177]
h.在低浓度下，特定的纳米制剂比甲醇提取物、己烷提取物和植物制备的gnps(绿色合成物)具有更强的抗分枝杆菌潜力。
[0178]
i.在较高浓度的纳米制剂(100μl、150μl和200μl)下，耐药结核分枝杆菌没有生长。
[0179]
j.所有纳米制剂(gnps与f.arabica植物化学成分)也对结核分枝杆菌的多药耐药菌株也具有良好的抑制活性。
[0180]
因此，本发明的f.arabica提取物、共轭化合物gnps-f及其药物组合物等，都具有应用于抗结核分枝杆菌活性，或者应用于制备治疗结核病的药物的潜力。
[0181]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种共轭化合物gnps-f的制备方法，其特征在于，所述方法包括，由植物化学物质包覆金纳米颗粒gnps形成共轭化合物gnps-f，其中，所述植物化学物质为f. arabica提取物，记作f。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述f. arabica提取物由f. arabica植株原料溶于溶剂中溶解、过滤所得，其中，所述f. arabica植株原料包括f. arabica植株粉末或f. arabica植株研磨后的植物糊，所述溶剂包括极性溶剂或非极性溶剂，分别得到极性基植物提取物f
极
、非极性基植物提取物f
非极
；所述极性溶剂包括水，所述非极性溶剂包括甲醇或己烷。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述极性基植物提取物f
极
与金纳米颗粒gnps采用绿色合成法进行包覆，包括以下步骤：将3-6 ml 极性基植物提取物f
极
与0.7-1.0 m金盐溶液混合，合成极性基共轭化合物gnps-f
极
，所述金盐包括四氯金酸。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述非极性基植物提取物f
非极
与金纳米颗粒gnps采用化学合成法进行包覆，包括以下步骤：（1）用半胱氨酸cys作链接器覆盖gnps，得带接头的金纳米颗粒gnps-cys；（2）在有机溶剂中，带接头的金纳米颗粒gnps-cys通过接头结合所述非极性基植物提取物f
非极
中的羧基或碳基或羟基，合成非极性基共轭化合物gnps-cys
ꢀ‑
f
非极
，其中，所述有机溶剂包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺、氰硼氢化钠、羰基二咪唑-四氢呋喃悬浮液其中任意一种。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述结合所述非极性基植物提取物f
非极
中的羧基的方法包括：在2.5ml gnps-cys水溶液中加入0.5-5 ml 20 mg/ml edc水溶液及30-80 mg冻干的非极性基植物提取物f
非极
进行交联，在25-45 ℃的黑暗中不断搅拌1-5小时，离心、清洗后，得与非极性基植物提取物f
非极
的羧基结合的非极性基共轭化合物gnps-cys
ꢀ‑
f
非极-羧基
。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述结合所述非极性基植物提取物f
非极
中的碳基的方法包括：将gnps-cys、非极性基植物提取物f
非极
以1: （1-5）的摩尔比，用1-10 mg/ml的浓度溶解在碳酸钠-柠檬酸钠缓冲液中，得共轭溶液，ph保持7-10，将每毫升含有5m氰硼氢化钠的共轭溶液中加入氢氧化钠中，静置1-3小时后，加入乙醇胺阻断未反应的醛，透析纯化后，得与非极性基植物提取物f
非极
的碳基结合的非极性基共轭化合物gnps-cys
ꢀ‑
f
非极-碳基
。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述结合所述非极性基植物提取物f
非极
中的羟基的方法包括：将冻干的非极性基植物提取物f
非极
以3-8% w/v悬浮在含有30-70 mg/ml羰基二咪唑的四氢呋喃悬浮液中，室温下搅拌1-3小时后，依次用thf、水洗涤，将其以8-20 mg/ml重悬于冷耦合缓冲液中；然后加入1~10mg gnps-cys，在0-10 ℃下搅拌至少18小时，最后加入0.1-0.3 m乙醇胺，搅拌1-3小时，颗粒离心后洗涤，得与非极性基植物提取物f
非极
的羟基结合的非极性基共轭化合物gnps-cys
ꢀ‑
f
非极-羟基
。8.一种共轭化合物gnps-f，其特征在于，根据权利要求1-7任意一项所述的方法制备得到。9.一种药物组合物，包含如根据权利要求8所述的共轭化合物gnps-f或其药学上可接受的形式。
10.如权利要求8所述的共轭化合物gnps-f，或如权利要求9所述的药物组合物，应用于抗结核分枝杆菌活性，或者应用于制备治疗结核病的药物。

技术总结
本发明公开了一种植物化学物质包覆金纳米颗粒的共轭化合物及其制备方法与应用，由植物化学物质包覆金纳米颗粒GNPs形成共轭化合物GNPs-F，其中，所述植物化学物质为F.arabica提取物F。所述F.arabica提取物由F.arabica植株原料溶于溶剂中溶解、过滤所得，所述溶剂包括极性溶剂或非极性溶剂，分别得到极性基植物提取物F


技术研发人员：穆罕默德
受保护的技术使用者：仲景中医药产业研究院
技术研发日：2023.04.21
技术公布日：2023/8/14