Derlin-1或其表达上调剂在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用的制作方法

derlin-1或其表达上调剂在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，尤其涉及derlin-1或其表达上调剂在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。


背景技术：

2.非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，nafld)是目前最常见的肝脏疾病，是指除酒精和其他明确的肝损伤因素外所致的肝细胞内脂肪过度沉积的临床综合征。目前nafld主要包括简单的脂肪变性、非酒精性肝炎(nash)及其相关肝硬化三大类。随着居民生活水平提高，nafld已成为继病毒性肝炎之后第二大慢性肝病，严重危害我国人民的生命健康。肝脏脂肪酸结合蛋白(fabp1)是肝脏脂质沉积发生的关键因素之一，主要协调脂肪酸的新陈代谢，作为内源性抗氧化剂解毒物质调控脂质代谢，调控脂质代谢相关基因的表达发挥作用。有研究表明fabp1表达下降，肝脏脂质沉积水平明显改善，并且研究也发现fabp1可以作为泛素化降解底物影响其自身蛋白表达，但具体机制尚不清楚。
3.nafld的比例不断攀升，但相关技术中并不存在有效的药物干预方式。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种derlin-1或其表达上调剂在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，以解决上述背景技术中提出的问题和缺陷的至少一个方面。
5.为实现上述目的，本发明提供了derlin-1或其表达上调剂在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。
6.具体如下，本发明第一方面公开了derlin-1或其表达上调剂在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。
7.根据本发明应用技术方案中的一种技术方案，至少具备如下有益效果：
8.derlin-1作为内质网相关降解复合体(erad)的亚基，与nafld患者呈负相关，并与fabp1相互作用并促进其泛素化降解。derlin-1抑制了fabp1蛋白水平并通过fabp1依赖的途径抑制脂质沉积。此外，内质网(er)中存在的e3泛素连接酶trim25与derlin-1结合来促进fabp1的泛素化降解。derlin-1的过表达改善了肝脏的脂肪变性，并有助于减轻体重增加，降低肝脏重量和内脏脂肪量，且在哺乳动物体内激活derlin-1能起到防治nafld的作用。
9.根据本发明的一些实施方式，所述非酒精性脂肪肝病包括非酒精单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和非酒精性脂肪肝病相关的肝癌中的至少一种。
10.根据本发明的一些实施方式，所述derlin-1或其表达上调剂通过降低fabp1的表达防治非酒精性脂肪肝病。
11.根据本发明的一些实施方式，所述derlin-1或其表达上调剂通过促进fabp1降解
防治非酒精性脂肪肝病。
12.根据本发明的一些实施方式，所述derlin-1通过与fabp1结合来防治非酒精性脂肪肝病。
13.根据本发明的一些实施方式，所述derlin-1或其表达上调剂通过促进fabp1泛素化降解防治非酒精性脂肪肝病。
14.fabp1是维持脂肪酸代谢的主酶，通过泛素修饰被derlin-1降解。在体内激活derlin-1能起到防治nafld的作用。
15.根据本发明的一些实施方式，所述derlin-1或其表达上调剂通过降低脂质代谢水平防治非酒精性脂肪肝病。
16.根据本发明的一些实施方式，所述derlin-1或其表达上调剂通过抑制脂肪生成基因的表达防治非酒精性脂肪肝病。
17.根据本发明的一些实施方式，所述derlin-1与e3泛素连接酶结合来促进fabp1泛素化降解。
18.根据本发明的一些实施方式，所述e3泛素连接酶包括trim25。
19.根据本发明的一些实施方式，所述derlin-1或其表达上调剂促进acox1表达。
20.根据本发明的一些实施方式，所述derlin-1或其表达上调剂降低肝脏脂质沉积水平。
21.本发明第二方面公开了derlin-1或其表达上调剂在制备治疗和/或预防肝细胞脂质增加的产品中的应用。
22.本发明第三方面公开了derlin-1或其表达上调剂在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪肝患病机体体重和/或肝脏重量增加的产品中的应用。
23.本发明第四方面公开了derlin-1或其表达上调剂在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪肝患病机体的血清中天冬氨酸转氨酶、谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转移酶和丙氨酸氨基转移酶中至少一种增加的产品中的应用。
24.本发明第五方面公开了derlin-1或其表达上调剂在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪肝患病机体的甘油三酯和/或游离脂肪酸增加的产品中的应用。
25.根据本发明的一些实施方式，所述产品包括食品、保健品和药物。
26.将本发明的derlin-1或其表达上调剂施用于对象，所述对象可以是哺乳动物。
27.根据本发明的一些实施方式，所述哺乳动物包括人、大鼠、兔、羊、猪、牛、猫、狗和猴中的至少一种。
28.根据本发明的一些实施方式，所述防治非酒精性脂肪肝病药物的制备原料还包括药用载体。
29.根据本发明的一些实施方式，所述药用载体为药学领域常规的药物载体。
30.根据本发明的一些实施方式，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、甜味剂和香味剂中的至少一种。
31.根据本发明的一些实施方式，所述赋形剂包括水、乳糖、玉米淀粉、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素和二氧化硅中的至少一种。
32.根据本发明的一些实施方式，所述填充剂包括淀粉和蔗糖中的至少一种。
33.根据本发明的一些实施方式，所述黏合剂包括聚乙烯醇、纤维素衍生物、藻酸盐、
阿拉伯胶、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。
34.根据本发明的一些实施方式，所述纤维素衍生物包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟基丙基纤维素和羟基丙基甲基纤维素中的至少一种。
35.根据本发明的一些实施方式，所述湿润剂包括甘油。
36.根据本发明的一些实施方式，所述崩解剂包括琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠中的至少一种。
37.根据本发明的一些实施方式，所述吸收促进剂包括季铵化合物。
38.根据本发明的一些实施方式，所述表面活性剂包括十六烷醇。
39.根据本发明的一些实施方式，所述吸附载体包括高岭土和皂黏土中的至少一种。
40.根据本发明的一些实施方式，所述润滑剂包括滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇中的至少一种。
41.根据本发明的一些实施方式，本发明所述药理学上容许的盐包括与无机酸、有机酸、碱金属离子、碱土金属离子和碱性氨基酸形成的盐。
42.根据本发明的一些实施方式，所述无机酸包括盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、氢溴酸中的至少一种。
43.根据本发明的一些实施方式，所述有机酸包括马来酸、富马酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸，己二酸，棕榈酸和单宁酸中的至少一种。
44.根据本发明的一些实施方式，所述碱金属离子包括锂离子、钠离子和钾离子中至少一种。
45.根据本发明的一些实施方式，所述碱土金属离子包括钙离子和镁离子中至少一种。
46.根据本发明的一些实施方式，所述碱性氨基酸包括赖氨酸。
47.根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为本领域常规的各种剂型。
48.根据本发明的一些实施方式，所述防治非酒精性脂肪肝病药物可经由领域其他化学药和生物药形式实现功能。
49.根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为固体、半固体或液体的形式。
50.根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为水溶液、非水溶液或混悬液。
51.根据本发明的一些实施方式，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、干混悬剂、滴丸剂、干浸膏剂、注射剂或输注剂。
52.根据本发明的一些实施方式，所述片剂或所述颗粒剂上包覆糖衣、明胶衣、以及其它的必要外衣。
53.根据本发明的一些实施方式，制备注射剂时，根据需要向主药中添加包括ph调节剂、缓冲剂、悬助剂、增溶剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂中的至少一种。
54.根据本发明的一些实施方式，所述注射剂按照常规方法制成静脉、皮下或肌肉内注射剂。
55.根据本发明的一些实施方式，所述注射剂按照常规方法制成冷冻干燥物。
56.根据本发明的一些实施方式，所述悬助剂包括甲基纤维素、吐温80、羟基乙基纤维素、阿拉伯胶、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸盐中的至少一种。
57.根据本发明的一些实施方式，所述增溶剂包括聚氧化乙烯氢化蓖麻油、吐温80、烟
酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇单月桂酸盐、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯中的至少一种。
58.根据本发明的一些实施方式，所述稳定剂包括亚硫酸钠和偏亚硫酸钠中的至少一种。
59.根据本发明的一些实施方式，所述防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚和氯甲酚中的至少一种。
60.根据本发明的一些实施方式，所述药物制剂的制备方法均可采用本领域技术人员制备该种剂型常规使用制备方法制得。
61.根据本发明的一些实施方式，所述药物制剂中每一制剂单位中含有derlin-1或其表达上调剂的含量为0.001mg～50mg。
62.根据本发明的一些实施方式，所述药物的给药方式可以为本领域常规的给药方式，包括但不限于注射给药或口服给药。
63.根据本发明的一些实施方式，所述防治非酒精性脂肪肝病药物包括各种可接受的剂型。
64.根据本发明的一些实施方式，所述注射给药可以为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。
65.根据本发明的一些实施方式，所述防治非酒精性脂肪肝病药物中derlin-1或其表达上调剂的质量分数为0.1％～99.9％。
66.根据本发明的一些实施方式，所述防治非酒精性脂肪肝病药物中derlin-1或其表达上调剂的质量分数为0.5％～95％。
67.根据本发明的一些实施方式，所述防治非酒精性脂肪肝病药物中derlin-1或其表达上调剂的质量分数为10％～20％。
68.根据本发明的一些实施方式，所述防治非酒精性脂肪肝病药物的给药量标准为derlin-1或其表达上调剂0.1mg/天～1000mg/天。
69.本文所述的术语“给药剂量”为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。可以随被治疗的具体疾病以及其它因素而定，其它因素包括年龄、体重、健康状况、症状的严重程度、给药途径、治疗的频率和在治疗期间是否伴随其它的药物。
70.本文所述的术语“防治”是指减轻非酒精性脂肪肝病及其并发症的程度，或者治愈非酒精性脂肪肝病药物及其并发症使之正常化，或者减缓非酒精性脂肪肝病及其并发症的进程。
附图说明
71.图1是实施例1中基线测试时人体代谢参数对比图。
72.图2是实施例1中con组和nafld组肝脏组织切片对比图。
73.图3是实施例2中体重测试结果。
74.图4是实施例2中con组和nafld组小鼠肝脏组织中mrna水平对比结果。
75.图5是实施例2中con组和nafld组小鼠肝脏组织westernblot检测结果。
76.图6是实施例2中con组和nafld组小鼠肝脏组织切片对比图。
77.图7是实施例3中细胞在脂肪酸处理后对比图。
78.图8是实施例3中脂肪酸处理后westernblot检测结果和免疫共沉淀实验结果。
79.图9是实施例3中免疫荧光检测结果。
80.图10是实施例4中westernblot检测结果。
81.图11是实施例4中qrt-pcr实验结果。
82.图12是实施例5和实施例6中测试结果。
83.图13是实施例7中测试结果。
84.图14是实施例8中avv-gfp组和avv-derlin-1组中derlin-1表达结果及小鼠体长对比。
85.图15是实施例8中avv-gfp组和avv-derlin-1组中体重及mrna水平对比结果。
86.图16是实施例8中avv-gfp组和avv-derlin-1组中肝中、内脏脂肪和摄食对比结果。
87.图17是实施例8中avv-gfp组和avv-derlin-1组蛋白表达测试结果。
88.图18是实施例8中avv-gfp组和avv-derlin-1组he染色结果。
89.图19是实施例9中测试结果。
90.附图标记说明：
91.图中“*”代表p＜0.05，“**”代表p＜0.01，“***”代表p＜0.001。
具体实施方式
92.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本技术进行描述和说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。基于本技术提供的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
93.显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本技术应用于其他类似情景。此外，还可以理解的是，虽然这种开发过程中所作出的努力可能是复杂并且冗长的，然而对于与本技术公开的内容相关的本领域的普通技术人员而言，在本技术揭露的技术内容的基础上进行的一些设计，制造或者生产等变更只是常规的技术手段，不应当理解为本技术公开的内容不充分。
94.在本技术中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本技术的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域普通技术人员显式地和隐式地理解的是，本技术所描述的实施例在不冲突的情况下，可以与其它实施例相结合。
95.除非另作定义，本技术所涉及的技术术语或者科学术语应当为本技术所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本技术所涉及的“一”、“一个”、“一种”、“该”等类似词语并不表示数量限制，可表示单数或复数。本技术所涉及的术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含；例如包含了一系列步骤或单元(单元)的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可以还包括没有列出的步骤或单元，或可以还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。本技术所涉及的“多个”/“若干”是指两个或两个以上。“和/或”描述关联对象的关联关
系，表示可以存在三种关系，例如，“a和/或b”可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。本技术所涉及的术语“第一”、“第二”、“第三”等仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序。
96.实施例1
97.研究方法：本研究主要从临床、动物、细胞三个方面进行：
98.(1)临床水平：
99.本技术从内分泌代谢中心共招募了25名非nafld患者和25名确诊为nafld患者，按年龄、性别和bmi进行1比1匹配。基于医院伦理委员会同意，收集了相关临床资料，且获得3名非nafld患者和5名nafld患者的肝脏活检组织，并且测量血清中fabp1、谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、γ-谷氨酰基转移酶(γ-gt)、甘油三酯(tc)、胆固醇(tg)、高密度脂蛋白(hdl)和低密度脂蛋白(ldl)等生化参数。
100.肝脏活检组织进行fabp1及derlin-1免疫组化、westernblot和rt-pcr检测；
101.(2)动物水平：
102.本技术主要利用尾静脉注射1.5e+11v.g(150ul)derlin-1过表达腺病毒(aav)的c57bl/6j小鼠。
103.本技术中所有小鼠均为雄性，品系来源于c57bl/6j小鼠。
104.为了进一步分析derlin-1对fabp1的调控作用，以及小鼠肝脏脂质沉积情况。
105.本发明将小鼠分为4组：
①
aav-gfp组(n＝9，5周龄)，予以普食饲料(cd)喂养；
106.②
aav-gfp组(n＝10，5周龄)，予以hfd(high-fat diet，60％高脂饮食)喂养；
107.③
aav-derlin-1(n＝9，5周龄)，予以普食饲料(cd)喂养；
108.④
aav-derlin-1(n＝10，5周龄)，予以hfd喂养；
109.小鼠在尾静脉注射腺病毒后2周予以饮食诱导，高脂喂养16周，通过评估四组小鼠的食欲、体重(body weight，bw)、血糖(blood glucose，bg)、胰岛素敏感性、血脂水平[总胆固醇(total cholesterol，tc)、甘油三酯(triglyceride，tg)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，ldl)]、肝脏脂质内容物含量(tc、tg)、肝酶指标[谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，alt)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，ast)，肝脏组织病理等代谢表型变化等来探讨过表达fabp1对hfd诱导的nafld小鼠肝脏脂质沉积、脂代谢水平、食欲及相关糖代谢指标的影响。
[0110]
(3)细胞水平：
[0111]
本技术主要采用2种细胞系(人肝癌细胞hepg2和人胚肾细胞hek293t)，采用瞬时转染和稳转的方式验证derlin-1对fabp1的调控作用。
[0112]
本技术同时采用多种分子检测手段，包括酶联免疫吸附剂测定(elisa)、蛋白质印迹法(western blot)、免疫组化(ihc)、免疫荧光(if)、油红染色(oil red)、免疫共沉淀(co-ip)、质谱检测等。
[0113]
本技术实施方式中检测结果如下：
[0114]
临床上血清及肝脏组织中fabp1及基线指标变化(见表1和表2)：
[0115]
本技术发现在nafld组，血清fabp1水平表达比对照组高，并且两者具有统计学差异(21.94
±
12.88ng/ml vs.10.98
±
4.89ng/ml，p《0.01，图1中a)，同时血清alt、ast、γ-gt、tc、tg及ldl表达水平都有所升高(24.11
±
13.08u/lvs.20.32
±
14.91u/l，p＝0.345；
19.55
±
6.97u/l vs.17.42
±
3.58u/l，p＝0.234；32.17
±
19.95u/lvs.23.07
±
10.03u/l，p＝0.047；1.84
±
1.01mmol/l vs.1.21
±
0.50mmol/l，p＝0.007；5.09
±
0.80mmol/lvs.4.54
±
0.86mmol/l，p＝0.025；3.21
±
0.77mmol/lvs.2.74
±
0.77mmol/l，p＝0.036)，hdl水平下降(1.29
±
0.28mmol/lvs.1.34
±
0.23mmol/l，p＝0.435)，其中γ-gt、tc、tg及ldl在两组具有统计学差异(图1中b～g)。并且肝脏组织免疫组化也发现nafld患者中肝脏组织中fabp1表达上升(表1和图2中a～b，其中a图中标尺长度代表100μm、b图标尺长度代表50μm)。
[0116]
表1基线测试时的人体代谢参数对比结果
[0117][0118]
表1中数据以平均值
±
标准差或中位数表示；
[0119]
bmi：身体质量指数；con：对照组；fabp1：肝脂肪酸结合蛋白；alt：谷丙转氨酶；ast：天冬氨酸转氨酶；g-gt，γ-谷氨酰转移酶；tc：总胆固醇；tg：甘油三酸酯；hdl：高密度脂蛋白；ldl：低密度脂蛋白。
[0120]
表2血清fabp1与代谢因子的关系
[0121][0122]
实施例2、高脂食物喂养小鼠建立nafld动物模型，并验证fabp1的表达。
[0123]
本实施例以高脂食物喂养小鼠建立nafld动物模型，并验证fabp1的表达。
[0124]
cd组：(n＝9，5周龄)，予以普食饲料喂养；
[0125]
hfd组：(n＝10，5周龄)，予以hfd(high-fat diet，60％高脂饮食)喂养。
[0126]
将小鼠采用高脂食物喂养16周后，小鼠的体重和肝脏重量显著增加(图3中a～b)，高脂饮食组小鼠的血清fabp1水平明显高于对照组(图3c)。
[0127]
同时本实施例提取小鼠肝脏组织蛋白，用fabp1抗体进行ip后质谱(ms)检测(ip-fabp-ms)，发现与之结合的derlin-1(表3)。
[0128]
表3fabp1抗体进行ip后质谱(ms)检测结果
[0129][0130][0131]
本技术在小鼠肝脏组织中检测，发现derlin-1的mrna水平在hfd组较低，两组具有统计学差异(p《0.01，图4)。同时采用western blot检测小鼠肝脏组织中fabp1及derlin-1表达水平，发现hfd组fabp1蛋白水平表达上升，而derlin-1组表达下降(图5中a，cd1～3为平行测试三次，hfd1～3为平行测试三次)。并且在临床水平测试的con组(即非nafld组)发现，fabp1与derlin-1两者具有结合图5中b～c(图5中c，con1～3即为非nafld组平行测试三次，nafld1～3为nafld组平行测试三次)和共定位(图6中a，其中a图中标尺长度代表10μm，箭头为fabp1与derlin-1共定位位置)。
[0132]
本实施例还在临床肝脏组织中通过免疫组化发现nafld组，derlin-1蛋白表达下降。同时western blot检测人体肝脏组织中，发现nafld组，derlin-1表达水平同样下降，而fabp1表达上升(图3中i～j，其中h图标尺50μm)。荧光水平进一步验证了两者的表达水平呈相反趋势。
[0133]
实施例3、derlin-1通过与fabp1相互结合，从而防治非酒精性脂肪肝
[0134]
本实施例首先构建脂质沉积的细胞模型，在hepg2细胞，加入两种游离脂肪酸(ffa)刺激(ffa1：0.5mmoa(米油酸异构体)，0.25mm pa(棕榈酸异构体)，ffa2：1.0mmoa，0.5mm pa)，24小时后，收集细胞蛋白western blot检测，发现加入游离脂肪酸刺激后，fabp1表达上升，而derlin-1表达下降，但两者并没有因为ffa浓度呈现梯度变化。故本技术选择了ffa1浓度进行后续细胞实验(图7和图8中a)。
[0135]
本实施例在hek293t细胞中同时过表达fabp1和derlin-1，进行免疫共沉淀(coip)实验，发现外源性fabp1和derlin-1可以相互沉淀，并且本技术在hepg2细胞中也进行了coip实验，发现内源性fabp1和derlin-1也可以相互沉淀(图8中b～c)。免疫荧光也显示fabp1和derlin-1在细胞膜和细胞质中具有共定位(图9，图中标尺长度代表10μm)，即fabp1和derlin-1具有直接的相互作用，并且fabp1是derlin-1调控降解的底物。
[0136]
实施例4、derlin-1通过抑制fabp1的蛋白表达水平防治非酒精性脂肪肝
[0137]
本实施例在hek293t细胞中瞬转了fabp1的质粒，并且分别过表达空载体(pcdna 3.1)、derlin-1、shrna derlin-1及shrna ct，共转了48小时后，通过western blot及pcr水平检验derlin-1在蛋白水平或mrna水平是否影响fabp1的表达。
[0138]
结果发现在derlin-1过表达的情况下，fabp1蛋白表达量明显降低。而敲低derlin-1后，fabp1蛋白水平上升(图10中a～b)。
[0139]
本实施例还进行了qrt-pcr实验，与western blot细胞处理方式相同，发现在derlin-1表达不同的情况下，fabp1的rna水平与ct组相比，并没有统计学差异(图11中标尺长度代表10μm)；即derlin-1在翻译后降低fabp1的表达。
[0140]
实施例5、derlin-1通过促进fabp1蛋白降解防治非酒精性脂肪肝
[0141]
本实施中选用了50μg/ml蛋白合成的抑制剂-放线菌酮(cycloheximide，chx)确定derlin-1对fabp1的降解存在作用。
[0142]
本实施例中在hek293t细胞中分别共转了fabp1和pcdna3.1或derlin-1，发现在derlin-1存在下，fabp1随着时间降解加快，并且在6h时，fabp1几乎下降到初始的90％。说明了derlin-1参与促进fabp1的降解(图12中a)。
[0143]
实施例6、derlin-1通过促进fabp1泛素蛋白酶体途径降解来防治非酒精性脂肪肝
[0144]
本实施例加入20μmol/ml蛋白酶体抑制剂-mg132处理hek293t细胞。
[0145]
本实施例发现蛋白酶体抑制剂-mg132处理后，fabp1蛋白表达量上升了，说明fabp1能够进行泛素化降解(图12中b)。
[0146]
本实施例还在hek293t细胞中过表达derlin-1后，发现fabp1泛素化水平上升了，而加入shrnaderlin-1下调derlin-1表达后，fabp1泛素化水平下降了(图12中c～d)。
[0147]
本实施还在hepg2细胞中加入游离脂肪酸及mg132刺激，24小时后，ip实验发现与不加游离脂肪酸组相比，fabp1总蛋白水平上升，derlin-1总蛋白水平下降，而fabp1泛素化水平下降了(图12中e)。即fabp1能进行泛素化降解，并且derlin-1促进fabp1泛素化降解。
[0148]
实施例7、derlin-1通过与trim25结合后调控fabp1泛素化降解
[0149]
本实施例通过ms来筛查e3泛素连接酶(derlin-1作为e3泛素连接酶的调节物，并不能直接执行fabp1泛素化降解，必须要一个e3泛素连接酶来行使主要作用)，本实施例利用小鼠肝脏组织蛋白，用derlin-1抗体进行ip后进行sds-page电泳并染色后，将整条泳道进行ms(ip-derlin-1-ms)，与上述ip-fabp1-ms结果进行共同分析，筛查出两者共同结合的e3泛素连接酶，最终筛查出trim25(图13中a，表4)，并且本实施例在高脂小鼠肝脏组织也发现trim25 mrna水平及蛋白表达下降(图13中b～c)。同时在小鼠肝脏组织和hepg2细胞中三者具有结合，并在hfd组小鼠trim25与derlin-1、fabp1三者结合比con组小鼠少(图13中d～f，其中f图标尺长度代表10μm)。
[0150]
表4derlin-1抗体-fabp1抗体两者共同结合的e3泛素连接酶筛查结果
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本实施例还在hek293t细胞中过表达trim25，发现同时过表达derlin-1及trim25(trim25蛋白表达增加了2倍以上)，fabp1表达量最低，fabp1泛素化水平最高，而敲低trim25后，fabp1表达量增加，fabp1泛素化水平减少(图13中g～h)。即trim25作为derlin-1调控fabp1泛素化降解的重要e3泛素连接酶。
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实施例8、derlin-1作为小鼠肝脏脂肪沉积改善剂
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本实施例通过向小鼠尾静脉注射derlin-1腺病毒。结果发现与对照组(avv-gfp组)相比，过表达derlin-1(图14中a)，fabp1 mrna水平无显著差异(图15中a～b)。并且高脂13周后，aav-derlin-1+hfd组(8只/10只)与对照组相比，体重显著性减轻(图14中b和图15中c)；高脂16周后，aav-derlin-1+hfd组肝重、内脏脂肪减少，摄食无显著差异(图16中a～c)。即尾静脉过表达derlin-1使小鼠体重、肝重、脂肪重量减轻。
[0156]
与aav-gfp+hfd相比，aav-derlin-1+hfd组fabp1表达下降，trim25表达上升(图17)。并且he染色发现，与aav-gfp+hfd相比，aav-derlin-1+hfd组(8/10)肉眼可见脂质空泡减少(图18)；而油红染色发现，与aav-gfp+hfd相比，aav-derlin-1+hfd组脂滴减少，说明尾静脉过表达derlin-1可以有效改善高脂诱导的小鼠肝脏脂肪沉积。
[0157]
实施例9、derlin-1改善小鼠及hepg2细胞脂代谢水平
[0158]
高脂16周后，分别对4组小鼠进行血清血脂水平(tc、tg、ldl)以及肝脏脂质内容物含量(tc、tg)等指标检测，发现尾静脉过表达derlin-1可以有效降低高脂诱导下小鼠脂质代谢水平(图19中a～f，表5)。
[0159]
无论普食组还是高脂组，与con组相比，过氧化物酶体增殖物激活受体-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，ppar-α)过氧化物酶体增殖物激活受体-dperoxisome proliferator-activated receptor-δ，ppar-δ)、过氧化物酶体增殖物激活受体-g(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，ppar-γ)、肉毒碱棕榈酰基转移酶1a(carnitine palmitoyltransferase1a，cpt1a)mrna水平无统计学差异。而与aav-gfp+hfd相比，acox1在aav-derlin-1+hfd组中在mrna水平显著上升，derlin-1对高脂诱导的小鼠肝脏中acox1表达有调控作用(图19中g)。
[0160]
本实施例还构建了derlin-1-oe和shrnaderlin-1(derlin-1-ko)稳定的hepg2细胞株(图19中h)。此外，fabp1和derlin-1呈现相反的趋势(图19中i)。而在derlin-1-oe hepg2细胞中，tg和tc水平显著降低；在derlin-1-ko hepg2细胞中，结果相反(图19中j～l，
表6)。这些实验表明，过表达derlin-1可有效改善脂质代谢。
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表54组小鼠脂代谢因子水平
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表6hepg2细胞脂代谢水平
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本发明的优点在于，derlin-1作为内质网相关降解复合体(erad)的亚基，与nafld患者呈负相关，并与fabp1相互作用并促进其泛素化降解。derlin-1抑制了fabp1蛋白水平并通过fabp1依赖的途径抑制脂质沉积。此外，内质网(er)中存在的e3泛素连接酶trim25与derlin-1结合来促进fabp1的泛素化降解。derlin-1的过表达改善了肝脏的脂肪变性，并有助于减轻体重增加，降低肝脏重量和内脏脂肪量，且在哺乳动物体内激活derlin-1能起到防治nafld的作用。
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以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.derlin-1或其表达上调剂在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非酒精性脂肪肝病包括非酒精单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和非酒精性脂肪肝病相关的肝癌中的至少一种。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述derlin-1或其表达上调剂通过降低fabp1的表达防治非酒精性脂肪肝病。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述derlin-1或其表达上调剂通过促进fabp1泛素化降解防治非酒精性脂肪肝病。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述derlin-1或其表达上调剂通过降低脂质代谢水平防治非酒精性脂肪肝病。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述derlin-1或其表达上调剂通过抑制脂肪生成基因的表达防治非酒精性脂肪肝病。7.derlin-1或其表达上调剂在制备治疗和/或预防肝细胞脂质增加的产品中的应用。8.derlin-1或其表达上调剂在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪肝患病机体体重和/或肝脏重量增加的产品中的应用。9.derlin-1或其表达上调剂在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪肝患病机体的血清中天冬氨酸转氨酶、谷丙转氨酶、γ-谷氨酰转移酶和丙氨酸氨基转移酶中至少一种增加的产品中的应用。10.derlin-1或其表达上调剂在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪肝患病机体的甘油三酯和/或游离脂肪酸增加的产品中的应用。

技术总结
本发明涉及Derlin-1或其表达上调剂在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用，涉及生物医药技术领域。其优点在于，Derlin-1作为内质网相关降解复合体(ERAD)的亚基，与NAFLD患者呈负相关，并与FABP1相互作用并促进其泛素化降解。Derlin-1抑制了FABP1蛋白水平并通过FABP1依赖的途径抑制脂质沉积。此外，内质网(ER)中存在的E3泛素连接酶Trim25与Derlin-1结合来促进FABP1的泛素化降解。Derlin-1的过表达改善了肝脏的脂肪变性，并有助于减轻体重增加，降低肝脏重量和内脏脂肪量，且在哺乳动物体内激活Derlin-1能起到防治NAFLD的作用。1能起到防治NAFLD的作用。1能起到防治NAFLD的作用。


技术研发人员：尤慧 陈海冰 卜乐 温馨 曲伸
受保护的技术使用者：上海市第十人民医院
技术研发日：2023.04.23
技术公布日：2023/8/14