分化型甲状腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒

1.本发明属于生物检测领域，涉及分化型甲状腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒。


背景技术：

2.甲状腺癌(thyroid cancer)是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，在过去的20 年中其发病率明显增长，在国内排在恶性肿瘤的第7位，女性癌症患者的第4 位。分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer,dtc)包括乳头状癌和滤泡状腺癌，在甲状腺癌中占90％。虽然dtc患者总体预后良好，10年的生存率达90％，但如果dtc发生远处转移，患者生活质量将严重下降，5年生存率将低于50％。
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碘治疗是dtc患者发生复发/转移的有效治疗方法之一，但有约30％的患者属于碘难治性dtc(radioiodine-refractory dtc,rr-dtc)，患者的10年生存率不到10％。
3.超声引导细针穿刺组织学活检(ultrasound(us)-guided fine needle aspirationbiopsy,us-guided fna)可以对dtc标本进行细胞形态学分析，以鉴别甲状腺良性或恶性病变，是目前欧美dtc诊断指南推荐的“金标准”，但无法对疾病状态进行评估，如dtc的复发、转移及是否为rr-dtc。甲状腺球蛋白 (thyroglobulin,tg)目前在临床甲状腺癌的诊断及治疗中得到广泛应用，是预测甲状腺癌是否发生远处转移以及评估dtc术后复发风险的可靠指标。但是部分患者tg的检测水平往往会受到tg抗体(tgab)检查水平的影响；另外，tg 对rr-dtc患者的预后价值不大。所以，临床上急需一种新的肿瘤标志物以辅助判断dtc患者有无发生转移，评估dtc患者治疗预后。
4.循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,ctc)是因自发或诊疗操作等原因脱离实体瘤原发灶或转移灶而进入外周血循环的肿瘤细胞。大量研究表明，ctcs的数量与结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌以及前列腺癌等多种肿瘤患者的预后密切相关。对dtc，有研发现部分远处转移以及rr-dtc患者ctc数量升高。因此， ctc的检测有望在dtc患者预后判断中发挥作用。但是，ctc在血液中含量极少，在106～107个血细胞中才能检测到1个ctc，因此ctc的检测对检测技术的灵敏度和特异度有很高的要求。目前，ctc的检测过程主要包括ctc的分离富集以及ctc的鉴定。ctc的富集方法主要包括梯度离心法、过滤法和免疫磁性分选法等；其中滤过膜法是依据肿瘤细胞普遍大于血细胞以分离出肿瘤细胞的非特异性方法，可以过滤得到直径大于8μm的细胞，包括肿瘤细胞，且所得到的肿瘤细胞形态完整，细胞性质保持良好，适合后续进一步检测分析。目前ctc 鉴定方法包括免疫学技术、反转录聚合酶连锁反应技术、酶联免疫斑点技术以及 ctc芯片技术等。但是，以上ctc检测方法主要针对肿瘤细胞表达的非特异性抗原或核酸，并不能确定ctc的肿瘤组织来源，这为肿瘤治疗效果的评估带来诸多不确定因素。所以，建立一种准确度高、灵敏度、简便易行和成本低廉的甲状腺组织来源ctc的检测方法，在临床甲状腺癌的疾病管理中将发挥非常重要的作用。
5.国外有学者设计了针对甲状腺细胞内高表达的tg的特异性的探针，使用荧光定量pcr的方法(quantitative real-time pcr，qrt-pcr)检测到了甲状腺癌患者中富集到的ctc，阳性率分别是39.6％(19/48)；但是，该研究使用的qrt-pcr 方法操作繁琐、成本较高、
容易受到核酸污染等因素的影响，且需要对每个富集到的ctc进行rna提取和反转录，rna的产量容易影响结果的准确度，这也有可能是造成tg特异性ctc检测阳性率不高的原因。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供分化型甲状腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒。
7.本发明的另一目的是提供一种不以疾病诊断为目的的甲状腺癌循环肿瘤细胞检测方法。
8.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
9.一种tg高特异性mrna核酸探针组合物，由seq id no.1-seq id no.48 所示的48条探针组成。
10.11.[0012][0013]
本发明所述的tg高特异性mrna核酸探针组合物在制备分化型甲状腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。
[0014]
一种分化型甲状腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，包含8μm的纳米过滤膜和本发明所述的tg高特异性mrna核酸探针组合物。
[0015]
作为本发明的一种优选，所述的试剂盒还包含对富集到的细胞进行固化、 tg探针杂交、洗涤的相关试剂。
[0016]
一种不以疾病诊断为目的的甲状腺癌循环肿瘤细胞检测方法，利用本发明所述的试剂盒对血样中的循环肿瘤细胞进行富集和检测。
[0017]
作为本发明的一种优选，所述的方法包含以下步骤：
[0018]
(1)利用8μm的纳米过滤膜富集血样中的循环肿瘤细胞；
[0019]
(2)对富集到的细胞进行固化，利用所述的tg高特异性mrna核酸探针组合物进行杂交、洗涤处理后，在荧光显微镜下计数血液中ctc的数量。
[0020]
有益效果：
[0021]
本发明提供了dtc特异性ctc一体化检测试剂盒，可以通过在体外精准计数dtc患者来源的ctc数量，进而对dtc患者预后和复发进行相关性评估。利用本发明试剂盒对dtc特异性的ctc进行检测可以为临床医师提供更精准的甲状腺患者预后和复发风险评估相关的临床数据。另外，该dtc特异性ctc一体化检测试剂盒具有准确度高、灵敏度高、操作简便以及不易受其他核酸组分污染等优点。这一技术或产品的成功开发，将最大程度地满足市场和临床上对甲状腺癌特异性分子诊断的迫切需求。鉴于目前市场上检测甲状腺癌患者血清中ctc 存在的缺点，本研究建立的dtc特异性ctc一体化检测试剂盒具有良好的市场应用前景，有望产生较高的经济效益和社会效益。
附图说明
[0022]
图1本试剂盒检测流程
[0023]
图2本试剂盒的特异性验证
[0024]
图3该试剂盒的临床诊断效能
具体实施方式
[0025]
实施例1
[0026]
本试剂盒ctc的检测甲状腺癌循环肿瘤细胞分成两个步骤(图1)：
[0027]
1、ctc的富集：使用8μm的纳米过滤膜富集5ml新鲜血液样本中的循环肿瘤细胞，具体实施步骤如下：
[0028]
(1)样本要求
[0029]
a)使用真空抗凝采血管采集静脉血样本，采集后及时将采血管轻微地颠倒混匀8次。
[0030]
b)为确保样本质量，如受试者无其他采血项目，先用2ml抗凝管采集1ml 静脉血，该管弃用不作为正式样本；再用bd edta抗凝管采集测试样本，样本量保证至少5ml。如受试者有其他采血项目，在其他采血项目完成后采集本测试所需样本，这样可省去采集首管血的步骤。
[0031]
c)样本保存无需冷藏，室温即可，采集后需要在2小时内进行前处理。如不能在2小时内移交检测，请竖直静置于4℃冰箱保存，保存时间不得超过24小时。放置于4℃冰箱保存的样本，处理前至少在室温环境7下复温30分钟。
[0032]
(2)滤器润洗
[0033]
a)打开滤器上下塞并将滤器放置在润洗支架上。
[0034]
b)用巴氏管向滤器内加入约2ml的75％医用酒精待其从滤器下口自然滤出。
[0035]
c)向滤器内加入4ml生理盐水进行漂洗，去除滤器内残留酒精，自然滤出生理盐水。
[0036]
d)重复步骤c)，留适量生理盐水以保证滤膜湿润即可，装上滤器下塞。注意：如果在滤器润洗过程中存在酒精无法自然滤出或滤出过慢的情况，请立即弃用该滤器。
[0037]
(3)样本前处理：取375μl8％pfa加入15ml离心管中，加入3ml生理盐水。取血样5ml加入15ml离心管中(加至8ml)。补加生理盐水至15ml，并轻轻颠倒混匀8次，室温静置10min，对细胞进行预固定。有多份血样时，应一份份处理，避免交叉污染及忘记加入固定剂。
[0038]
(4)样本分离
[0039]
a)将滤器放于a10支撑模块的正中间，确保下胶塞被下针刺穿。
[0040]
b)用巴氏管向滤器中加入约8ml固定好的样本，点击“开始”，待样本分离完毕后，再用巴氏管向滤器中加入剩余7ml样本，再次点击“开始”，完成样本分离。
[0041]
c)向滤器管中加入4ml pbs，点击“开始”，进行样本漂洗。
[0042]
d)重复步骤c)2次。
[0043]
e)甲醇固定：向滤器中加入500μl甲醇，室温固定1min后，点击“开始”按钮运行设备排尽甲醇。如有甲醇残留，将滤器从机器上取下，打开下胶塞，盖上上胶塞，使得残余的甲醇自然流出。
[0044]
f)取膜，贴膜：拆卸滤器取出滤膜，在载玻片左上角滴加5μl甲醇,将滤膜正面朝上贴于玻片，37℃烘烤10min。
[0045]
g)去除滤膜背面细胞：滴加10μl的去离子水于玻片上，将烘烤的滤膜用镊子揭下后再贴平上滴加有去离子水的玻片处，尽量贴平整，自然晾干10min 以备后续检测。
[0046]
2、ctc的检测：对富集到的细胞进行固话、tg探针杂交、洗涤等一系列处理后，在荧
光显微镜下计数血液中ctc的数量。
[0047]
(1)ctc细胞的固定和透化处理
[0048]
a)将滤膜置入12孔板中。
[0049]
b)用1ml1x pbs洗涤
[0050]
c)加入1ml的甲醇—醋酸(meoh-acoh)固定液以固定和透化细胞。
[0051]
d)室温孵育10分钟
[0052]
e)直到杂交前48小时，将细胞储存在2-8℃条件下的meoh-acoh中。
[0053]
(2)fish杂交
[0054]
a)将meoh-acoh从12孔板吸走。
[0055]
b)加入1ml缓冲洗液a，然后室温孵育2-5分钟。
[0056]
c)组装湿盒：150mm组织培养板；底部均匀地平铺吸满水的纸巾并在其上方放置单层有助于防止探针溶液从盖玻片下蒸发。
[0057]
d)在加湿盒，将100μl含探针的杂交缓冲液分配到石腊膜上。
[0058]
e)轻轻地将盖玻片倾斜，细胞面朝下，转移到100μl含有探针的杂交缓冲液滴上。
[0059]
f)盖住加湿室，并用石腊膜密封。
[0060]
g)37℃下避光孵育2小时。(孵育可以持续长达16小时)。
[0061]
h)轻轻地将盖玻片倾斜，细胞面朝上，转移到含有1ml缓冲液a的新12 孔板。
[0062]
i)37℃下避光孵育30分钟。
[0063]
j)吸出缓冲液a后加入1ml的dapi核染料(dapi溶于缓冲液a，终浓度为5ng/ml)复染细胞核。
[0064]
k)37℃下避光孵育30分钟。
[0065]
l)吸出dapi染色缓冲液，然后加入1ml缓冲液b。在室温下孵育2-5分钟。
[0066]
m)在显微镜载玻片上加入一小滴(约15μl)防荧光淬灭封片剂，并将盖玻片盖到载玻片上，细胞面朝下。
[0067]
n)轻轻地从盖玻片的周边除去多余的封片剂。
[0068]
o)用透明指甲油密封盖玻片周边，并使其干燥。
[0069]
p)如有必要，用水轻轻擦去盖玻片上干掉的盐成分。
[0070]
q)进行成像。
[0071]
实施例2特异性验证
[0072]
首先，使用甲状腺乳头状癌细胞株b-cpap,滤泡状癌细胞株ftc-133和甲状腺未分化癌细胞株hth-74对本试剂盒进行特异性验证，检测方法同实施例1。结果发现(图2)，本试剂盒使用的tg-mrna fish探针可以特性检测到dtc细胞株(b-cpap,ftc-133)细胞质内的tg-mrna荧光信号(红色)，而不显示 atc细胞株(hth-74)细胞质内的tg-mrna荧光信号，仅细胞核被dapi染色成蓝色。然后，收集10例分化型甲状腺癌发生转移病例，用本试剂盒tg-mrnafish探针进行检测。结果发现，甲状腺癌患者中来源于甲状腺的ctc可以检测到特异的红色荧光，同时细胞核被dapi染色成蓝色；而ctc周边的白细胞因为不表达tg-mrna，故细胞质内的tg-mrna荧光信号无显示，仅细胞核被dapi 染色成蓝色。综合说明本试剂盒可以特异检测甲状腺来源的ctc。
[0073]
实施例3试剂盒的临床诊断效能评估
[0074]
收集14例术后dtc患者和12例健康对照者全血10ml,使用滤膜法富集ctc 后用迪夫(diff-quik)快速染色法对dtc患者组和健康对照组进行初步检测，使用tg-if(免疫荧光)探针对15例dtc术后患者和6例健康对照者，使用本试剂盒对21例dtc患者和15例正常健康对照者全血中的ctc进行检测，最后对以上结果进行统计和分析。结果发现(图3)，使用diff快速染色法，患者全血中的ctc数量平均为44.6个，而健康对照5ml全血平均发现8.2个ctc，但经统计分析，二者并无统计学差异(p》0.05)。使用tg-if探针，患者组ctc数量(平均值3.5个)明显高于正常对照组ctc数量(平均值0.5个)(p《0.05)；使用本试剂盒，患者组ctc数量(平均值23.5个)明显高于正常对照组ctc 数量(平均值0.9个)(p《0.05)。结果还显示，本试剂盒tg-mrna fish探针检测的患者组ctc数量明显高于tg-if探针法患者组ctc数量(p《0.001)；而 diff-quik染色ctc数量又明显高于本试剂盒检测的ctc数量，说明使用 diff-quik染色有可能引起误诊，而tg-if探针法容易造成漏诊。
[0075]
诊断效能分析显示(图3)，使用diff-quik染色最大曲线下面积(auc)为 0.592(95％ci:0.369-0.816,p＝0.425)，cutoff值为73.0ctcs，灵敏度为21.4％，特异度为100.0％；使用if技术时最大曲线下面积(auc)为0.649(95％ci: 0.471-0.827,p＝0.132)，cutoff值为1.5ctcs，灵敏度为42.9％，特异度为86.7％；使用本试剂盒时最大曲线下面积(auc)为0.939(95％ci:0.000-1.000,p《0.001)， cutoff值为4.5ctcs，灵敏度为73.3％，特异度为100.0％。结果比对表明，本试剂盒相比于if技术和diff-quik有更好的诊断效能。
[0076]
滤膜法可以有效富集患者全血中的ctc，diff快速染色法可以用于鉴定dtc患者ctc，但是检测结果假阳性率较高。tg-if探针可以特异检测dtc患者ctc，但是存在一定的假阴性结果。本试剂盒相较tg-if探针和diff快速染色法特异性好、准确度高，具有更好的诊断效能，可以用于dtc患者特异性ctc的检测，为临床医师提供精准的甲状腺患者预后和复发风险评估依据。

技术特征：
1.一种tg高特异性mrna核酸探针组合物，其特征在于由seq id no.1-seq id no.48所示的48条探针组成。2.权利要求1所述的tg高特异性mrna核酸探针组合物在制备分化型甲状腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒中的应用。3.一种分化型甲状腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于包含8μm的纳米过滤膜和权利要求1所述的tg高特异性mrna核酸探针组合物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒还包含对富集到的细胞进行固化、tg探针杂交、洗涤的相关试剂。5.一种不以疾病诊断为目的的甲状腺癌循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于利用权利要求3所述的试剂盒对血样中的循环肿瘤细胞进行富集和检测。6.根据权利要求5所述的甲状腺癌循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于包含以下步骤：(1)利用8μm的纳米过滤膜富集血样中的循环肿瘤细胞；(2)对富集到的细胞进行固化，利用所述的tg高特异性mrna核酸探针组合物进行杂交、洗涤处理后，在荧光显微镜下计数血液中ctc的数量。

技术总结
本发明公开了分化型甲状腺癌循环肿瘤细胞检测试剂盒。该试剂盒包含8μm的纳米过滤膜和权利要求1所述的Tg高特异性mRNA核酸探针组合物。利用本发明试剂盒对DTC特异性的CTC进行检测可以为临床医师提供更精准的甲状腺患者预后和复发风险评估相关的临床数据。另外，该DTC特异性CTC一体化检测试剂盒具有准确度高、灵敏度高、成本低、操作简便以及不易受其他核酸组分污染等优点。酸组分污染等优点。酸组分污染等优点。


技术研发人员：柳卫 付煜 葛世彬 孙闯 郑倩 黄继萍
受保护的技术使用者：江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）
技术研发日：2022.02.15
技术公布日：2023/8/28