胞苷脱氨酶突变体及基于胞苷脱氨酶突变体构建的碱基编辑器

1.本发明属于基因编辑技术领域，尤其是涉及一种胞苷脱氨酶突变体及基于胞苷脱氨酶突变体构建的碱基编辑器。


背景技术：

2.crispr/cas9为代表的新型基因编辑技术在编辑效率方面具有优势，有效推动了基因编辑技术的发展和进步。2016年以来，研究者以crispr/cas9、crispr/cas12a(cpf1)、crispr/cas12f为基础，已经开发出多种dna碱基编辑工具，可在基因组水平实现高效精准的点突变，且此过程中不会产生dna双链断裂。目前碱基编辑器主要有两种：胞嘧啶碱基编辑器(cbe，可介导c
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a突变)和腺嘌呤碱基编辑器(abe，可介导a
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c突变)。其中，cbe是将特定的胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)与突变型核酸酶(如携带有d10a或突变的spcas9，称为nspcas9；或是功能失活型cas12a或cas12f，称为dcas12a或dcas12f)以及尿嘧啶糖基化酶抑制因子(ugi)融合，得到的融合蛋白可在sgrna的引导下，介导c
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t
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a突变。
3.现有cbe工具中的脱氨酶多属于胞嘧啶核苷脱氨酶(cytidine deaminase)家族，胞嘧啶核苷脱氨酶本身对单链dna(ssdna)有高亲和性，这导致多数cbe工具存在cas非依赖的dna脱靶效应，因此有很大的安全隐患。虽然研究者采用多种策略对cbe工具进行优化，但依然缺少在rna/dna脱靶效应以及编辑窗口/精度等多个方面进行协同优化的cbe工具。完成rna/dna脱靶效应优化的cbe工具的活性窗口非常局限，极大的限制了cbe的应用前景(nat biotechnol,2020.38(5):620-628；nat commun,2020.11(1):2052；nat methods,2020.17(6):600-604)。


技术实现要素：

4.为开发具有低水平rna/dna脱靶效应且多样化活性窗口的cbe工具，本发明提供胞苷脱氨酶突变体及基于胞苷脱氨酶突变体构建的碱基编辑器。
5.本发明通过开发筛选新的胞苷脱氨酶突变体，将胞苷脱氨酶突变体与nspcas9为代表的突变型核酸酶的不同位点(n-末端、c-末端和内部插入位点)融合，得到的新融合蛋白，即为碱基编辑器cbe。
6.本发明开发出的碱基编辑器cbe可有效实现c-t单碱基替换，而且cas非依赖的dna脱靶效应和rna脱靶效应均处于低水平甚至被清除。根据胞苷脱氨酶突变位置及突变特征的不同，新构建的碱基编辑器还具有不同的碱基偏好性和活性窗口。本发明能有效拓宽单碱基编辑工具的应用。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
8.本发明首先提供一种胞苷脱氨酶突变体，为基于胞苷脱氨酶ljcda1进行的以下突变中的一种，所述胞苷脱氨酶ljcda1的氨基酸序列如seq id no.1所示：
9.(1)ljcda1的rl1(第25～30氨基酸)替换为a3a对应位置(第25～30氨基酸)的gi氨基酸，突变体命名为lj-rl1(a3a)；
10.(2)ljcda1的rl1(第25～30氨基酸)替换为lpcda1对应位置(第25～30氨基酸)的ykrsps氨基酸，突变体命名为lj-rl1(lp)；
11.(3)ljcda1的rl1(第25～30氨基酸)替换为lpcda1l1_1对应位置(第25～30氨基酸)的lhyaeg氨基酸，突变体命名为lj-rl1(lp1l1-1)；
12.(4)ljcda1的rl2(第125～136位氨基酸lyfenikrnqig)替换为aid对应位置(第125～136氨基酸)的lyfcedrkaepeg氨基酸，突变体命名为lj-rl2(aid)；
13.(5)ljcda1的rl2(第125～136位氨基酸lyfenikrnqig)替换为apobec3f对应位置(第125～136氨基酸)的lyyfwdtdyqeg氨基酸，突变体命名为lj-rl2(a3f)；
14.(6)ljcda1的rl2(第125～136位氨基酸lyfenikrnqig)替换为apobec3g对应位置(第125～136氨基酸)的iyddqgrcqe氨基酸，突变体命名为lj-rl2(a3g)；
15.(7)ljcda1的rl2(第125～136位氨基酸lyfenikrnqig)替换为lpcda1l1_1对应位置(第125～136氨基酸)的iydkdravdhrg氨基酸，突变体命名为lj-rl2(lp1l1-1)。
16.这些胞苷脱氨酶突变体为具有c-t单碱基编辑活性且低水平cas非依赖的dna脱靶效应的胞苷脱氨酶突变体。
17.本发明还提供一种碱基编辑器cbe，所述碱基编辑器cbe为将所述胞苷脱氨酶突变体融合于突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白。
18.在本发明的一个实施方式中，所述突变型核酸酶选自nspcas9或其突变体，其中nspcas9的氨基酸序列如seq id no.2所示。
19.在本发明的一个实施方式中，所述碱基编辑器cbe为将所述胞苷脱氨酶突变体融合于nspcas9的n-末端构建的cbe变体，所述nspcas9序列如seq id no.2所示。
20.在本发明的一个实施方式中，所述nspcas9的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls，所述nucleoplasmin nls序列如seq id no.3所示。
21.本发明还提供所述碱基编辑器cbe的构建方法，包括以下步骤：
22.将所述胞苷脱氨酶突变体融合于突变型核酸酶的不同位点，构建所述碱基编辑器cbe。
23.优选的，所述碱基编辑器cbe为将所述胞苷脱氨酶突变体融合于nspcas9的n-末端构建的cbe变体，所述nspcas9序列如seq id no.2所示，所述nspcas9的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls，所述nucleoplasmin nls序列如seq id no.3所示。
24.本发明还提供所述碱基编辑器cbe的应用，所述碱基编辑器cbe介导c
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a突变，用于dna水平特定位点特定碱基的突变。
25.本发明还提供一种多核苷酸，编码所述胞苷脱氨酶突变体或编码所述碱基编辑器cbe。
26.本发明还提供一种载体，含有所述的多核苷酸。
27.本发明还提供一种宿主细胞，含所述碱基编辑器cbe，或含有所述载体。
28.本发明第还提供一种试剂盒，包含用于构建所述胞苷脱氨酶突变体或所述碱基编辑器cbe的试剂。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下方面：
30.本发明通过在胞苷脱氨酶ljcda1中引入不同突变，开发了新的胞苷脱氨酶突变体，通过将胞苷脱氨酶突变体融合于spcas9为代表的突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白，即碱基编辑器cbe，能对位于前间隔序列不同位置的胞嘧啶实现有效的c-t碱基突变。本发明所获得的cbe变体具有多样化c-t编辑碱基偏好性和活性窗口，相关的cbe变体其cas非依赖的dna脱靶效应和rna脱靶效应均处于低水平甚至被清除。
31.本发明的碱基编辑器具有非常低水平的dna/rna脱靶效应，且具有多样化的c-t编辑偏好性和活性窗口，可实现更广范围、更精细且安全性更高的c-t单碱基替换，能有效拓宽单碱基编辑工具的应用，具有很高的应用价值。本发明实现了rna/dna脱靶效应、碱基编辑偏好性及编辑窗口等多个方面的协同优化。
附图说明
32.图1.不同cbe变体的cas非依赖型dna脱靶效应检测。七鳃鳗来源的胞苷脱氨酶融合于nspcas9蛋白的n-末端、c末端构建的cbe变体的cas非依赖型dna脱靶效应。采用r-loop实验检测cas非依赖型dna脱靶效应，利用sanger测序分析碱基编辑特征。所选位点为sasgrna-5(a)和sasgrna-6(b)。每组n＝1。
33.图2.胞苷脱氨酶ljcda1各突变体为基础的cbe变体的碱基编辑特性。ljcda1各突变体融合于nspcas9的n末端，获得cbe变体。利用sanger测序分析碱基编辑特征，检测碱基编辑特征所用的sgrna为sga(a)和sg-h4(b)。每组n＝1。
34.图3.胞苷脱氨酶ljcda1各突变体为基础的cbe变体的cas非依赖型dna脱靶效应。ljcda1各突变体融合于nspcas9的n末端，获得cbe变体。采用r-loop实验检测cas非依赖型dna脱靶效应，利用sanger测序分析碱基编辑特征，利用sanger测序分析碱基编辑特征。所选位点为sasgrna-5(a)和sasgrna-6(b)。每组n＝1。
35.图4.优选cbe变体介导c-t编辑的活性窗口。选择8种sgrna分别与各优选cbe变体共转染hek293t细胞系，通过高通量扩增子测序分析碱基编辑的活性窗口。每组n＝3个生物学重复。
36.图5.优选cbe变体介导c-t编辑的碱基偏好性。选择8种sgrna分别与各优选cbe变体共转染hek293t细胞系，通过高通量扩增子测序分析碱基编辑的碱基偏好性。每组n＝3个生物学重复。
37.图6.全基因组测序分析优选cbe变体在dna水平的脱靶效应。分别对c-t&g-a类型的snvs(a)和总snvs(b)进行统计分析。
38.图7.优选cbe变体的cas非依赖的dna脱靶效应。通过r-loop实验和高通量扩增子测序对优选cbe变体的cas非依赖的dna脱靶效应进行分析。r-loop 1～6分别对应sasgrna1～6。图中每种sasgrna均挑选有代表性的胞嘧啶位点。n＝3个生物学重复。
39.图8.优选cbe变体的rna水平脱靶效应。通过rna-seq实验对优选cbe变体的rna脱靶效应进行分析。n＝4个生物学重复。
具体实施方式
40.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
41.实施例1
42.不同胞苷脱氨酶为基础构建的cbe变体的cas非依赖dna脱靶效应筛选(r-loop实验)
43.已有研究在七鳃鳗中发现多种新的胞苷脱氨酶，在此基础上构建的cbe变体具有多样化的c-t编辑活性窗口(2019nature communications，expanding c-t base editing toolkit with diversified cytidine deaminases)。这部分cbe变体的cas非依赖的dna脱靶效应目前缺少系统性评估。申请人通过r-loop实验对部分优选cbe变体的cas非依赖的dna脱靶效应进行分析。
44.dna水平的脱靶效应(cas非依赖型脱靶效应)通过r-loop实验进行分析。其基本原理是，dsacas9与靶向基因组特定位点(位点x)的sasgrna(sasgrna-x)在细胞中共表达，会在位点x处诱导形成单链dna(ssdna)区域；此时，细胞内共表达的碱基编辑器(abe或cbe)因其自身对ssdna的亲和力，便可能结合ssdna并介导c
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a (cbe)或a
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c(abe)突变。
45.人源hek293t细胞系复苏培养后以30％-50％密度铺12孔平板，24小时后采用脂质体共转染碱基编辑器的各优选表达载体(通过2a-egfp元件同时表达egfp)和失活型sacas9(dsacas9)-sasgrna共表达载体(同时表达红色荧光蛋白)，培养72小时后胰酶消化收取细胞，流式细胞分选双阳性细胞，通过裂解液裂解细胞提取基因组，之后针对sasgrna位点设计引物进行定向扩增，扩增产物经sanger测序，进行数据分析了解sasgrna位点处的c-t突变频率。为初步评估n-a3a-be和c-a3a-be及其突变体的cas非依赖的dna脱靶效应，研究中共选取2种不同的sasgrna脱靶位点(sasgrna-5：tctgcttctccagccctggc；sasgrna-6：gatgttccaatcagtacgca)用于在dna水平的脱靶效应分析(cas非依赖型脱靶效应)。
46.结果显示，n-7-be、n-12-be在sasgrna-5和sasgrna-6两位点处无明显的c-t碱基编辑活性(图1a-b)。结合已有报道可知，n-7-be的c-t编辑活性更强。因此，申请人后续对n-7-be(重命名为n-lj-be)中的胞苷脱氨酶(ljcda1)进行突变，构建一系列cbe变体，进一步分析其碱基编辑活性和cas非依赖的脱靶效应。
47.实施例2
48.ljcda1突变体、对应cbe变体构建及c-t点突变活性和cas非依赖的dna脱靶效应检测
49.合成人源密码子优化的ljcda1序列(seq id no.1)。
50.ljcda1突变体构建如下：
51.(1)ljcda1的rl1(第25～30氨基酸)替换为a3a对应位置的gi氨基酸，突变体命名为lj-rl1(a3a)；
52.(2)ljcda1的rl1(第25～30氨基酸)替换为lpcda1对应位置(第25～30氨基酸)的ykrsps氨基酸，突变体命名为lj-rl1(lp)；
53.(3)ljcda1的rl1(第25～30氨基酸)替换为lpcda1l1_1对应位置(第25～30氨基酸)的lhyaeg氨基酸，突变体命名为lj-rl1(lp1l1-1)；
54.(4)ljcda1的rl2(第125～136氨基酸，lyfenikrnqig)替换为aid对应位置(第125～136氨基酸)的lyfcedrkaepeg氨基酸，突变体命名为lj-rl2(aid)；
55.(5)ljcda1的rl2(第125～136氨基酸，lyfenikrnqig)替换为apobec3f对应位置(第125～136氨基酸)的lyyfwdtdyqeg氨基酸，突变体命名为lj-rl2(a3f)；
56.(6)ljcda1的rl2(第125～136氨基酸，lyfenikrnqig)替换为apobec3g对应位置(第125～136氨基酸)的iyddqgrcqe氨基酸，突变体命名为lj-rl2(a3g)；
57.(7)ljcda1的rl2(第125～136氨基酸，lyfenikrnqig)替换为lpcda1l1_1对应位置(第125～136氨基酸)的iydkdravdhrg氨基酸，突变体命名为lj-rl2(lp1l1-1)。
58.各突变体分别融合于nspcas9(d10a)(序列如seq id no.2所示)的n-末端构建cbe变体。此外，nspcas9(d10a)的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls(序列如seq id no.3所示)。
59.其中，突变体lj-rl1(a3a)融合于nspcas9(d10a)(序列如seq id no.2所示)的n-末端，且nspcas9(d10a)的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls(序列如seq id no.3所示)，构建的cbe变体称之为n-lj-rl1(a3a)-be。
60.突变体lj-rl1(lp)融合于nspcas9(d10a)(序列如seq id no.2所示)的n-末端，且nspcas9(d10a)的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls(序列如seq id no.3所示)，构建的cbe变体称之为n-lj-rl1(lp)-be。
61.突变体lj-rl1(lp1l1-1)融合于nspcas9(d10a)(序列如seq id no.2所示)的n-末端，且nspcas9(d10a)的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls(序列如seq id no.3所示)，构建的cbe变体称之为n-lj-rl1(lp1l1-1)-be。
62.突变体lj-rl2(aid)融合于nspcas9(d10a)(序列如seq id no.2所示)的n-末端，且nspcas9(d10a)的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls(序列如seq id no.3所示)，构建的cbe变体称之为n-lj-rl2(aid)-be。
63.突变体lj-rl2(a3f)融合于nspcas9(d10a)(序列如seq id no.2所示)的n-末端，且nspcas9(d10a)的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls(序列如seq id no.3所示)，构建的cbe变体称之为n-lj-rl2(a3f)-be。
64.突变体lj-rl2(a3g)融合于nspcas9(d10a)(序列如seq id no.2所示)的n-末端，且nspcas9(d10a)的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls(序列如seq id no.3所示)，构建的cbe变体称之为n-lj-rl2(a3g)-be。
65.突变体lj-rl2(lp1l1-1)融合于nspcas9(d10a)(序列如seq id no.2所示)的n-末端，且nspcas9(d10a)的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls(序列如seq id no.3所示)，构建的cbe变体称之为n-lj-rl2(lp1l1-1)-be。
66.本实施例中利用2a肽段共表达融合蛋白与绿色荧光蛋白egfp，用以指示融合蛋白的表达情况，并用于后续的流式细胞分选。
67.本实施例中还构建sgrna表达载体，在表达特定sgrna的同时表达ugi-2a-mcherry。ugi可以抑制尿嘧啶糖基化酶的活性，提高c-t突变效率，红色荧光蛋白mcherry用于指示载体表达情况，可用于后续的流式细胞分选。
68.为评估cbe变体碱基编辑活性的改变，将cbe变体(通过2a-egfp元件同时表达egfp)与单向导rna(sgrna)(sgrna同时表达尿嘧啶糖基化酶抑制因子ugi和2a-mcherry)共转染至培养的293t细胞。细胞培养72小时后，通过facs收集同时表达egfp和mcherry的双阳性细胞。
69.本实施例中使用的sgrna为sga(序列为tgcccctccctccctggccc)和sg-h4(序列为ggcactgcggctggaggtgg)。
70.收集的细胞抽提基因组，使用可特异性扩增sga和sg-h4位点信息的引物进行定向pcr。pcr产物通过sanger测序验证cbe变体的碱基编辑活性改变。
71.结果显示，除n-lj-rl1(a3a)-be在sga和sg-h4两位点均无明显活性外，其余cbe变体均有明显的c-t编辑活性。与n-lj-be相比，n-lj-rl1(lp)-be的c-t编辑能力和活性窗口无明显改变(c3-c6)；n-lj-rl1(lp1l1-1)-be的c-t编辑能力明显减弱，且活性窗口明显变窄(c3)。n-lj-rl2(aid)-be的c-t编辑能力接近n-lj-be，但活性窗口明显变窄(c3)；n-lj-rl2(a3f)-be的c-t编辑能力明显弱于n-lj-be，且活性窗口因位点而异(sga处编辑c3，sg-h4处对c5的编辑能力更强)，这反映出其具有一定碱基偏好性；n-lj-rl2(a3g)-be的c-t编辑能力弱于n-lj-be，且活性窗口因位点而异(sga处编辑c3-c6，sg-h4处对c5的编辑能力更强)，这反映出其具有一定碱基偏好性；n-lj-rl2(lp1l1-1)-be的c-t编辑能力和活性窗口无明显改变(c3-c6)(图2a-b)。
72.dna水平的脱靶效应(cas非依赖型脱靶效应)通过r-loop实验进行分析。其基本原理是，dsacas9与靶向基因组特定位点(位点x)的sasgrna(sasgrna-x)在细胞中共表达，会在位点x处诱导形成单链dna(ssdna)区域；此时，细胞内共表达的碱基编辑器(abe或cbe)因其自身对ssdna的亲和力，便可能结合ssdna并介导c
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a(cbe)或a
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c(abe)突变。
73.人源hek293t细胞系复苏培养后以30％-50％密度铺12孔平板，24小时后采用脂质体共转染碱基编辑器的各优选表达载体(通过2a-egfp元件同时表达egfp)和失活型sacas9(dsacas9)-sasgrna共表达载体(同时表达红色荧光蛋白)，培养72小时后胰酶消化收取细胞，流式细胞分选双阳性细胞，通过裂解液裂解细胞提取基因组，之后针对sasgrna位点设计引物进行定向扩增，扩增产物经sanger测序，进行数据分析了解sasgrna位点处的c-t突变频率。为初步评估n-a3a-be和c-a3a-be及其突变体的cas非依赖的dna脱靶效应，研究中共选取2种不同的sasgrna脱靶位点(sasgrna-5：tctgcttctccagccctggc；sasgrna-6：gatgttccaatcagtacgca)用于在dna水平的脱靶效应分析(cas非依赖型脱靶效应)。
74.结果显示，n-lj-be及其突变体在检测的位点处均无明显的c-t编辑活性，表明n-lj-be及对应突变体的cas非依赖型脱靶效应处于很低水平(图3a-b)。
75.实施例3
76.优选碱基编辑器cbe变体的活性窗口和碱基偏好性
77.本实施例中，优选n-lj-be、n-lj-rl1(lp1l1-1)-be、n-lj-rl2(aid)-be、n-lj-rl2(a3f)-be、n-lj-rl2(a3g)-be和n-lj-rl2(lp1l1-1)-be，分析其活性窗口和碱基偏好性。
78.为系统分析碱基编辑器的活性窗口和碱基偏好性，选择8种sgrna(aavs序列：gaccctcagccgtgctgctc；s18序列：acacacacacttagaatctg；hek4序列：ggcactgcggctggaggtgg；emx序列：gagtccgagcagaagaagaa；mskc序列：cgtcgccgatcttcacaggg；sgb序列：agagccccccctcaaagaga；ube3a序列：gtacagttagtactcagcag；zs2序列：gtgcggcaagagcttcagcc)开展相关研究。将优选的cbe变体(通过2a-egfp元件同时表达egfp)与单向导rna(sgrna)(sgrna同时表达尿嘧啶糖基化酶抑制因子ugi和2a-mcherry)共转染至培养的293t细胞。细胞培养72小时后，细胞培养72小时后，通过facs收集同时表达egfp和mcherry的双阳性细胞。
79.收集好的细胞抽提基因组，使用可特异性扩增目标sgrna位点信息的引物进行定
向pcr。pcr产物通过扩增子测序，以分析优选碱基编辑器的活性窗口和碱基偏好性(n＝3次生物学重复)。
80.结果显示，n-lj-be的活性窗口为(c2-c7，在c2-c8范围内均有一定活性)；n-lj-rl1(lp1l1-1)-be的活性窗口为(c3)，但编辑效率偏低，平均编辑效率《20％。n-lj-rl2(aid)-be的活性窗口为(c3)。n-lj-rl2(a3f)-be的活性窗口为(c3-c10)，但编辑效率偏低，平均编辑效率《20％。n-lj-rl2(a3g)-be的活性窗口为(c3-c5)。n-lj-rl2(lp1l1-1)-be的活性窗口为(c2-c5)。(图4)
81.此外，cbe变体的活性呈现出一定的碱基偏好性，n-lj-be对不同碱基位点的偏好性为：cn位点处，对ct(下划线为编辑位点)有一定偏好性，在cg位点编辑活性低；此外，在nc位点处，ac≈gc》cc≈tc。n-lj-rl2(aid)-be对不同碱基位点的偏好性为：cn位点处，ca≈ct》cc≈cg；nc位点处，偏好ac。n-lj-rl2(a3f)-be对不同碱基位点的偏好性为：cn位点处，ca≈ct》cc》cg；nc位点处，偏好ac。n-lj-rl2(a3g)-be对不同碱基位点的偏好性为：cn位点处，ct》ca》cc》cg；nc位点处，偏好ac，ac》cc》gc》tc。n-lj-rl2(lp1l1-1)-be对不同碱基位点的偏好性为：cn位点处，ct≈ca≈cc》cg；nc位点处，ac≈cc》gc≈tc。(图5)
82.实施例4
83.优选碱基编辑器cbe变体在dna水平的脱靶效应(全基因组测序分析)
84.本实施例中，优选n-lj-be，通过全基因组测序分析其在dna水平的脱靶效应。
85.将优选的cbe变体(通过2a-egfp元件同时表达egfp)与单向导rna(sgrna)(sgrna同时表达尿嘧啶糖基化酶抑制因子ugi和2a-嘌呤霉素抗性基因)共转染至培养的293t细胞。细胞培养24-48小时后，加入嘌呤霉素持续处理2-3天，挑选单细胞克隆至96孔板中。单细胞克隆扩增成功后转移至12孔板继续培养。细胞数量扩增成功后抽提基因组，使用可特异性扩增目标sgrna位点信息的引物进行定向pcr。sanger测序分析目标位点的碱基编辑情况，发生c-t碱基编辑细胞的基因组进行全基因组测序和snvs分析。本实施例研究中选用的sgrna序列为sg-rnf(序列信息：gtcatcttagtcattacctg)。
86.进行全基因组测序的样本数：ncas9(d10a)(n＝3)；n-lj-be(n＝3)。
87.全基因组测序分析显示，与ncas9(d10a)相比，n-lj-be的总snvs数量相当，c》t&g》a的snvs数量也接近。以上结果表明，n-lj-be在dna水平的脱靶效应处于低水平，且几乎无cas非依赖的dna脱靶效应(图6)。
88.实施例5
89.优选碱基编辑器cbe变体的cas非依赖的dna脱靶效应(r-loop实验验证)
90.本实施例中，优选n-lj-be、n-lj-rl1(lp1l1-1)-be、n-lj-rl2(aid)-be、n-lj-rl2(a3f)-be、n-lj-rl2(a3g)-be和n-lj-rl2(lp1l1-1)-be，利用r-loop实验分析其cas非依赖的dna脱靶效应。
91.dna水平的脱靶效应(cas非依赖型脱靶效应)通过r-loop实验进行分析。其基本原理是，dsacas9与靶向基因组特定位点(位点x)的sasgrna(sasgrna-x)在细胞中共表达，会在位点x处诱导形成单链dna(ssdna)区域；此时，细胞内共表达的碱基编辑器(abe或cbe)因其自身对ssdna的亲和力，便可能结合ssdna并介导c
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a (cbe)或a
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c(abe)突变。
92.人源hek293t细胞系复苏培养后以30％-50％密度铺12孔平板，24小时后采用脂质
体共转染碱基编辑器的各优选表达载体(通过2a-egfp元件同时表达egfp)和失活型sacas9(dsacas9)-sasgrna共表达载体(同时表达红色荧光蛋白)，培养72小时后胰酶消化收取细胞，流式细胞分选双阳性细胞，通过裂解液裂解细胞提取基因组，之后针对sasgrna位点设计引物进行定向扩增，扩增产物经sanger测序，进行数据分析了解sasgrna位点处的c-t突变频率。为初步评估优选cbe变体的cas非依赖的dna脱靶效应，研究中共选取6种不同的sasgrna脱靶位点(sasgrna-1：tggtagacagcatgtgtccta；sasgrna-2：atttacagcctggcctttgggg；sasgrna-3：tgtcaggtaatgtgctaaaca；sasgrna-4：gtggaggagggtgcatggggt；sasgrna-5：tctgcttctccagccctggc；sasgrna-6：gatgttccaatcagtacgca)用于在dna水平的脱靶效应分析(cas非依赖型脱靶效应)。
93.结果显示，仅n-lj-be、n-lj-rl1(lp1l1-1)-be、n-lj-rl2(aid)-be、n-lj-rl2(a3f)-be、n-lj-rl2(a3g)-be和n-lj-rl2(lp1l1-1)-be等优选cbe变体在sasgrna-1～6的脱靶效应很低，最高位点《2％(图7)。结合全基因组测序数据结果可知，n-lj-be及变体的cas非依赖的dna脱靶效应可忽略不计。
94.实施例6
95.优选cbe变体在rna水平的脱靶效应分析
96.本实施例中，优选n-lj-be、n-lj-rl1(lp1l1-1)-be、n-lj-rl2(aid)-be、n-lj-rl2(a3f)-be、n-lj-rl2(a3g)-be和n-lj-rl2(lp1l1-1)-be，利用rna-seq分析rna水平的脱靶效应。
97.为评估各优选工具在rna水平的脱靶效应，将各优选表达载体(通过2a-egfp元件同时表达egfp)与单向导rna(sgrna)(sgrna同时表达尿嘧啶糖基化酶抑制因子ugi和2a-puromycin)共转染至培养的293t细胞。转染后24小时加入嘌呤霉素筛选阳性细胞。嘌呤霉素处理48小时后，收集细胞提取总rna进行rna-seq实验。本方案使用的sgrna为sg-nc(无靶向sgrna)(n＝4次生物学重复)。
98.rna编辑是指在mrna水平上改变遗传信息的过程。具体来说，它指的是mrna分子中核苷酸的缺失、插入或化学修饰。这种修饰影响基因的表达，不同氨基酸的产生和开放阅读框的形成。在哺乳动物细胞中，主要存在两类rna编辑，分别为a-i编辑和c-u编辑。这种rna编辑是由rna依赖的腺嘌呤脱氨酶介导的。
99.c-u编辑结果的分析显示，各cbe变体与阴性对照组(cas9-d10a+sgrna)有类似的rna编辑位点数量(图8)。
100.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种胞苷脱氨酶突变体，其特征在于，为基于胞苷脱氨酶ljcda1进行的以下突变中的一种，所述胞苷脱氨酶ljcda1的氨基酸序列如seq id no.1所示：(1)ljcda1的第25～30氨基酸替换为gi氨基酸；(2)ljcda1的第25～30氨基酸替换为ykrsps氨基酸；(3)ljcda1的第25～30氨基酸替换为lhyaeg氨基酸；(4)ljcda1的第125～136位氨基酸lyfenikrnqig替换为lyfcedrkaepeg氨基酸；(5)ljcda1的第125～136位氨基酸lyfenikrnqig替换为lyyfwdtdyqeg氨基酸；(6)ljcda1的第125～136位氨基酸lyfenikrnqig替换为iyddqgrcqe氨基酸；(7)ljcda1的第125～136位氨基酸lyfenikrnqig替换为iydkdravdhrg氨基酸。2.一种碱基编辑器cbe，其特征在于，所述碱基编辑器cbe为将权利要求1所述胞苷脱氨酶突变体融合于突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白。3.根据权利要求2所述的一种碱基编辑器cbe，其特征在于，所述突变型核酸酶选自nspcas9或其突变体，其中nspcas9的氨基酸序列如seq id no.2所示。4.根据权利要求3所述的一种碱基编辑器cbe，其特征在于，所述碱基编辑器cbe为将所述胞苷脱氨酶突变体融合于nspcas9的n-末端构建的cbe变体，所述nspcas9序列如seq id no.2所示。5.根据权利要求4所述的一种碱基编辑器cbe，其特征在于，所述nspcas9的c末端融合有入核信号nucleoplasmin nls，所述nucleoplasmin nls序列如seq id no.3所示。6.权利要求2-5中任一项所述碱基编辑器cbe的应用，其特征在于，所述碱基编辑器cbe介导c
·
g
‑‑
t
·
a突变，用于dna水平特定位点特定碱基的突变。7.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1所述胞苷脱氨酶突变体或编码权利要求2所述碱基编辑器cbe。8.一种载体，其特征在于，含有权利要求7所述的多核苷酸。9.一种宿主细胞，其特征在于，含利要求2所述碱基编辑器cbe，或含有权利要求8所述载体。10.一种试剂盒，其特征在于，包含用于构建权利要求1所述胞苷脱氨酶突变体或权利要求2所述碱基编辑器cbe的试剂。

技术总结
本发明属于基因编辑技术领域，涉及胞苷脱氨酶突变体及基于胞苷脱氨酶突变体构建的碱基编辑器。本发明通过在胞苷脱氨酶LjCDA1中引入不同突变，开发了新的胞苷脱氨酶突变体，通过将胞苷脱氨酶突变体融合于SpCas9为代表的突变型核酸酶的不同位点，得到的新融合蛋白，即碱基编辑器CBE，能对位于前间隔序列不同位置的胞嘧啶实现有效的C-T碱基突变。本发明所获得的CBE变体具有多样化C-T编辑碱基偏好性和活性窗口，相关的CBE变体其Cas非依赖的DNA脱靶效应和RNA脱靶效应均处于低水平甚至被清除。本发明可实现更广范围、更精细且安全性更高的C-T单碱基替换，能有效拓宽单碱基编辑工具的应用，具有很高的应用价值。具有很高的应用价值。具有很高的应用价值。


技术研发人员：程田林 张淑倩 邱佳怡 陈金龙
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2022.02.16
技术公布日：2023/8/28