广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株和生物杀虫剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物防治技术领域，特别涉及广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株和生物杀虫剂及其应用。


背景技术：

2.斜纹夜蛾(spodoptera litura)又称莲纹夜蛾，属鳞翅目夜蛾科，是一种世界性分布的杂食性害虫，该虫分布范围广，遍及我国各省份及亚洲、欧洲、非洲、大洋洲、美国等地，同时该虫食性极广，已知可危害的寄主植物达109科389种，涉及蔬菜、花卉、苗木、草坪等。莲纹夜蛾发育适温为29-30℃，成虫昼伏夜出，飞行能力强，具有趋光性和趋化性，对糖醋酒等发酵物尤为敏感。卵多成堆产于叶背的叶脉分叉处，初孵幼虫具有群集危害习性，3龄以后开始分散，老龄幼虫有昼伏性和假死性，当取食植物不足或不适宜时，幼虫可成群迁移至附近田块危害，故又被称为“行军虫”。
3.近年来随着农业机械化进程的加快，蔬菜、花卉等的种植面积越来越广，莲纹夜蛾的危害也日益猖獗，是我国农业生产上呈间歇性暴发为害的重要害虫，极大的危害了我国农业经济的发展，尤其是给白莲产业带来了巨大损失。江西省抚州市广昌县种植白莲历史悠久，自古以来就被称为“莲乡”。广昌白莲为有机食品，具有色白粒大、味甘清香、营养丰富、药用价值高等特点，是药食共用的优良保健食品，畅销海内外。莲纹夜蛾是广昌白莲的主要害虫之一，其取食白莲叶片，危害广昌白莲品质。低龄幼虫防治是防控广昌莲纹叶蛾的关键，目前多用化学药物防治广昌莲纹夜蛾幼虫，如：5％高效氯氰菊酯乳油、2.5％灭幼脲、25％马拉硫磷、10％吡虫啉可湿性粉剂、2.5％溴氰菊酯乳油、氯虫苯甲酰胺、虫酰肼、除虫脲等化学农药，一方面，化学防治往往达不到预期效果，另一方面，大量使用化学杀虫剂，容易造成环境污染、农药残留和人畜中毒等，也降低了广昌白莲的品质，不符合有机食品的栽种原则，因此，寻找高效、绿色、环保的生物防治方法逐渐成为研究的热点。
4.莲纹夜蛾核型多角体病毒(spodoptera litura multiple nuclear polyhedrosis virus，spltnpv)能有效控制莲纹夜蛾种群数量，通过莲纹夜蛾幼虫取食引起感染，病毒在虫体内大量增殖，使害虫染病致死，并在种群内传播流行，起到长期持续的害虫种群密度的自然控制作用。该病毒具有专一性强、对环境和其它生物安全无害的特点，因此，利用spltnpv开展生物防治，可以避免上述化学防治存在的相关问题，具有重要的经济、生态和环保价值。目前，spltnpv已有广州株、武汉株、日本株、菲律宾株和以色列株等相关报道。但大部分病毒株对昆虫的侵染率和致病力不高，在害虫的生物防治上还缺乏较好的控制能力，因此，分离筛选新的具有高毒力的毒株对于莲纹夜蛾的绿色、无公害防治具有重要意义和广阔的应用前景。


技术实现要素：

5.针对现有技术中莲纹夜蛾核型多角体病毒株毒力较低、生物防治效果不佳的问题，本发明提供了一种广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株，并提供了一种含有广昌莲纹夜蛾
核型多角体病毒的生物杀虫剂，以及提供了该病毒株和生物杀虫剂在莲纹夜蛾防治中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
6.本发明具体通过以下技术方案实现：
7.本发明的第一方面提供了一种广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株，保藏编号为cctcc no：v202294，于2022年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
8.本发明的莲纹夜蛾核型多角体病毒株在江西省抚州市广昌县发现，由疑似感染病毒死亡的广昌莲纹夜蛾幼虫虫尸中分离纯化得到。通过研磨虫尸、离心纯化，再次感染广昌莲纹夜蛾，感染病毒后的莲纹夜蛾幼虫食欲减退，幼虫死亡后，体内组织液化，表皮松弛易破，无臭味，呈典型“液化型”病症。取液化的莲纹夜蛾幼虫组织压片，可以观察到疑似多角体结构，经过再次样品纯化，电镜切片观察，初步判定该病原物属杆状病毒科核型多角体病毒属的一种病毒。
9.之后通过杆状病毒科lef-8、lef-9以及polh基因的通用引物对该病毒株的相应基因进行pcr扩增，并对扩增的条带进行测序。根据测序结果进行序列比对和系统发育分析，发现其与现存已知的其它莲纹夜蛾核型多角体病毒(spodoptera litura multiple nuclear polyhedrosis virus，spltnpv)不完全一致，因此，判定为一种新型的spltnpv病毒，并根据发现地广昌的汉语拼音首字母(guangchang)，命名为广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒(spodoptera litura multiple nuclear polyhedrosis virus-guangchang，spltnpv-gc)。
10.对本发明的spltnpv-gc病毒株进行莲纹夜蛾防治测试，当病毒浓度高于1
×
105pib/ml时，广昌莲纹夜蛾幼虫取食病毒后第4d开始死亡，半致死时间低于7d，半致死浓度为1.05
×
105pib/ml，比目前国内现有的其它spltnpv株(福建农业大学生物技术中心、广东省广州市生物防治站以及广东省农业科学院果树研究所)的半致死浓度更低，具有更强的毒力，而且是本地化病毒，对莲纹夜蛾防治专一性强。因此，本发明提供的spltnpv-gc对广昌莲纹夜蛾种群具有良好的控制作用，其施用成本低，具有不易产生抗性、环境友好、对天敌安全、在环境中滞留时间短等优点，在白莲田间容易形成病毒病而在莲纹夜蛾种群中流行，使得莲纹夜蛾种群密度得到持续控制，具有重要的经济、生态和环保价值，应用前景广阔。
11.本发明的第二方面提供了一种生物杀虫剂，包括如上所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株。
12.所述生物杀虫剂相对于现有技术的优势与如上所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
13.进一步地，还包括可接受的功能性助剂。
14.可接受的功能性助剂是指不干扰活性成分，即广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的生物活性的效力并在其施用的浓度下对机体(包括人体或动物体)不具有明显毒性的组分，包括溶剂、分散剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增效剂、增稠剂、消泡剂、悬浮剂、抗氧化剂、冻干剂、防腐剂、ph调节剂等中的任意一种或至少两种的组合。将上述组分用于微生物制剂是本领域所熟知的。如溶剂可包括水、和/或有机试剂，也包括由这些溶剂组成的混合物；再比如抗氧化剂可包括苯甲酸、抗坏血酸、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠
中的一种或或任意几种；ph调节剂可包括碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸、磷酸氢二钾、氢氧化钠、氨水中的一种或任意几种。通过前述可接受的功能性助剂可将本发明的生物杀虫剂制备成可湿性粉剂或油剂或水剂或悬浮剂。
15.进一步地，所述生物杀虫剂为水剂，所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒杀虫剂的浓度为1
×
105pib/ml至1
×
10
10
pib/ml。
16.更进一步地，所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的浓度为1
×
105pib/ml至1
×
108pib/ml。
17.本发明的第三方面提供了如上所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株或者如上所述的生物杀虫剂在防治莲纹夜蛾中的应用，尤其是防治广昌莲纹夜蛾中的应用。
18.所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株或者生物杀虫剂在防治莲纹夜蛾中的应用相对于现有技术的优势与如上所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
19.本发明的第四方面提供了如上所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的生产方法，包括以下步骤：
20.s1、以莲纹夜蛾为宿主，当莲纹夜蛾幼虫生长至4-6龄时，用含有如上所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的人工饲料喂饲宿主，喂饲24h后，换用不含病毒的所述人工饲料饲养，直至所述莲纹夜蛾全部死亡；
21.s2、收集患病死虫，使所述患病死虫分解形成悬液，过滤除渣，得到滤液，采用差速离心分离纯化所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株。
22.具体地，步骤s1中，所述人工饲料的配方包括以下质量配比的原料：白莲叶粉80-100g、熟黄豆粉80-100g、熟小麦粉80-100g、啤酒酵母粉10-20g、琼脂10-20g、复合维生素粉0.5-1.5g、尼泊金乙酯0.3-0.8g、乙酸(体积分数为36％，v/v)3-10ml，自来水600-1000ml。
23.可选地，人工饲料中所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的浓度为1
×
103pib/ml至1
×
108pib/ml，示例性地，可以为1
×
103pib/ml、1
×
104pib/ml、1
×
105pib/ml、1
×
106pib/ml、1
×
107pib/ml或1
×
108pib/ml等。
24.具体地，步骤s1中，饲养所述莲纹夜蛾幼虫的条件包括：温度为27
±
1℃，相对湿度80-90％，光周期l:d＝16:8，饲养所述莲纹夜蛾成虫的条件包括：温度20-32℃，相对湿度80-90％，自然光照。
25.具体地，步骤s2中，使所述患病死虫分解形成悬液的步骤包括：用无菌0.02m pbs缓冲液(ph7.2)浸泡所述患病死虫10min，激烈振荡或涡旋1min，形成所述悬液。
26.具体地，步骤s2中，采用差速离心分离纯化所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的步骤包括：以600rpm/min离心5min，取上清，再以6000rpm/min离心35min弃上清，重复数次，直至获得纯净的所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株。
27.本发明的优点及积极效果为：
28.本发明提供的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒(spltnpv)株为新发现的新型莲纹夜蛾核型多角体病毒株系，半致死浓度为1.05
×
105pib/ml，其毒力高于国内现有的其它spltnpv病毒株系，对广昌莲纹夜蛾种群防控效果优良，在莲纹夜蛾的防治以及相关高效生物杀虫剂的开发方面具有良好的应用前景。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明实施例1的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒的冷冻扫描电子显微镜图；
31.图2为本发明实施例1的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒的冷冻透射电子显微镜图；
32.图3为本发明实施例1的基于lef-8基因序列的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒系统发育进化树；
33.图4为本发明实施例1的基于lef-9基因序列的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒系统发育进化树；
34.图5为本发明实施例1的基于polh基因序列的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒系统发育进化树；
35.图6为本发明实施例2的不同广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒浓度饲养下宿主种群感染致死的生存曲线。
具体实施方式
36.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
37.根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
38.为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。
39.在以下实施例中，广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒(spltnpv-gc)株分离自江西省抚州市广昌县白莲田的广昌莲纹夜蛾幼虫自然死亡的虫尸，供试广昌莲纹夜蛾幼虫为本实验室采集并按照本发明所述方法饲养的健康广昌莲纹夜蛾幼虫，养虫器皿为禧天龙迷你收纳盒。
40.用于培养本发明提供的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒(spltnpv-gc)的人工饲料为自行配制，配方包括以下质量配比的原料：白莲叶粉80-100g、熟黄豆粉80-100g、熟小麦粉80-100g、啤酒酵母粉10-20g、琼脂10-20g、复合维生素粉0.5-1.5g、尼泊金乙酯0.3-0.8g、乙酸(体积分数为36％，v/v)3-10ml，自来水600-1000ml。配制方法包括：先将白莲叶
粉、黄豆粉、小麦粉蒸熟，然后将琼脂和自来水高温处理，使琼脂完全溶化，趁热加入尼泊金乙酯和乙酸，搅拌均匀加入黄豆粉、小麦粉和酵母粉，不断搅拌，待温度降至60℃左右时加入复合维生素，搅拌均匀后立即进行分装。
41.需要说明的是，以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件或本领域常规的试验方法。
42.实施例1spltnpv-gc病毒的分离、增殖、提取及鉴定
43.用已灭菌的0.02m pbs缓冲液(ph 7.2)稀释spltnpv-gc病毒原液(分离自江西省抚州市广昌县白莲田广昌莲纹夜蛾幼虫自然死亡的虫尸)至病毒浓度为1
×
106pib/ml，之后用塑料喷壶喷洒到人工饲料上，待饲料稍干后放入禧天龙迷你收纳盒内，接入采集的2-3龄广昌莲纹夜蛾幼虫，控制饲养温度为27
±
1℃，相对湿度80％～90％，光周期l:d＝16:8，饲养48h后换上新鲜的人工饲料。饲养期间每日观察，可以看到广昌莲纹夜蛾幼虫感染病毒后食欲减退，行动迟缓，显病幼虫呈黄褐、灰褐或黑褐色，幼虫死亡后，躯体变软，体内组织液化，表皮松弛易破，流出乳白色至褐色脓汁，无臭味，呈典型“液化型”病症。
44.及时取出病死广昌莲纹夜蛾幼虫置4℃冰箱保存，广昌莲纹夜蛾幼虫感染spltnpv-gc病毒死亡后，用光学显微镜镜检可见病毒多角体，之后进一步取液化的广昌莲纹夜蛾幼虫血细胞和脂肪组织压片，可以观察到在细胞核内增殖的核型多角体病毒。
45.用无菌0.02m pbs缓冲液(ph 7.2)浸泡患病死虫10min，激烈振荡或涡旋1min，以3层纱布过滤，将滤液进行差速离心，先以600rpm/min离心5min，取上清，后以6000rpm/min离心35min弃上清，重复前述步骤数次，直至获得较纯净的病毒，随后以0.02m pbs缓冲液(ph7.2)重悬，得到病毒悬液，病毒悬液置4℃冰箱保存。
46.将纯化的病毒迅速用电镜专用戊二醛进行固定，用0.1m的pbs漂洗后，用1％四氧化锇后固定；之后再次用0.1m的pbs漂洗，用30％-100％丙酮梯度脱水；然后用环氧树脂包埋、聚合；接着半薄切片定位，超薄切片机切片；最后用醋酸铀和梓檬铅溶液双染色后将制好的切片铜网置于200kv冷冻扫描电子显微镜和200kv冷冻透射电子显微镜fei tecnai g20下，加速电压为200v，拍摄电镜照片，结果如图2-3所示。
47.图2中可见折光性较强的在细胞核内增殖的核型多角体病毒，经中科院武汉病毒研究所电镜室进行超薄切片电镜鉴定，此多角体病毒为不规则多面体，呈五边形至近圆形。病毒粒子杆伏，单粒包埋于蛋白质中，见图3。根据感病幼虫的病症，多角体和病毒粒子的形态与大小，按照国际病毒分类委员会第四次报告，经鉴定该病毒属杆状病毒科，为核型多角体病毒。
48.提取病毒基因组dna，通过杆状病毒lef-8、lef-9以及polh基因的通用引物对本发明提供的spltnpv-gc的相应基因进行pcr扩增，随后对扩增的条带进行测序。根据测序结果，采用mega7.0软件构建部分杆状病毒lef-8、lef-9和polh基因的系统发育进化树，对spltnpv-gc病毒的系统发育进行分析(分别见图3、图4和图5)。测序所得的lef-8、lef-9和polh基因的序列分别如下所示：
49.spltnpv-gc lef8部分基因序列：
50.gaagggggggcggggcaagtttttcttgtgtcgagacgtgcggcttccaaacgtcgattacgaatctatagcgaaaaaattaaaagatttaatcgaatcaaatctgattgtgcggcgcgacgaggacgacgaaagcggcaacgagtccaagtattcgggcggcggcggcggcggcggtgcatgatgacgaatggtagaccatcgctttcaataatagacc
tacgacgttttcgtgcaaacgaaagcatcaagtgcgcatcgtgtacgagtttaaacgcaaacggtttcccgtcgagatcaaacttaaattttaaattctatttgtcaatcatcacgaaggcatgatatgtatacgcaaacatattcaaaaaaacgacaaagttaacatttcggctctgctcactccgtacgagtaccacaacggcgaatctattgttgctcaaatcaaagctcggatcgtcgacgctgatcatgtttctgcgctaatgtccaagacgcttcaatactattaccgatcgcatctgcacattttccctacgatacccgtgccaaaatagatcgtgtccgtgacaaatttgaaaaacgcaatgcccgtaatcgagtacgacgacgtcgaatggaacgagaaccgcgagaggttcattagaaacctgcctgtcggcaattccgtggtggcgagccgtagctcggttcacaacaataaaatgataaatttgtggactctggtgcgagacagccgactcatgaccgccgaagatccctacatgtgtgaaattgtaaattcgccctctaactacaaataa(见seq id no：1)；
51.spltnpv-gc lef9部分基因序列：
52.aaaaacggttacgcgggacaatatttgtactctacctttaaaaacacggcttcgttctacgcaaacgttcagcgcatcaacgctaccaacgagattgttccaccaaaggcgagcgtgccccgctactacggccgagacgtgagtttgcttcgcgcaaggacgacccgtcatggcaacatatctcagttgagcactcaggtattcaacgtccgcgaggctgccgactacgaagactggaacatcttgatcggtctcggcacgttcaccggacctaatcgcgactgcgacggtgacaa(见seq id no：2)；
53.spltnpv-gc polh部分基因序列：
54.gggggccctgatctgaccgagcgacacttcgagaaggatctcctcctcttcagccgagtcggtgcccacgtacacgatgggcttgtaaaagctgtaccatatcaccttgtcgatgaagctctcgaacgacgtggtgtattcggcgtgcacgttcatcacgggacaattgccgcccttcttagccagactgatgcggtattcgttattggtcgggacgtacgacggttctacaatacggatcacgtcgtgaggtccgtactcgggaacgcatcggagcacgtgctgcggaaaaaatcaaaagcaacggttcggtctagtgggacgcatgtttaccactttaaaaacgtccatc acttcttgatcgtttacgatggggaagctgtcttccataaagcgagtccaagtctcgcgcagaaactctttaccgttccaattgacgatcagcttcatcgtgtcgggcttcacgttacgaatctctttgaacagagtcaacttttgatttttaccaggacccatgaacggatcctccgcacgttactagaaaaaaacccttaaaa(见seq id no：3)。
55.根据序列比对和系统发育分析结果，本发明提供的spltnpv-gc病毒与现存已知的其它spltnpv不完全一致，判定为一种新型(spodoptera litura multiple nuclear polyhedrosis virus，spltnpv)病毒，并根据发现地广昌的汉语拼音首字母(guangchang)，命名为spltnpv-gc。
56.保藏说明：上述所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒(spodoptera litura multiple nuclear polyhedrosis virus-guangchang，spltnpv-gc)株的保藏编号为：cctcc no：v202294，保藏日期为：2022年11月1日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，分类命名为：广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒(spodoptera litura multiple nuclear polyhedrosis virus)。
57.实施例2spltnpv-gc防控莲纹夜蛾性能测试
58.将spltnpv-gc病毒以0.02m pbs缓冲液(ph 7.2)进行梯度稀释，稀释至病毒终浓度为1
×
108pib/ml、1
×
107pib/ml、1
×
106pib/ml、1
×
105pib/ml、1
×
104pib/ml和1
×
103pib/ml6个浓度。用每个浓度的spltnpv病毒液分别浸泡自制人工饲料，晾干，进行喂饲实验。每个浓度作为一组，每组放入一定数量的广昌莲纹夜蛾幼虫，分别放在已消毒的容器内用湿纱布扎紧封口，用0.02m的pbs作对照，每组平行重复2次。感染24h后加入新鲜清洁叶片继续饲养。按试验要求进行观察记载，并计算死亡率以及计算不同病毒浓度的半致死时
间(median lethal time，lt50)，所得数据应用spss软件进行方差分析，结果如图6所示。
59.当病毒浓度为1
×
108pib/ml、1
×
107pib/ml、1
×
106pib/ml以及1
×
105pib/ml时，广昌莲纹夜蛾幼虫取食病毒后4d开始死亡；当病毒浓度为1
×
104pib/ml时，广昌莲纹夜蛾幼虫取食病毒后7d开始死亡；当病毒浓度为1
×
103pib/ml时，广昌莲纹夜蛾幼虫取食病毒后9d开始死亡。广昌莲纹夜蛾幼虫死亡率随着感染剂量增加而相应提高，病毒浓度为1
×
108pib/ml感染广昌莲纹夜蛾幼虫后第6d其死亡率达到100％，半致死时间为5d；病毒浓度为1
×
107pib/ml感染广昌莲纹夜蛾幼虫后第15d其死亡率为83.33％，半致死时间为6d；病毒浓度为1
×
106pib/ml感染广昌莲纹夜蛾幼虫后第15d其死亡率为58.33％，半致死时间为7d；病毒浓度为1
×
105pib/ml感染广昌莲纹夜蛾幼虫后第15d其死亡率为43.75％；病毒浓度为1
×
104pib/ml浓度感染广昌莲纹夜蛾幼虫后第15d其死亡率为35.42％；病毒浓度为1
×
103pib/ml浓度感染广昌莲纹夜蛾幼虫后第15d其死亡率为27.08％。
60.实施例3spltnpv-gc培养条件的确定
61.将spltnpv-gc病毒用0.02m pbs缓冲液(ph 7.2)进行梯度稀释，稀释至病毒终浓度为1
×
107pib/ml、1
×
106pib/ml、1
×
105pib/ml、1
×
104pib/ml、1
×
103pib/ml和1
×
102pib/ml6个浓度。分别选取4、5和6龄广昌莲纹夜蛾幼虫各300头，将人工饲料切为约0.5cm
×
0.5cm
×
0.5cm的小块，每块人工饲料滴入10μl稀释好的病毒，每个病毒浓度喂饲一个龄期的广昌莲纹夜蛾幼虫50头，从第2d开始喂饲不含病毒的人工饲料，控制饲养温度为27
±
1℃，相对湿度80％-90％，光周期l:d＝16:8，饲养至广昌莲纹夜蛾幼虫全部死亡。期间每天注意观察，及时取出病死广昌莲纹夜蛾幼虫置4℃冰箱保存。待广昌莲纹夜蛾幼虫全部死亡后，收集患病死虫(虫尸)，用已灭菌的0.02m的pbs缓冲液(ph 7.2)浸泡10min，激烈振荡或涡旋1min，用3层纱布过滤，先以600rpm/min离心5min，取上清，再以6000rpm/min离心35min弃上清。差速离心数次，直至获得较纯净的spltnpv-gc病毒为止，随后以10ml0.02m的pbs缓冲液悬浮。在光学显微镜下，用血球计数板计数，计算不同龄期广昌莲纹夜蛾幼虫单头的平均产毒量，结果如表1所示。
62.表1spltnpv-gc在不同龄期莲纹夜蛾中增殖情况
[0063][0064]
注：
“‑”
表示未测得数据。
[0065]
由表1可知，用1
×
105pib/ml浓度的spltnpv-gc病毒喂饲5龄或6龄广昌莲纹夜蛾来生产spltnpv都可以达到生产要求。天然饲料受到气候、品种等自然条件影响较大，本发明采用自制的人工饲料饲养广昌莲纹夜蛾幼虫不受季节、寄主、土地等自然条件的限制，可常年饲养；同时能够减少或避免微生物感染及农药等因子的干扰，易获得生理标准整齐一
致的实验用虫，从而为spltnpv-gc的工厂化生产创造便利。
[0066]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株，其特征在于，保藏编号为cctcc no：v202294。2.一种生物杀虫剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株。3.根据权利要求2所述的生物杀虫剂，其特征在于，还包括可接受的功能性助剂，所述功能性助剂包括溶剂、分散剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增效剂、增稠剂、消泡剂、悬浮剂、抗氧化剂、冻干剂、防腐剂、ph调节剂中的一种或多种。4.根据权利要求2所述的生物杀虫剂，其特征在于，所述生物杀虫剂为水剂，所述水剂中所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的浓度为1
×
105pib/ml至1
×
10
10
pib/ml。5.如权利要求1所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株或如权利要求2-4任一项所述的生物杀虫剂在防治莲纹夜蛾中的应用，其特征在于，所述莲纹夜蛾为广昌莲纹夜蛾。6.一种广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的生产方法，其特征在于，用于生产如权利要求1所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株，包括以下步骤：s1、以莲纹夜蛾为宿主，当莲纹夜蛾幼虫生长至5-6龄时，用含有如上所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的人工饲料喂饲宿主，喂饲24h后，换用不含病毒的所述人工饲料饲养，直至所述莲纹夜蛾全部死亡；s2、收集患病死虫，使所述患病死虫分解形成悬液，过滤除渣，得到滤液，采用差速离心分离纯化所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株。7.根据权利要求6所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的生产方法，其特征在于，步骤s1中，所述人工饲料的配方包括以下质量配比的原料：白莲叶粉80-100g、熟黄豆粉80-100g、熟小麦粉80-100g、啤酒酵母粉10-20g、琼脂10-20g、复合维生素粉0.5-1.5g、尼泊金乙酯0.3-0.8g、36％乙酸3-10ml，自来水600-1000ml；所述人工饲料中所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的浓度为1
×
105pib/ml。8.根据权利要求7所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的生产方法，其特征在于，步骤s1中，饲养所述莲纹夜蛾幼虫的条件包括：温度为27
±
1℃，相对湿度80-90％，光周期l:d＝16:8，饲养所述莲纹夜蛾成虫的条件包括：温度20-32℃，相对湿度80-90％，自然光照。9.根据权利要求7所述的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的生产方法，其特征在于，步骤s2中，使所述患病死虫分解形成悬液的步骤包括：用无菌0.02m pbs缓冲液浸泡所述患病死虫10min，激烈振荡或涡旋1min，形成所述悬液；采用差速离心分离纯化所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的步骤包括：以600rpm/min离心5min，取上清，再以6000rpm/min离心35min弃上清，重复数次，直至获得纯净的所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株。

技术总结
本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株和生物杀虫剂及其应用。所述广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株的保藏编号为CCTCC NO：V202294。本发明提供的广昌莲纹夜蛾核型多角体病毒株为新发现的新型莲纹夜蛾核型多角体病毒株系，半致死浓度为1.05


技术研发人员：王建国 郑兴汶 杨良波 揭志辉 徐业 唐记平 徐金星
受保护的技术使用者：广昌县白莲产业发展中心
技术研发日：2023.02.28
技术公布日：2023/8/28