一种针对有机磷脑中毒救治的脑部靶递运生物蛋白酶的纳米药物

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种能将具有生物活性的大分子药物高效输运至中枢神经系统并快速释放用于治疗脑部急性中毒救治的中枢靶向型生物活性纳米药物，还涉及该药物的制备方法


背景技术：

2.为了将生物活性大分子药物递运进中枢，首先必须考虑血脑屏障(bbb)的作用。bbb是一种特殊的生理屏障，它是隔绝中枢神经系统与外周血液循环的重要屏障。bbb通过多种机制调节中枢神经系统的动态平衡，严格控制小分子或大分子从血液循环进入中枢。该结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，但同时也阻碍了治疗中枢神经系统疾病的药物在脑内达到有效血药浓度。98％的小分子药物和几乎100％的大分子药物不可通过血脑屏障进入中枢。
3.分子通过血脑屏障有几种途径：一些小的亲水和亲脂分子可以通过扩散进入大脑；其他如氨基酸、多肽等物质可通过载体介导的转运、受体介导的转运和吸附介导的转运进入大脑。基于此，目前将药物递运进中枢的策略主要集中在对药物分子化学修饰及结构改造，和借助药物转运载体两个方面，如增加分子的亲脂性基团、减少分子的正电荷基团、修饰受体靶向的单克隆抗体、借助各种病毒载体以及非病毒载体将药物制成纳米颗粒等，但是这些方法仅适用于小分子药物的中枢递运，对于分子量大且具有生物活性的药物如何实现有效的中枢给药，目前的研究寥寥无几。
4.有机磷神经毒剂是迄今为止人类设计的最致命的毒剂之一，这类毒剂对乙酰胆碱酯酶(ache)的活性有强烈的抑制作用，导致乙酰胆碱在突触或神经肌肉接头处大量蓄积，从而引起中枢和外周胆碱能神经功能严重紊乱
5.对于神经性毒剂中毒救治，最重要的措施之一是重活化，即使用重活化剂使磷酰基从中毒酶的结合部位脱落下来，恢复乙酰胆碱酯酶的水解活性。目前常用的重活化剂多为肟类化合物，如氯磷定、双复磷、双磷定、酰胺磷定(hi-6)等，其分子结构中均含有肟基和季铵氮，它们能大大加速脱磷酰基反应的速度，加速酶活性的恢复。
6.但目前应用重活化剂救治神经性毒剂中毒存在以下几个方面的问题：一是乙酰胆碱酯酶重活化剂的季铵盐结构限制了药物通过血脑屏障到达中枢，导致此类药物对外周组织和血液中的中毒酶有较好的重活化效果，但是很难在中枢发挥作用；二是每种重活化剂的治疗范围有限，缺少一种针对所有g类、v类神经性毒剂均有重活化作用的广谱性重活化剂；三是神经毒剂中毒酶一旦老化之后就无法复活，梭曼的老化速度最快，而且几乎无自动恢复现象，因此重活化剂对梭曼中毒疗效较差。
7.目前尚无有关将蛋白质、酶类等大分子生物活性材料递运进中枢的相关研究报道，也无有关可对抗梭曼老化并且具有中枢靶向性和广谱性的新型重活化剂的新型重活化剂。


技术实现要素：

8.本发明的目的之一在于提供一种跨血脑屏障、可将大分子生物活性药物递运进中枢，用于补充和替换中枢因中毒被破坏生理活性的蛋白或酶，实现快速、高效、广谱中毒救治的一种中枢靶向的生物活性纳米药物。其能使分子量大的生物活性药物如蛋白等穿透血脑屏障，合成方法简便高效，治疗范围广并能对抗目前任何一种药物都不能解决的有机磷中毒老化问题，覆盖所有类型的有机磷神经毒剂，并为神经性毒剂中枢中毒提供一种新型的治疗药物。本发明的又一目的在于提供该纳米药物的制备方法及用途。
9.为实现上述目的，本发明第一方面涉及一种纳米药物，其为以脂质体为载体，并包载药物的纳米颗粒，其中脂质体材料优选1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(pops)。
10.本发明第一方面的一些实施方式中，所述载体为具有穿透血脑屏障作用、靶向中枢的pops脂质体；所述包载药物为乙酰胆碱酯酶。
11.本发明第一方面的一些实施方式中，所述的pops，为一种脂质体材料，该材料的相变温度为14℃，合成的脂质体具有比dppc更好的中枢靶向能力和释放速率。
12.本发明第一方面的一些实施方式中，所述的乙酰胆碱酯酶分子量约为280kda，将其纳米化后可穿透血脑屏障，直接补充中枢神经系统的乙酰胆碱酯酶含量，恢复水解乙酰胆碱的功能，减少有机磷神经毒剂中毒后中枢乙酰胆碱的蓄积。
13.本发明第一方面的一些实施方式中，所述的纳米粒子为球形，粒径约150-200nm。
14.本发明的第二方面涉及一种纳米药物的制备方法，包括以下制备步骤：
15.1)称取2.383g 4-羟基哌嗪乙磺酸(hepes)，加入1l蒸馏水，配制成浓度为10mm的hepes缓冲液，
16.2)将30mg乙酰胆碱酯酶溶解于10ml hepes溶液中，配制10ml 3mg/ml乙酰胆碱酯酶hepes溶液，4℃冷藏备用。
17.3)将1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸和氯仿按照摩尔比1:4溶解在梨形烧瓶中，然后在真空下用旋转蒸发器将溶剂蒸发，使脂质体材料在器壁上形成薄膜。
18.4)用配制好的乙酰胆碱酯酶hepes溶液对脂质膜进行超声水化处理,室温搅拌4小时。
19.5)0.2μm微孔膜(millex-gp、slgp 033rs、milli孔隙)挤出悬浮液10-15次，可获得尺寸均一的脂质体药物。
20.6)使用挤推法获得尺寸均一的纳米药物。
21.本发明的第三方面涉及本发明的第一方面所述的纳米药物在对抗有机磷神经性毒剂中毒中的应用。
22.本发明第三方面的一些实施方式中，所述的有机磷神经性毒剂优选为目前最为常见的四大经典有机磷化合物沙林、梭曼、vx和塔崩。
23.本发明取得的有益效果：
24.1.本发明制备的纳米药物粒径均一，电位稳定。本发明的ache-pops-lps纳米药物适用于所有类型na中枢中毒的救治，具有良好的广谱性。
25.2.本发明ache-pops-lps纳米药物通过中枢靶向纳米递运系统往中枢直接补充ache的治疗方案能大幅的提升中枢酶的活性，从根本上克服不同毒剂所带来的特异性的影响，对vx、沙林、梭曼、塔崩四种毒剂中枢中毒酶的重活化率均在45％以上，是目前所有重活
化剂均达不到的效果。
26.3本发明ache-pops-lps纳米药物，有效的解决了以梭曼毒剂为代表的有机磷化合物老化的治疗。梭曼中毒后迅速的老化，老化后的中毒酶无法再通过重活化剂等药物进行恢复，而采用ache-pops-lps纳米药物，则能够直接在中枢补充新鲜的ache，从而恢复胆碱能系统的稳定。
附图说明
27.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
28.图1为实施例1中纳米药物ache-pops-lps的tem照片；
29.图2为实施例1中纳米药物ache-pops-lps的粒径分布图；
30.图3为实施例2中纳米药物ache-dmps-lps的tem照片；
31.图4为实施例3中纳米药物ache-dpps-lps的tem照片；
32.图5为实施例4中纳米药物ache-dppc-lps的tem照片；
33.图6为实施例5中给予fitc-ache药物的bend.3细胞不同时间对fitc的摄取激光共聚焦显微镜图；
34.图7为实施例5中给予fitc-ache-pops-lps药物的bend.3细胞不同时间对fitc的摄取激光共聚焦显微镜图；
35.图8为实施例6中fitc-ache-dir-pops-lps与cy7-ache-pops-lps组在750nm激发波长下进行拍照；
36.图9为实施例6中cy7-ache-pops-lp组在750nm波长下的器官荧光；
37.图10为实施例6中小鼠给予fitc和dir染色纳米药物的脑荧光显微镜图(20
×
)，蓝色为dapi标记的细胞核，绿色为fitc发射的荧光，红色为dir发射的荧光；
38.图11为实施例6中小鼠给予fitc和dir染色纳米药物的心脏荧光显微镜图(20
×
)，蓝色为dapi标记的细胞核，绿色为fitc发射的荧光，红色为dir发射的荧光；
39.图12为实施例6中小鼠给予fitc和dir染色纳米药物的肝荧光显微镜图(20
×
)，蓝色为dapi标记的细胞核，绿色为fitc发射的荧光，红色为dir发射的荧光；
40.图13为实施例6中小鼠给予fitc和dir染色纳米药物的脾荧光显微镜图(20
×
)，蓝色为dapi标记的细胞核，绿色为fitc发射的荧光，红色为dir发射的荧光；
41.图14为实施例6中小鼠给予fitc和dir染色纳米药物的肺荧光显微镜图(20
×
)，蓝色为dapi标记的细胞核，绿色为fitc发射的荧光，红色为dir发射的荧光；
42.图15为实施例6中小鼠给予fitc和dir染色纳米药物的肾荧光显微镜图(20
×
)，蓝色为dapi标记的细胞核，绿色为fitc发射的荧光，红色为dir发射的荧光；
43.图16为实施例7中小鼠给予荧光标定蛋白药物的脑部荧光随时间变化图*p＜0.05，****p＜0.0001(n＝8)；
44.图17为实施例8中梭曼染毒后给予不同救治药物的ache重活化率图**p＜0.01，****p＜0.0001
45.图18为实施例8中沙林、塔崩、vx染毒后给予不同救治药物的ache重活化率图a：沙林；b：塔崩；c：vx，各毒剂重活化率与hi-6组比较，**p＜0.01，****p＜0.0001.
46.图19为实施例9中梭曼染毒后，老化30分钟后给予不同救治药物的脑ache重活化率图。
具体实施方式
47.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
48.下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
49.实施例1：基于pops的纳米药物的制备
50.称取2.383g 4-羟基哌嗪乙磺酸(hepes)，加入1l蒸馏水，配制成浓度为10mm的hepes缓冲液，将30mg乙酰胆碱酯酶溶解于10mlhepes溶液中，配制10ml 3mg/ml乙酰胆碱酯酶hepes溶液，4℃冷藏备用。将1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(pops)用氯仿按照摩尔比1:4溶解在梨形烧瓶中，然后在真空下用旋转蒸发器将溶剂蒸发，使脂质体材料在器壁上形成薄膜。用配制好的乙酰胆碱酯酶hepes溶液对脂质膜进行超声水化处理,室温搅拌4小时，随后采用超声仪尽心超声乳化处理，对乳液采用0.2μm微孔膜(millex-gp、slgp 033rs、milli孔隙)挤出悬浮液10-15次，可获得尺寸均一的脂质体纳米药物。
51.形态观察：取ache-pops-lps 100μl，用hepes缓冲液稀释10倍，滴在铜网上固定10min，然后将1％的醋酸双氧铀滴于铜网上进行负染，静置1～2min后吸去多余液体，自然晾干后置于tem下观察。
52.粒径、分散指数(pdi)及zeta电位测定：取纳米药物10μl，加入1ml hepes缓冲液充分稀释，用nanosight测量粒径，绘制粒径分布图。用动态光散射法在zeta粒径分布仪上测定pdi和zeta电位。
53.实验结果：
54.经tem检测结果显示，纳米药物ache-pops-lps在电镜下呈现球型(图1)。纳尺寸在约为140nm(图1)，小于理论上纳米药物能够通过血脑屏障的最大尺寸(250nm)；分散系数(pdi)《0.2，表明纳米药物的尺寸均一，分散良好，带负电荷(表1)。
55.表1纳米药物的粒径、pdi及zeta电位(n＝3)
[0056][0057][0058]
实施例2：基于dmps的尺寸100-200nm纳米药物的制备
[0059]
称取2.383g 4-羟基哌嗪乙磺酸(hepes)，加入1l蒸馏水，配制成浓度为10mm的hepes缓冲液，将30mg乙酰胆碱酯酶溶解于10mlhepes溶液中，配制10ml 3mg/ml乙酰胆碱酯酶hepes溶液，4℃冷藏备用。将1,2-二十四烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(dmps)用氯仿按照摩尔比1:4溶解在梨形烧瓶中，然后在真空下用旋转蒸发器将溶剂蒸发，使脂质体材料在器壁上形成薄膜。用配制好的乙酰胆碱酯酶hepes溶液对脂质膜进行超声水化处理,室
温搅拌4小时，随后采用超声仪尽心超声乳化处理，对乳液采用0.2μm微孔膜(millex-gp、slgp 033rs、milli孔隙)挤出悬浮液10-15次，可获得尺寸均一的脂质体纳米药物。
[0060]
形态观察：取ache-dmps-lps 100μl，用hepes缓冲液稀释10倍，滴在铜网上固定10min，然后将1％的醋酸双氧铀滴于铜网上进行负染，静置1～2min后吸去多余液体，自然晾干后置于tem下观察。
[0061]
经tem检测结果显示，纳米药物ache-dmps-lps在电镜下呈现近圆形颗粒状(图3)，纳尺寸在约为140nm。
[0062]
实施例3：基于dpps的尺寸100-200nm纳米药物的制备
[0063]
称取2.383g 4-羟基哌嗪乙磺酸(hepes)，加入1l蒸馏水，配制成浓度为10mm的hepes缓冲液，将30mg乙酰胆碱酯酶溶解于10mlhepes溶液中，配制10ml 3mg/ml乙酰胆碱酯酶hepes溶液，4℃冷藏备用。将1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(dpps)用氯仿按照摩尔比1:4溶解在梨形烧瓶中，然后在真空下用旋转蒸发器将溶剂蒸发，使脂质体材料在器壁上形成薄膜。用配制好的乙酰胆碱酯酶hepes溶液对脂质膜进行超声水化处理,室温搅拌4小时，随后采用超声仪尽心超声乳化处理，对乳液采用0.2μm微孔膜(millex-gp、slgp 033rs、milli孔隙)挤出悬浮液10-15次，可获得尺寸均一的脂质体纳米药物。
[0064]
形态观察：取ache-dpps-lps 100μl，用hepes缓冲液稀释10倍，滴在铜网上固定10min，然后将1％的醋酸双氧铀滴于铜网上进行负染，静置1～2min后吸去多余液体，自然晾干后置于tem下观察。
[0065]
经tem检测结果显示，纳米药物ache-dpps-lps在电镜下呈现球型(图4)，纳尺寸在约为140nm。
[0066]
实施例4：基于dppc的尺寸100-200nm纳米药物的制备
[0067]
称取2.383g 4-羟基哌嗪乙磺酸(hepes)，加入1l蒸馏水，配制成浓度为10mm的hepes缓冲液，将30mg乙酰胆碱酯酶溶解于10mlhepes溶液中，配制10ml 3mg/ml乙酰胆碱酯酶hepes溶液，4℃冷藏备用。将1,2-双十六酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dppc)用氯仿按照摩尔比1:4溶解在梨形烧瓶中，然后在真空下用旋转蒸发器将溶剂蒸发，使脂质体材料在器壁上形成薄膜。用配制好的乙酰胆碱酯酶hepes溶液对脂质膜进行超声水化处理,室温搅拌4小时，随后采用超声仪尽心超声乳化处理，对乳液采用0.2μm微孔膜(millex-gp、slgp 033rs、milli孔隙)挤出悬浮液10-15次，可获得尺寸均一的脂质体纳米药物。
[0068]
形态观察：取ache-dppc-lps 100μl，用hepes缓冲液稀释10倍，滴在铜网上固定10min，然后将1％的醋酸双氧铀滴于铜网上进行负染，静置1～2min后吸去多余液体，自然晾干后置于tem下观察。
[0069]
经tem检测结果显示，纳米药物ache-dppc-lps在电镜下呈现球型(图5)，纳尺寸在约为140nm。
[0070]
实施例5：纳米药物的中枢靶向性细胞水平评价
[0071]
荧光标记纳米药物制备：称取ache 100mg，溶解于8ml hepes缓冲液中，称取fitc 2mg，溶解于2ml hepes缓冲液中，混合后总体积为10ml，避光冰浴搅拌4-5h得到fitc-ache溶液；将fitc-ache溶液倒入透析袋中，再将透析袋置于盛有1l hepes缓冲液的大烧杯中，4℃避光进行透析，烧杯中的pbs缓冲液每隔2～3h置换一次，至烧杯中的hepes缓冲液澄清时中止透析，收集透析袋中的fitc-ache溶液，记录体积以便计算浓度，用hepes缓冲液将其稀
释到3mg
·
ml-1分装冻存于-20℃备用；称取0.1mmol pops，加入10ml氯仿溶解，然后用旋转蒸发仪将溶剂蒸发除去，使脂质体材料在烧瓶壁上形成一层磷脂薄膜；取前述合成的fitc-ache溶液20ml，取10ml备用，其余10ml加入瓶中后，对脂质膜进行超声水化处理,得到的纳米药物混悬液冰浴条件下搅拌2～4h后，用脂质体挤出仪在20℃下将混悬液通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜经往复挤压10～12次，得到粒径分布均匀的装载fitc-ache的pops纳米药物(fitc-ache-pops-lps),于4℃保存备用。
[0072]
bend.3细胞对fitc-ache和fitc-ache-pops-lps的摄取：将1.1.2.1中合成的fitc-ache和fitc-ache-pops-lps用10％ fbs的dmem-hg培养基稀释10倍，分别加入培养皿中与细胞孵育不同时间(0.5h、1h、2h)后弃去上清，用冷的pbs冲洗，细胞用4％多聚甲醛固定15min后用pbs清洗，随后每孔加入100μl dapi染液常温孵育，10min后弃去dapi，用pbs反复轻柔冲洗，激光共聚焦显微镜在ex405 nm/em488 nm激发波段下观察荧光。
[0073]
实验结果：采用共聚焦显微镜观察bend.3细胞不同时间段内对荧光标记纳米药物的摄取情况对纳米药物的中枢靶向性进行定性评价。结果表明，fitc-ache与bend.3孵育不同时间后，细胞内均无绿色荧光(图6)；而fitc-ache-pops-lps与bend.3孵育0.5h后细胞内即可见绿色荧光(图7)，之后随孵育时间延长绿色荧光加强。
[0074]
实施例6：纳米药物的中枢靶向性动物水平评价
[0075]
荧光标记装载蛋白的纳米药物制备：称取ache 100mg，溶解于8ml hepes缓冲液中，称取cy7-nhs 2mg，溶解于2ml hepes缓冲液中，混合后总体积为10ml，避光冰浴搅拌4-5h得到cy7-ache溶液；将cy7-ache溶液倒入透析袋中，再将透析袋置于盛有1l hepes缓冲液的大烧杯中，4℃避光进行透析，烧杯中的pbs缓冲液每隔2～3h置换一次，至烧杯中的hepes缓冲液澄清时中止透析，收集透析袋中的cy7-ache溶液，记录体积以便计算浓度，用hepes缓冲液将其稀释到3mg
·
ml-1
分装冻存于-20℃备用；称取0.1mmol pops，加入10ml氯仿溶解，然后用旋转蒸发仪将溶剂蒸发除去，使脂质体材料在烧瓶壁上形成一层磷脂薄膜；取前述合成的cy7-ache溶液20ml，取10ml备用，其余10ml加入瓶中后，对脂质膜进行超声水化处理,得到的纳米药物混悬液冰浴条件下搅拌2～4h后，用脂质体挤出仪在20℃下将混悬液通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜经往复挤压10～12次，得到粒径分布均匀的装载cy7-ache的pops纳米药物(cy7-ache-pops-lps),于4℃保存备用。
[0076]
荧光标记脂质体膜的纳米药物的制备：称取1mg dir溶解于10ml氯仿中配制0.1mg
·
ml-1
dir溶液；称取0.05mmol pops溶解于5ml上述dir溶液，然后旋转蒸发将溶剂蒸发除去，使脂质体材料与dir混合后在烧瓶壁上形成一层磷脂薄膜；取前述合成的fitc-ache溶液5ml对脂质膜进行超声水化处理，超声仪中超声1～2min后得到纳米药物混悬液，冰浴条件下搅拌2～4h，后用脂质体挤出仪将混悬液通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜经往复挤压10～12次，得到装载fitc-ache的dir标记的pops纳米药物(fitc-ache-dir-pops-lps)。
[0077]
活体成像与器官荧光：km小鼠随机分组，给予合成的纳米药物fitc-ache-dir-pops-lps和cy7-ache-pops-lps，给药剂量为10μl
·
g-1，在给药后0.5、1、4、12、24h用异氟烷麻醉动物，采用活体成像仪、750nm激发光下对fitc-ache-dir-pops-lps组小鼠和cy7-ache-pops-lps组小鼠拍照，随后cy7-ache-pops-lps组取动物全脑、心、肝、脾、肺、肾等器官，用活体成像仪在750nm激发波长下拍照。
[0078]
活体荧光实验结果：fitc-ache-dir-pops-lps与cy7-ache-pops-lps为不同荧光标记的纳米药物。其中，fitc-ache-dir-pops-lps为装载蛋白ache染绿色荧光(fitc)，纳米载体染红光(dir)，cy7-ache-pops-lps为装载蛋白染红光(cy7)。活体成像结果显示(图8)，fitc-ache-dir-pops-lps组在给药后24h内脑部均有红色荧光，其中4h的荧光最强，表明dir标记的pops纳米药物在4h到达脑部的量最大；cy7-ache-pops-lps组在给药后0.5～4h内脑部有中枢靶向递运蛋白的红色荧光，且随时间延长逐渐减弱，12h之后红色荧光彻底消失；在器官荧光图片中可以观察给药后24h内各脏器的荧光分布情况，其中肝和肾的荧光最强，心脏荧光最弱，脑和肾在0.5h和1h内的荧光最强，而肝在各时间点均有强烈的荧光(图9)。
[0079]
组织荧光病理：fitc-ache-dir-pops-lps组小鼠取动物全脑、心、肝、脾、肺、肾等器官各器官，多聚甲醛固定4h后进行冷冻切片，dapi染色，分别于405nm/488nm/750nm dapi/fitc/dir激发波长下拍摄荧光病理照片。
[0080]
病理实验结果：将fitc-ache-dir-pops-lps给药组小鼠的各脏器冷冻切片后，在共聚焦显微镜下拍摄荧光病理照片。结果如图10所示，fitc-ache-dir-pops-lps给药后小鼠脑部皮层和海马处均有红色和绿色荧光，在4h达到最强(图10)；心脏荧光普遍较弱，给药后24h稍强(图11)；肝脏内部有弥漫均一的荧光，24h达到最强(图12)；脾的红色和绿色荧光均在4h最强，而后24h绿色荧光消失，红色荧光减弱(图13)；肺的红绿荧光均随时间延长逐渐增强(图14)；肾的绿色荧光1h最弱，24h最强，红色荧光24h最强。此外，肾的荧光较为特殊，如图15所示，修饰fitc的ache 24h内在肾盂处未有明显荧光，而标定dir的pops在24h后在肾盂处有明显红光。
[0081]
实施例7：纳米药物的脑部乙酰胆碱酯酶含量的评价
[0082]
荧光标记装载蛋白的纳米药物制备：称取ache 100mg，溶解于8ml hepes缓冲液中，称取cy7-nhs 2mg，溶解于2ml hepes缓冲液中，混合后总体积为10ml，避光冰浴搅拌4-5h得到cy7-ache溶液；将cy7-ache溶液倒入透析袋中，再将透析袋置于盛有1l hepes缓冲液的大烧杯中，4℃避光进行透析，烧杯中的pbs缓冲液每隔2～3h置换一次，至烧杯中的hepes缓冲液澄清时中止透析，收集透析袋中的cy7-ache溶液，记录体积以便计算浓度，用hepes缓冲液将其稀释到3mg
·
ml-1分装冻存于-20℃备用；称取0.1mmol pops，加入10ml氯仿溶解，然后用旋转蒸发仪将溶剂蒸发除去，使脂质体材料在烧瓶壁上形成一层磷脂薄膜；取前述合成的cy7-ache溶液20ml，取10ml备用，其余10ml加入瓶中后，对脂质膜进行超声水化处理,得到的纳米药物混悬液冰浴条件下搅拌2～4h后，用脂质体挤出仪在20℃下将混悬液通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜经往复挤压10～12次，得到粒径分布均匀的装载cy7-ache的pops纳米药物(cy7-ache-pops-lps),于4℃保存备用。
[0083]
将km小鼠按体重分为两组，一组56只，其中一组尾静脉注射cy7-ache溶液，另一组尾静脉注射cy7-ache-pops-lps，给药剂量为10μl
·
g-1
，给药后分别将小鼠于0min、30min、1h、2h、4h、12h、24h麻醉后用生理盐水进行心脏灌流，随后取脑称重并记录。
[0084]
实验结果：小鼠给药后经心脏灌流去除外周血液，测量脑实质的荧光强度，结果如图16所示，cy7-ache给药后随时间未出现有统计学差异的变化，cy7-ache-pops-lps组给药后2h脑内荧光显著上升(p＜0.0001)，4h略下降但与对照药相比仍有统计学差异(p＜0.05)，随后与对照组无明显差异。
[0085]
实施例8：ache-pops-lps纳米药物对梭曼、沙林、塔崩及vx重度中毒小鼠重活化效果评价
[0086]
梭曼、沙林、塔崩、vx染毒剂量确定：将km小鼠按体重随机分为5组，每组10只。颈部皮下注射毒剂，梭曼染毒剂量为50、100、120、200μg
·
kg-1
，染毒后观察24h并记录每组动物症状。
[0087]
沙林染毒操作同上，剂量为180、200、220、240μg
·
kg-1
[0088]
塔崩染毒操作同上，剂量为250、350、400、460μg
·
kg-1
[0089]
vx染毒操作同上，剂量为5、10、16、30μg
·
kg-1
[0090]
实验结果：表2为动物在不同毒剂不同剂量下的症状，当梭曼、沙林、塔崩及vx染毒剂量为升至120μg
·
kg-1、200μg
·
kg-1、350μg
·
kg-1及16μg
·
kg-1时，动物开始出现死亡。
[0091]
表2动物在不同毒剂不同剂量下的症状
[0092][0093]
取km小鼠60只按体重随机分为6组，每组12只，包括空白组(不给药不染毒)、染毒组(只染毒不给药)、对照药ⅰ组(染毒+hi-6 2.2mg
·
ml-1
)、对照药ⅱ组(染毒+ache 3mg
·
ml-1
)，纳米药物ⅰ组(染毒+100nm ache-pops-lps 3mg
·
ml-1
)、纳米药物ⅱ组(染毒+200nm ache-pops-lps 3mg
·
ml-1
)；各组小鼠进行颈部皮下染毒，梭曼染毒剂量为140μg
·
kg-1
，随后立即尾静脉注射相应药物，给药剂量为10μl
·
g-1
，给药10min后取外周血200μl，用灭菌注射用水稀释100倍，涡旋混匀后待测；取脑组织，用滤纸粘去脑样表面的血液后记录重量，随后每个脑样加入1.3ml ache提取液，匀浆后离心(4℃12000
×
g)10min，弃去沉淀，将上清液用pbs稀释50倍待测。
[0094]
在96孔酶标板中进行加样，每个样品设置6个复孔，各孔加入20μl待测样品，前三孔加入80μl pbs，后三孔加入50μl pbs和30μl atch，室温1000
×
g离心1min去除气泡，随后将酶标板置37℃恒温培养箱中孵育，30min后取出，各孔加入20μl dtnb，用酶标仪检测各孔在415nm处的吸光度值a
415 nm，根据下式计算药物的重活化率：
[0095]
重活化率(％)＝(给药组a
415
nm-染毒组a
415
nm)/(空白组a 415
nm-染毒组a
415
nm)
×
100％
[0096]
ellman法检测纳米药物对沙林、塔崩、vx重度中毒小鼠重活化效果：对照药hi-6的配制方法、动物分组、给药情况、样品处理及检测方法等均同上，沙林、塔崩、vx染毒剂量分别依次为200、400及18μg
·
kg-1
.
[0097]
实验结果：
[0098]
图17为相应实验结果，对于梭曼重度中毒的小鼠，hi-6的血酶重活化率为22％，100nm的ache-pops-lps和200nm的ache-pops-lps的血酶重活化率分别为9％和13％。对照药hi-6的脑酶重活化率为-3％；100nm ache-pops-lps及200nm ache-pops-lps脂质体的脑酶重活化率分别为46％和64％，与对照药hi-6和ache相比均有明显的统计学差异(p＜0.0001)，表明200nm以下的纳米药物均能够有效靶向中枢并释放所携带的ache。
[0099]
图18为对抗多种毒剂的治疗效果。ache-pops-lps纳米药物对沙林重度中毒小鼠脑酶的重活化率为69％，约为hi-6的10倍(p＜0.0001)；对外周血酶的重活化率为-2％，明显低于hi-6的42％(p＜0.0001)，表明ache-pops-lps能够有效重活化中枢的沙林中毒酶。纳米药物对塔崩重度中毒小鼠脑酶的重活化率为51％，对vx重度中毒小鼠脑酶的重活化率为46％，与对照药相比均有明显的统计学差异(p＜0.0001)，以上结果表明ache-pops-lps纳米药物具有广谱的重活化效果。
[0100]
实施例9：ache-pops-lps纳米药物对梭曼老化后中枢中毒酶重活化率的评价
[0101]
取km小鼠60只按体重随机分为4组，每组8只，包括空白组(不给药不染毒)、染毒组(只染毒不给药)、对照药组(染毒+hi-6 2.2mg
·
ml-1
)纳米药物组(染毒+100nm ache-pops-lps 3mg
·
ml-1
)；各组小鼠进行颈部皮下染毒，梭曼染毒剂量为120μg
·
kg-1
；染毒30分钟后尾静脉注射相应药物，给药剂量为10μl
·
g-1
，给药10min后取脑组织，用滤纸粘去脑样表面的血液后记录重量，随后每个脑样加入1.3ml ache提取液，匀浆后离心(4℃12000
×
g)10min，弃去沉淀，将上清液用pbs稀释50倍待测。
[0102]
在96孔酶标板中进行加样，每个样品设置6个复孔，各孔加入20μl待测样品，前三孔加入80μl pbs，后三孔加入50μl pbs和30μl atch，室温1000
×
g离心1min去除气泡，随后将酶标板置37℃恒温培养箱中孵育，30min后取出，各孔加入20μl dtnb，用酶标仪检测各孔在415nm处的吸光度值a
415 nm，根据下式计算药物的重活化率：
[0103]
重活化率(％)＝(给药组a
415
nm-染毒组a
415
nm)/(空白组a 415
nm-染毒组a
415
nm)
×
100％
[0104]
实验结果：
[0105]
图19为相应实验结果，对于梭曼重度中毒的小鼠，半小时后中毒酶老化，给与救治药物，对照药物hi-6的中枢重活化率降至-10％，而给与ache-pops-lps，中枢重活化率能保持28％，有效实现了老化后中毒的有效中枢救治。

技术特征：
1.一种可以将生物蛋白酶递运至脑部用于治疗脑部急性中毒的纳米药物，其特征在于，该药物为球状纳米颗粒，其以脂质体材料为载体，在载体内包裹生物蛋白酶活性药物。2.根据权利要求1所述的纳米药物，所述的脂质体材料选自1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(pops)、12-二十四烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(dmps)、1,2-二十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(dpps)、1,2-双十六酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(dppc)中的一种或几种。3.根据权利要求1-2任一项所述的纳米药物，所述的生物蛋白酶优选为乙酰胆碱酯酶(ache)。4.根据权利要求3所述纳米药物，所述乙酰胆碱酯酶的分子量为280kda。5.根据权利要求1-4任一项所述纳米药物，所述纳米颗粒的直径为150nm-200nm。6.权利要求1-5任一项所述纳米药物的制备方法，其特征在于，使用薄膜分散法制备纳米颗粒。7.根据权利要求6所述的制备方法，包括如下步骤：(1)称取4-羟基哌嗪乙磺酸(hepes)，加入蒸馏水，配制成hepes缓冲液，(2)将生物蛋白酶溶解于hepes溶液中，配制乙酰胆碱酯酶hepes溶液，冷藏备用；(3)将脂质体材料溶解在梨形烧瓶中，然后在真空下用旋转蒸发器将溶剂蒸发，使脂质体材料在器壁上形成薄膜；(4)用配制好的乙酰胆碱酯酶hepes溶液对脂质体薄膜进行超声水化处理；(5)随后采用微孔膜挤出悬浮液，可获得尺寸均一的乙酰胆碱酯酶脂质体；(6)使用挤推法获得尺寸均一的所述纳米药物。8.根据权利要求7所述的制备方法，其中步骤(3)中脂质体的溶解溶剂优选为氯仿，脂质体材料与氯仿按照摩尔比1:4溶解。9.根据权利要求7-8任一项所述的制备方法，其中步骤(5)使用0.2μm微孔膜。10.权利要求1-5任一项所述纳米药物在制备治疗中枢神经系统有机磷化合物中毒的药物中的用途，所述有机磷化合物选自梭曼、沙林、vx、塔崩。

技术总结
本发明属于医药领域，具体涉及一种能将具有生物活性的蛋白酶高效输运至中枢神经系统并快速释放的中枢靶向型生物活性纳米药物。该纳米药物以脂质体为载体，将目标蛋白输运至脑部后迅速释放，可直接改善中枢的多项生理平衡，达到快速治疗脑部急性疾病的目的。所装载的目标药物，尤其适用于因活性强在外周被大量的降解等失效和因分子量大等原因无法穿透血脑屏障的大分子生物活性药物。该纳米药物应用于神经性毒剂中枢神经系统中毒救治。本发明还涉及该纳米药物的制备方法。涉及该纳米药物的制备方法。涉及该纳米药物的制备方法。


技术研发人员：王永安 杨军 黄静宜 章子男 黄丽娟 李尧 曹文缤 王淋 隋昕 骆媛
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2023.04.13
技术公布日：2023/8/28