副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白基因I型和II型的通用性B细胞线性表位及其应用

副猪嗜血杆菌omp p2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位及其应用
技术领域
1.本发明涉及免疫学领域，特别是涉及副猪嗜血杆菌omp p2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位及其应用。


背景技术：

2.副猪嗜血杆菌(haemophilus parasuis，hps)是猪上呼吸道内的共生菌，当宿主免疫力下降时，强毒力的hps会突破粘膜屏障侵入机体引起以肺炎、纤维性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等炎症为特征的病。各阶段的猪均可感染hps，大部分感染猪不会发病，但是病对于2周龄到4月龄的猪，尤其是处于断奶应激和母体抗体消失阶段的保育猪威胁较大，容易引起仔猪的急性感染发病和死亡。而且hps与其它呼吸道病毒共感染时会引起prcd，能够进一步破坏猪的免疫系统，不仅提高了病的发病率和死亡率；还会引起hps的慢性感染，降低生产效率，造成严重的经济损失。研究显示中国南方地区59.4％的prcd患病猪存在hps的感染，所以对副猪嗜血杆菌的防治势在必行。
3.hps菌株中既有正常寄生菌，也有致病病原体，不同hps菌株的毒力差别较大。区别呼吸道无毒株和强毒株对防控和诊断该疾病就显得至关重要了。目前对hps菌株毒力的划分一般只是根据血清型简单划分，但随着临床分离菌株数量的增加，同一血清型的hps菌株表现出不同毒力的现象越来越多；并且强毒力血清型菌株从健康猪上呼吸道分离的几率与患病猪的实质器官中分离的概率没有明显区别，说明根据血清型划分hps菌株毒力的方法并不完善，hps中存在血清型之外的毒力决定因子。
4.外膜蛋白p2(ompp2)是hps中丰度最高的外膜蛋白，属膜孔蛋白家族，是细菌主要的膜结构蛋白和营养物质的流通通道。ompp2缺失的hps致病株不仅在生长繁殖方面存在明显缺陷；而且在粘附和入侵细胞、抵抗血清杀伤等方面的能力也明显弱于亲本株；另外ompp2蛋白还具有细胞毒性，并能诱导细胞分泌促炎症细胞因子。这些都说明ompp2是hps的主要的毒力因子，参与了hps在宿主体内转移和致病的多个过程。
5.omp p2蛋白还有一个非常有意义的特征，就是它存在两种明显不同的蛋白结构，同时基因也可以被分为基因i型和ii型。根据蛋白结构预测结果，基因i型由于存在两处不连续的基因缺失，使的三级结构中的loop3和loop4之间少了一个loop9，而且loop5向c端位移了14个氨基酸。与菌株毒力结合分析发现，绝大部分中强毒株和临床分离株的omp p2蛋白都属于基因i型，而弱毒株或者非致病株都属于基因型ii型。动物和细胞毒力实验也显示，基因i型的omp p2蛋白具有更高的细胞毒性和血清抵抗力，说明omp p2蛋白的结构与细菌毒力关系密切，可以作为区分菌株毒力的一个可靠依据。所以可通过建立两基因型的通用表位及差异表位的多肽elisa诊断方法及其诊断试剂对ompp2蛋白的结构进行鉴定，实现致病性菌株和非致病性菌株的区分。
6.和其它细菌病原一样，hps的预防也主要依靠疫苗。目前市售的大多数副猪嗜血杆菌疫苗都是灭活和血清型特异性的，对其它血清型致病菌的交叉保护并不理想。因为研究
显示，不同血清型菌株甚至是同一血清型的不同菌株，抗原性也可能不同。所以单一血清型灭活疫苗接种的效果比较差，导致很少有猪场会主动注射灭活疫苗进行预防。为此，科学家将主要精力放在了亚单位疫苗的研制上，亚单位疫苗主要由不同血清型的特定优势抗原或者多类型表位组成，可以诱导对特定致病菌常见表位的免疫反应，这样就能在提供交叉保护作用的同时避免影响鼻腔微生态内的非致病hps，而有效预防和清除致病hps的感染。omp p2蛋白就非常适合制作亚单位疫苗。小鼠实验显示高毒力hps感染后能够迅速诱导产生高效价的抗omp p2蛋白特异性抗体，并在补体存在的情况下能有效的杀伤细菌，抑制细菌在小鼠血液中生长，小鼠的生存率能够提高80％。另外，ompp2蛋白还是hps中的优势抗原。能够迅速诱导高效价的特异性抗体产生，并在补体存在的情况下能有效的杀伤细菌，抑制细菌在宿主体内生长，表明ompp2蛋白的b淋巴细胞表位与抗hps感染的保护性免疫也有关系。
7.所以筛选ompp2的b淋巴细胞线性表位，认清表位与致病性的关系，不仅可以将多个血清型的优势表位串联在一起形成亚单位疫苗，实现交叉保护；还可以针对关键表位进行突变，在降低毒力的同时保留大部分保护性抗原表位，构建减毒疫苗。并可通过建立通用性表位和突变表位的多肽elisa诊断方法及其诊断试剂，实现疫苗接种和自然感染阳性猪的区分。


技术实现要素：

8.本发明的一个目的在于，提供一种副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位，该线性表位序列为vtvyenegtkvdfdgq。
9.本发明的再一个目的在于，提供一种副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位，该线性表位序列为yklhkqvvtfve。
10.本发明的又一个目的在于，提供一组副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位，该线性表位序列分别为gfdiltassdsainyt、gfdiltdssdsainyt、gfdiltqssdsainyt、gfdiltsdsdsainyt。
11.本发明的最后一个目的在于提供上述副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位在制备副猪嗜血杆菌病诊断、预防或副猪嗜血杆菌病试剂或药物中的应用。
12.本发明所采取的技术方案是：
13.1)重组表达不同基因型的ompp2蛋白，并进行纯化；
14.2)以不同基因型的重组ompp2蛋白为抗原，免疫动物；
15.3)取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗副猪嗜血杆菌ompp2蛋白抗体的杂交瘤细胞；
16.4)以两种基因型重组蛋白为抗原，筛选分泌基因型通用性单克隆抗体；
17.5)合成基因i型和ii型ompp2蛋白的重叠多肽与基因型通用性单克隆抗体进行elisa检测，筛选基因型通用性性b细胞线性表位。
18.本发明的有益效果是：
19.本发明的副猪嗜血杆菌ompp2蛋白的b细胞线性表位，为基因i型和ii型的通用型b细胞线性表位，疫苗株中该段序列突变或缺失后获得的突变ompp2蛋白在免疫猪之后，无法诱导产生抗该表位的抗体，从而达到自然感染与疫苗接种免疫的鉴别诊断，可为新型分子
标记疫苗的研制提供依据；并能避免接种疫苗产生的抗体影响猪呼吸道内正常寄生的副猪嗜血杆菌。
20.本发明的副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用型b细胞线性表位，为2个基因型ompp2蛋白共同拥有的表位。包被酶标板之后可用于检测猪血清中的抗副猪嗜血杆菌抗体，由此建立peptide-elisa检测方法，既可检测基因i型副猪嗜血杆菌的感染，也可检测基因ii型副猪嗜血杆菌的感染，实现猪血清中副猪嗜血杆菌抗体的通用检测。
21.本发明的副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用型b细胞线性表位对应的单克隆抗体，可以同时识别基因i型和ii型ompp2蛋白，实现两个基因型副猪嗜血杆菌的同时检测。
附图说明
22.图1a是rp2-i1、rp2-i2、rp2-i3、rp2-ii重组蛋白抗his标签抗体的western blot检测结果；1-4号泳道依次为rp2-i1、rp2-i2、rp2-i3、rp2-ii复性浓缩后蛋白上清。
23.图1b是rp2-i1、rp2-i2、rp2-i3、rp2-ii重组蛋白的sds-page电泳检测图；m为蛋白marker，条带大小由大到小分别为97.2、66.4、44.3、29、20.1、14.3kda；1-4号泳道依次为rp2-i1、rp2-i2、rp2-i3、rp2-ii复性浓缩后蛋白上清。
24.图2是基因型通用性抗体与4个重组蛋白的间接elisa结果。
25.图3是基因型通用性抗体与4个重组蛋白的western blot检测结果；a：单抗2e2；b：单抗2c11；c：单抗5f9；nc：阴性对照。
26.图4是基因型通用性抗体与天然ompp2蛋白的间接elisa结果。
27.图5是基因型通用性抗体与天然ompp2蛋白的western blot检测结果；a：单抗2e2；b：单抗2c11；c：单抗5f9。
28.图6是基因型通用性抗体与肽池的间接elisa结果；a：单抗2e2；b：单抗2c11；c：单抗5f9。
29.图7是基因型通用性抗体与多肽的间接elisa结果；a：单抗2e2；b：单抗2c11；c：单抗5f9。
30.图8是ompp2蛋白中pt1、pt1a、pt2序列区域的多重比对结果；dt3、zs7为本实验室分离保存的副猪嗜血杆菌菌株，hs-dy01～hs-dy15依次为中国来源副猪嗜血杆菌1～15血清型的代表株，no.4～84-15995依次为国际上公认副猪嗜血杆菌1～15血清型的代表株。
31.图9是omp p2蛋白中pt19、pt19a序列区域的多重比对结果；dt3、zs7为本实验室分离保存的副猪嗜血杆菌菌株；hs-dy01～hs-dy15依次为中国来源副猪嗜血杆菌1～15血清型的代表株；no.4～84-15995依次为国际上公认副猪嗜血杆菌1～15血清型的代表株。
32.图10是omp p2蛋白中pt9序列区域的多重比对结果；dt3、zs7为本实验室分离保存的副猪嗜血杆菌菌株；hs-dy01～hs-dy15依次为中国来源副猪嗜血杆菌1～15血清型的代表株；no.4～84-15995依次为国际上公认副猪嗜血杆菌1～15血清型的代表株。
33.图11是阳性鼠血清中抗pt1a表位抗体的效价检测。
34.图12是阳性鼠血清中抗pt19a表位抗体的效价检测。
35.图13是阳性鼠血清中抗pt9b表位抗体的效价检测。
具体实施方式
36.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
37.副猪嗜血杆菌重组外膜蛋白ompp2的制备
38.1)重组蛋白的获取
39.首先从4份副猪嗜血杆菌的阳性样品中扩增出4条不同的ompp2蛋白序列，其中1条为基因ii型，3条为基因i型。使用引物的序列为前引物omp2/f：catgccatggtaacag tttatgaaaatgaaggt；后引物omp2/r：ccgctcgagccataatacacgtaaacc，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司(下简称生工)合成。扩增获得的目的片段经过nco i和xho i双酶切后与pet-28a载体连接，构建原核表达载体pet-28a-ompp2，转化入大肠杆菌感受态bl21(de3，货号b528414，生工)，这样就能够获得n端融合有6
×
his标签的重组ompp2蛋白(截除信号肽的成熟蛋白)。随后将大肠杆菌培养至od600为0.8时，以终浓度0.5mm iptg(货号a100487，生工)加入菌液继续培养诱导目的蛋白表达。4条目的ompp2蛋白序列构建的重组表达菌均有目的蛋白表达，分别将各自的重组蛋白标记为rp2-i1、rp2-i2、rp2-i3、rp2-ii。
40.破碎后检测发现4个重组蛋白都是以包涵体的形式存在。随后对包涵体进行洗涤，并溶解于8m尿素缓冲液(8m尿素，10％甘油，50mm tris-hcl ph8.0，150mm nacl，2mm edta)中，浓度为30mg/ml。然后采用变性剂梯度透析的方法对4个重组蛋白的溶解包涵体进行复性，具体梯度为6m、4m、2m和0m尿素。每个梯度4℃低速搅拌透析8h。
41.梯度透析完成后，收集透析袋内液体15000rpm离心20min，收集上清进行蛋白浓缩。浓缩我们选用10kda截留的millipore超滤离心管(货号ufc9010，默克生命科学技术有限公司)，浓缩时的离心力选用3000g，将复性液浓缩至1-1.5ml结束；浓缩液用13000rpm离心10min收集浓缩上清，即为复性及浓缩后的重组蛋白。
42.2)重组蛋白的鉴定
43.使用鼠抗his标签抗体(货号d191001，生工)对浓缩后蛋白进行western blot检测，二抗选用兔抗鼠igg多克隆抗体(货号d110097，生工)。结果如图1a所示，4个浓缩后的蛋白都能够和抗his标签抗体特异性结合，说明浓缩上清中的蛋白是重组ompp2蛋白。然后对浓缩后的重组蛋白进行sds-page检测，结果如图1b所示，复性浓缩所得的重组蛋白分子量大小在44.3kda左右，基因i型的3个重组蛋白大小相似，基因ii型的重组蛋白的分子量大小稍高于基因i型。经过检测，浓缩后rp2-i1、rp2-i2、rp2-i3、rp2-ii重组蛋白的浓度分别是2.9mg/ml、5.8mg/ml、5mg/ml、1.9mg/ml；纯度分别为90％、94.6％、93.2％、88.4％(由biorad geldoc xr+imagelab的条带分析功能自动计算)；均达到免疫动物对抗原纯度和浓度要求。
44.当然，也可以使用其他方法制备得到的副猪嗜血杆菌重组外膜蛋白ompp2，或直接购买纯化的副猪嗜血杆菌重组外膜蛋白ompp2。
45.制备重组外膜蛋白ompp2的单克隆抗体
46.1)小鼠免疫
47.为获取不同基因型omp p2蛋白之间通用性单克隆抗体，设置2组动物免疫实验，分
别用基因i型和基因ii型romp p2蛋白(rp2-i2和rp2-ii)作为抗原进行小鼠免疫。每组3只6周龄的雌性balb/c小鼠(购自广东省医学实验动物中心)同步进行抗原注射。初次免疫是将0.5mg/ml重组蛋白pbs稀释悬液与完全福氏佐剂(cfa，货号f5881，默克生命科学技术有限公司)等体积混匀乳化后，小鼠腹腔皮下多点注射，每只小鼠注射100μg抗原。初次免疫后2周后进行第二次免疫，将0.5mg/ml重组蛋白pbs稀释悬液与非完全福氏佐剂(ifa，货号f5506，默克生命科学技术有限公司)等体积乳化，同样腹部皮下多点注射，每只小鼠注射50μg抗原蛋白。同样的免疫可以进行多次，直至小鼠血清中抗对应重组蛋白(抗原)的效价达到1:12800以上时，对取脾小鼠腹腔注射50μg重组蛋白进行冲击免疫。融合前3天分别对两组中效价最高的小鼠直接腹腔注射含50μg对应重组蛋白的pbs缓冲液加强免疫，注意这次抗原无需乳化。
48.2)细胞融合
49.加强免疫后第3天，眼角取血后断颈处死上述以加强免疫的balb/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞(购自广州华拓生物科技有限公司)按3:1在50％ peg1450融合剂(货号e607052，生工)下融合，融合后以hat选择培养基(货号h0262，默克生命科学技术有限公司)铺板置于37℃5％co2培养。置于37℃5％ co2培养10天(第7天换hat培养基一次)。
50.当然，也可以使用其他实验动物，取免疫后脾脏与对应的瘤细胞融合获得该动物种属的杂交瘤细胞。
51.3)阳性克隆筛选及克隆
52.以作为免疫原的romp p2蛋白为抗原包被，以杂交瘤细胞的培养上清为一抗进行间接elisa，筛选能够分泌特异性抗romp p2蛋白抗体的杂交瘤细胞，有抗体分泌的细胞孔更换ht完全培养基接着培养。当细胞达到一定数量时采用有限稀释法进行克隆化，取50-60个细胞铺于一块96孔板，置于37℃5％ co2培养7天；同样方法进行细胞上清的间接elis a，筛选分泌特异性抗体的杂交瘤细胞；然后再次对阳性孔中的杂交瘤细胞进行有限稀释，直至同一培养孔克隆化后的所有细胞均为分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞，则证明克隆化成功。最后对克隆化成功的细胞进行扩大培养及冻存，从同一个融合细胞孔克隆出来的所有细胞作为一株阳性杂交瘤细胞株。
53.单克隆抗体的鉴定
54.1)单克隆抗体细胞株上清与重组ompp2蛋白的间接elisa
55.分别以重组的ompp2蛋白rp2-i1、rp2-i2、rp2-i3、rp2-ii为抗原包被酶标板，包被浓度为5μg/ml，每孔100μl 4℃包被过夜；第二天pbst洗涤3次后，每孔加入200μl含4％ bsa的pbs，37℃培养箱封闭2小时；随后pbst洗涤3次，每孔加入抗体稀释液(含1％bsa的pbst)50μl，然后加入对应的待检测杂交瘤细胞培养上清50μl作为一抗，37℃孵育1小时；pbst洗涤5次，加入1:10000抗体稀释液稀释的hrp标记兔抗鼠igg抗体为二抗(货号d110097，生工)，每孔100μl，37℃孵育45min；pbst洗涤5次后，加入100μl先配置的tmb显色液(货号c520026，生工)，每孔100μl，37℃避光显色20min，最后每孔加入50μl 2m h2so4终止反应。使用thermo multiskan go全波长酶标仪测量450nm波长下每孔的光密度(od)。以免疫p2-i1蛋白的小鼠血清作为阳性对照，阴性对照为非洲猪瘟病毒p30蛋白的杂交瘤细胞上清，阳性的判定标准为：以阴性对照od
450nm
值的2.1倍为阈值，各待测孔od
450nm
值(s)与阈值(co)对
eli sa(图7b)，显示单抗2c11抗体只与pt19产生阳性反应，而不与pt18、pt20反应。即单抗2c11所识别b细胞线性表位有关键氨基酸只存在于多肽pt19中而不在与pt18、pt20重叠的氨基酸中，即rp2-i2的第297-304氨基酸中。
64.另外，单抗5f9可以和pool x4、pool y2两个肽池都产生阳性反应，交叉多肽是pt9。随后将pt9和与它重叠的pt8作为抗原进行peptide-elisa(图7c)，显示单抗5f9抗体只与pt9产生阳性反应，而不与pt8反应。即单抗5f9抗体所识别b细胞线性表位的关键序列存在于多肽pt9中，而不在pt8中，即在rp2-i2蛋白的第137-152氨基酸中。
65.表1.ompp2重叠多肽的序列
[0066][0067]
表2.多肽分组及肽池信息
[0068][0069]
表3.交叉肽池所对应的多肽
[0070][0071][0072]
表位序列确定及保守性分析
[0073]
为进一步确定这3株基因型通用性抗体所识别的表位序列，需要对多肽pt1、pt9和pt19进行截短处理。
[0074]
首先，将多肽pt1中与pt2中重叠的氨基酸去除，重新合成了一条多肽pt1a：vtvyen egtkvdfdgq(rpt2-i2：1-16，seq id no：1)，以它为包被抗原进行peptide-elisa，结果显示如图7a所示，单抗2e2抗体能够与多肽pt1a反应，说明单抗2e2抗体识别的表位处于多肽pt1独有的序列pt1a中。对rp2-i1、rp2-i2、rp2-i3、rp2-ii 4个重组蛋白和dt3、zs7及国内外各血清型代表株的ompp2蛋白该区域序列进行多重比对，结果如图8所示，显示所有ompp2蛋白中多肽pt1a的序列都是保守的，序列均是vtvyenegtkvdfdgq(seq id no：1)，不存在氨基酸的突变，即该表位是副猪嗜血杆菌的通用性b细胞线性表位，在基因i型和ii型的副猪嗜血杆菌中都存在。
[0075]
其次，我们使用iedb软件对pt19与pt20中表位进行预测，重新合成了一条多肽pt19a：yklhkqvvtfvegr(rpt2-p2：301-314,seq id no：28)，以它为抗原包被进行pep tide-elisa，结果如图7b所示，单抗2c11抗体能够与多肽pt19、pt19a都反应，而且s/co值相似，说明单抗2c11识别的表位处于多肽pt19和pt19a重叠的序列中，即yklhkqvv tfve(rpt2-p2:：301-312，seq id no：2)。对omp p2蛋白中该区域序列进行多重比对，结果如图9所示，显示所有omp p2蛋白内该表位对应的序列都是保守的，序列均是yklhkqvvtfve(seq id no：2)，不存在氨基酸的突变；即表位yklhkqvvtfve(seq id no：2)同样是副猪嗜血杆菌的通用性b细胞线性表位，在基因i型和ii型的副猪嗜血杆菌中都存在。
[0076]
另外，我们将多肽pt9中与pt8中重叠的氨基酸去除，重新合成了2条多肽pt9a和pt9b，序列为ssdsainyt(rp2-i2：144-152,seq id no：29)和gfdiltassdsainyt(rp2-i2：137-152,seq id no：3)，前者为pt9中的保守序列，后者为pt9中与pt8不重叠的氨基酸序列。分别以这2条多肽为抗原包被进行peptide-elisa，结果如图7c所示，单抗5f9能够与多肽pt9b反应，但不与pt9a反应，说明单抗5f9识别的表位并不是pt9中的保守序列(pt9a)，关键氨基酸都存在于pt9b中。对omp p2蛋白中该区域序列进行多重比对，结果如图10所示，显示所有omp p2蛋白内多肽pt9序列区域内的突变在rp2-i1、rp2-i2、rp2-i3、rp2-ii和dt3、zs7菌株的omp p2都有出现，而单抗5f9和这些蛋白都能够反应。说明突变位点不是表位的关键氨基酸，突变并不影响该表位的完整性，而关键氨基酸很有可能就存在于保守的第137-142氨基酸和第145-152氨基酸中。所以该区域同源的基因i型和ii型蛋白序列都是基因型的通用性b细胞线性表位，可用于副猪嗜血杆菌基因i型和ii型的通用检测。表位包括但不限于gfdiltassdsainyt(seq id no：3)，gfdiltdssdsai nyt(seq id no：4)，gfdiltqssdsainyt(seq id no：5)，gfdiltsdsdsainy t(seq id no：6)等。
[0077]
表位多肽检测阳性鼠血清
[0078]
将通用性表位多肽pt1a、pt9b、pt19a作为抗原，5μg/ml包被过夜；免疫后小鼠的血清(融合前收集)作为一抗，hrp标记兔抗鼠igg抗体为二抗进行peptide-elisa检测；并且对鼠血清进行梯度稀释检测鼠血清中抗这些表位多肽igg抗体的效价，设定为2倍梯度稀释。其中，pt1a选用rp2-ii免疫后小鼠血清，稀释倍数范围为1:50-1:102400；pt9b选用rp2-i2免疫后小鼠血清，稀释倍数范围为1:50-1:6400；pt19a选用rp2-i2免疫后小鼠血清，稀释倍数范围为1:50-1:12800。
[0079]
结果如图10、图11和图12所示，重组ompp2蛋白免疫后都可以诱导小鼠产生抗pt1a、pt9b、pt19a表位的特异性抗体。其中，抗pt1a抗体(图10)的效价可以达到1:51200，说明pt1a表位具有较强的免疫原性。另外抗pt19a抗体(图11)和抗pt9b抗体(图12)的效价分别为1:3200和1:400，也都表现出一定的免疫原性。
[0080]
表位多肽检测猪血清样品
[0081]
将通用性表位多肽pt1a、pt9b、pt19a作为抗原，5μg/ml包被过夜；抗副猪嗜血杆菌抗体阳性的猪血清为一抗，hrp标记兔抗猪igg抗体为二抗(货号：d111051，生工)进行elisa检测。其中阳性猪血清58份，都是商品化副猪嗜血杆菌抗体elisa试剂盒(购自深圳子科生物科技有限公司)检测为阳性的血清，检测时所有血清以1:400稀释作为一抗。结果如表4所示，58份子科生物检测阳性样品中，pt1a、pt9b、pt19a表位多肽检出阳性分别为40、26、42份，阳性检出率为68.97％、44.83％、72.41％，都有较高的阳性水平。表明临床中副猪嗜血杆菌病的患病猪大部分都会产生抗通用性表位抗体。
[0082]
表4.pt1a检测副猪嗜血杆菌病猪阳性血清
[0083]
[0084]
[0085][0086]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，则本发明也意图包含这些改动和变形。

技术特征：
1.一种副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位，其特征在于：所述线性表位序列为vtvyenegtkvdfdgq。2.一种副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位，其特征在于：所述线性表位序列为yklhkqvvtfve。3.一组副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位，其特征在于：所述线性表位序列分别为gfdiltassdsainyt、gfdiltdssdsainyt、gfdiltqs sdsainyt、gfdiltsdsdsainyt。4.权利要求1、2、3所述副猪嗜血杆菌ompp2蛋白基因i型和ii型的通用性b细胞线性表位在制备副猪嗜血杆菌病诊断、预防或副猪嗜血杆菌病试剂或药物中的应用。

技术总结
本发明公开3种副猪嗜血杆菌OmpP2蛋白基因I型和II型的通用性B细胞线性表位及其应用。表位的序列为Pt1a：VTVYENEGTKVDFDGQ；Pt9b：GFDILTASSDSAINYT和Pt19/Pt19a；YKLHKQVVTFVE。另外还包括Pt9b的同源序列GFDILTDSSDSAINYT、GFDIL TQSSDSAINYT、GFDILTSDSDSAINYT。本发明发现的这些表位都是副猪嗜血杆菌基因I型和II型OmpP2蛋白的通用性表位，可同时检测两基因型副猪嗜血杆菌的感染，实现猪血清中抗副猪嗜血杆菌抗体的通用检测，有助于副猪嗜血杆菌病的诊断。另外，疫苗株中该段序列突变或缺失获得的突变OmpP2蛋白在免疫猪之后，无法诱导产生抗该表位的抗体，可以达到自然感染与疫苗接种免疫的鉴别诊断，并能避免接种疫苗后产生的抗体影响猪呼吸道内正常寄生的副猪嗜血杆菌。正常寄生的副猪嗜血杆菌。正常寄生的副猪嗜血杆菌。


技术研发人员：吴静波 肖正中 彭国良 许崇波 南文金 胡鸿惠 黄健强
受保护的技术使用者：韶关学院
技术研发日：2023.04.18
技术公布日：2023/8/28