一种重组微生物的构建方法及其应用与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组微生物的构建方法及其应用。


背景技术：

2.天冬氨酸和天冬氨酸族氨基酸在饲料、食品、医药和化工等领域具有广泛的应用。其中，l-赖氨酸是一种碱性必需氨基酸，广泛应用于动物饲料、医药和食品工业。l-赖氨酸在用于动物饲料添加剂，可以促进动物机体吸收其他氨基酸，从而提高饲料质量。因此，提高l-赖氨酸的生产效率具有重要的意义。
3.目前，l-赖氨酸最常用的生产方法为微生物发酵法。谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性微生物，具有生长速度快、非致病、对自身代谢物降解能力弱的特性。作为传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌广泛用于生产多种氨基酸、核苷酸及其他有机酸。
4.从生物化学角度分类，赖氨酸属于天冬氨酸家族氨基酸。谷氨酸棒杆菌经过多步酶催化反应得到赖氨酸，代谢途径涉及多个基因的调控。谷氨酸棒杆菌合成1mol的赖氨酸需要消耗4mol的nadph，然而，细胞内nadph水平的缺乏限制了赖氨酸产量的进一步提高。因此，提高细胞内nadph水平对赖氨酸产量的提高较为重要。但是仅依靠这一途径仍难以十分有效地提高赖氨酸的产量。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种重组微生物的构建方法及其应用。
6.第一方面，本发明提供一种重组微生物的构建方法，包括：
7.降低微生物中的转录调控因子cg12680的表达水平，提高转氢酶基因pntab的表达水平。
8.进一步地，所述转录调控因子cg12680包括如seq id no.1所示的氨基酸序列；所述转氢酶基因pntab所编码的pnta蛋白包括如seq id no.2所示的氨基酸序列，所编码的pntb蛋白包括如seq id no.3所示的氨基酸序列。
9.进一步地，所述转录调控因子cg12680的编码基因包括如seq id no.4所示的核苷酸序列；所述转氢酶基因pntab中的pnta编码基因包括如seq id no.5所示的核苷酸序列，pntb编码基因包括如seq id no.6所示的核苷酸序列。
10.进一步地，所述降低微生物中的转录调控因子cg12680的表达水平包括如下任意一种或多种方式：
11.i)rna干扰；
12.ii)基因突变；
13.iii)基因敲除技术；
14.v)引入反义寡核苷酸；
15.所述提高转氢酶基因pntab的表达水平包括如下任意一种或多种方式：
16.i)增加拷贝数；
17.ii)基因突变；
18.iii)更换强启动子；
19.iv)缩短启动子和编码基因间的距离。
20.进一步地，所述降低微生物中的转录调控因子cg12680的表达水平为通过同源重组技术进行基因敲除实现，所用的引物对包括：
21.cg12680-1f：5
’‑
cgggatccttgaccgtgactacacccc-3’；
22.cg12680-1r：5
’‑
ggtgcctctttaatgggc-3’；
23.cg12680-2f：5
’‑
ccggcccattaaagaggcaccggacgtcactttccacgag-3’；
24.cg12680-2r：5
’‑
cggctagccctggggagatgaccatcaat-3’。
25.进一步地，所述提高转氢酶基因pntab的表达水平为通过采用如seq id no.20所示的启动子。
26.进一步地，所述微生物包括棒杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种；优选为棒杆菌。
27.第二方面，本发明提供所述的构建方法构建得到的重组微生物。
28.第三方面，本发明提供所述的构建方法，所述的重组微生物在提高微生物生产氨基酸或其衍生物能力中的应用。
29.进一步地，所述氨基酸为天冬氨酸族氨基酸；优选为赖氨酸。
30.本发明具备如下有益效果：
31.本发明研究发现，对于棒杆菌而言，失活其转录调控因子cg12680可以在一定程度上提高其生产赖氨酸的能力，而且进一步过表达转氢酶pntab的编码基因后，棒杆菌生产赖氨酸能力显著进一步提高，这在赖氨酸生产领域具有重要意义，而且还适用于其他以天冬氨酸为前体的化合物。
具体实施方式
32.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例中涉及的引物名称及序列如表1所示。
34.表1引物序列
35.[0036][0037]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0038]
本发明实施例涉及的产赖棒杆菌cgmcc no.13407公开于中国专利cn106635944a，cgmcc no.11942公开于中国专利cn105734004b。谷氨酸棒杆菌atcc 13032是谷氨酸棒杆菌模式菌株，属于领域公知，可从公开渠道进行购买，并且基因组序列已被公开，相关信息可从ncbi网站进行查询。
[0039]
实施例1
[0040]
1、在模式菌atcc 13032中失活cg12680
[0041]
(1)以谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组为模板，以
△
cg12680-1f/
△
cg12680-1r引物对进行pcr扩增，得到上游同源臂片段13032
‑△
cg12680-up；以谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组为模板，以
△
cg12680-2f/
△
cg12680-2r引物对进行pcr扩增，得到下游同源臂片段13032
‑△
cg12680-dn。
[0042]
(2)以13032
‑△
cg12680-up和13032
‑△
cg12680-dn两片段混合物为模板，以
△
cg12680-1f/
△
cg12680-2r引物对进行pcr扩增，得到片段13032-up-dn，将13032-up-dn用bamhi、nhei进行双酶切，载体pk18mobsacb(genbank:fj437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以t4 dna ligase进行连接，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb
‑△
cg12680。
[0043]
(3)按照谷氨酸棒杆菌手册(c.glutamicum handbook，charpter 23)制备atcc 13032的感受态细胞。重组质粒pk18mobsacb
‑△
cg12680以电穿孔方法转化该感受态细胞，并在含有15mg/l卡那霉素的bhi选择培养基上筛选转化子。将筛得的转化子过夜培养于普通bhi液体培养基中，培养温度为33℃，回转摇床220rpm振荡培养。此培养过程中，转化子发生第二次重组，通过基因交换将载体序列从基因组中除去。将培养物做连续梯度稀释(10-2
连续稀释至10-4
)，稀释液涂布在含有10％蔗糖的普通bhi固体培养基上，33℃静置培养48h。长出的菌株在其基因组中不携带插入的载体序列。通过pcr扩增目的序列和核苷酸测序分析，获得带有失活cg12680的菌株，并命名为13032
‑△
cg12680。
[0044]
2、在13032中过表达pntab
[0045]
(1)以谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组为模板，以pntab-1f/pntab-1r引物对进行pcr扩增，得到上游同源臂片段13032-pntab-up；以谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组为模板，以pntab-2f/pntab-2r引物对进行pcr扩增，得到下游同源臂片段13032-pntab-dn。突变
型启动子ppyc*1和密码子优化的pntab核苷酸序列由金唯智生物科技有限公司(中国)合成(突变型启动子ppyc*1的核苷酸序列为：ttaagaggtaagatgtctgcaggtggaagcgtttaaatgcgttaaacttggccaaatgtggcaacctttgcaaggtgaaaaactggggcggggttagatcctggggggtttatttcattcactttggcttgaagtcgtgcaggtcaggggagtgttgcccgaaaacattgagaggaaaacaaaaaccgatgtttgattgggggaatcgtgtggtataatggtaggacgcagtgactgctatcacccttggcggtctcttgttgaaaggaataattactcta)。
[0046]
(2)以13032-pntab-up、13032-pntab-dn、ppyc*1、pntab四片段混合物为模板，以pntab-1f/pntab-2r引物对进行pcr扩增，得到片段13032-up-pntab-dn，将13032-up-pntab-dn用bamhi、nhei进行双酶切，载体pk18mobsacb(genbank:fj437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以t4 dna ligase进行连接，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb-pntab。
[0047]
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pk18mobsacb-pntab转入atcc 13032中，获得pntab过表达的重组菌株，菌株命名为13032-pntab。
[0048]
3、在13032中失活cg12680同时过表达pntab
[0049]
以谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组为模板，以
△
cg12680-1f/
△
cg12680-1r引物对进行pcr扩增，得到上游同源臂片段13032
‑△
cg12680-up；以谷氨酸棒杆菌atcc 13032基因组为模板，以
△
cg12680::pntab-2f/
△
cg12680-2r引物对进行pcr扩增，得到下游同源臂片段13032-cg12680::pntab-dn。突变型启动子ppyc*1和密码子优化的pntab核苷酸序列由金唯智生物科技有限公司(中国)合成。
[0050]
以13032
‑△
cg12680-up、13032-cg12680::pntab-dn、ppyc*1、pntab四片段混合物为模板，以
△
cg12680-1f/
△
cg12680-2r引物对进行pcr扩增，得到片段13032-up-cg12680::pntab-dn，将13032-up-cg12680::pntab-dn用bamhi、nhei进行双酶切，载体pk18mobsacb(genbank:fj437239.1；由中国科学院上海生命科学院杨晟老师惠赠，也可以从公开渠道购买获得)用同样的酶双切。两酶切产物以t4 dna ligase进行连接，转化trans1 t1感受态细胞，获得重组质粒pk18mobsacb-cg12680::pntab。
[0051]
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pk18mobsacb-cg12680::pntab转入atcc 13032中，获得cg12680失活和pntab过表达的重组菌株，菌株命名为13032-cg12680::pntab。
[0052]
4、摇瓶测试重组菌株发酵性能
[0053]
赖氨酸发酵实验使用的培养基如下：
[0054]
种子活化培养基：bhi 37g/l，18g/l琼脂粉。
[0055]
种子培养基：蔗糖20g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，尿素5g/l，七水硫酸镁0.4g/l，调节ph至7.0。
[0056]
发酵培养基：葡萄糖60g/l，硫酸铵25g/l，磷酸二氢钾2.0g/l，七水硫酸镁1.0g/l，豆粕水解液10g/l，碳酸钙30g/l，调节ph至7.0。
[0057]
赖氨酸发酵方法如下：
[0058]
(1)种子活化：从冻存管中取待验证菌株，在种子活化培养基上划线活化，33℃培养24h；
[0059]
(2)种子培养：挑取平板活化种子1环接至装有30ml种子培养基的500ml三角瓶中，33℃，220r/min振荡培养6h；
[0060]
(3)发酵培养：将2ml种子液接种至装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶中，33℃、220r/min振荡培养14-15h，每株菌做三个平行。
[0061]
(4)od
562
测定：取100μl发酵液稀释适当倍数，使用分光光度计在波长562处检测od，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的od
562
如表2所示。
[0062]
(5)赖氨酸浓度测定：取2ml发酵液离心(12000rpm，2min)，收集上清液，用hplc检测重组菌与对照菌发酵液中的l-赖氨酸含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测到的赖氨酸浓度如表2所示。
[0063]
表2重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
[0064]
菌株l-赖氨酸(g/l)糖酸转化率％od
562
atcc 130320.520.87％40.513032
‑△
cg126800.601.00％39.413032-pntab0.590.98％39.813032-cg12680::pntab0.701.17％39.7
[0065]
检测发酵液中的赖氨酸含量，发现单独携带有失活转录调控因子cg12680和单独过表达pntab的谷氨酸棒杆菌的培养液中的赖氨酸浓度较高，但是转录调控因子cg12680失活和pntab过表达的重组菌株，赖氨酸浓度最高，且高于单独失活cg12680和单独过表达pntab的提升效果。
[0066]
实施例2
[0067]
本实施例进一步在赖氨酸生产菌上进行改造效果的验证。使用2株实验室保藏的赖氨酸生产菌cgmcc no.13407和cgmccno.11942进行验证。cgmcc no.13407和cgmcc no.11942由模式菌atcc 13032经过基因改造获得，其赖氨酸合成相关基因得到了强化改造，具体流程如下：
[0068]
1、在cgmcc no.13407中失活cg12680
[0069]
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pk18mobsacb
‑△
cg12680转入cgmcc no.13407中，获得失活cg12680的重组菌株，菌株命名为13407
‑△
cg12680。
[0070]
2、在cgmcc no.13407中过表达pntab
[0071]
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pk18mobsacb-pntab转入cgmcc no.13407中，获得过表达pntab的重组菌株，菌株命名为13407-pntab。
[0072]
3、在cgmcc no.13407中失活cg12680同时过表达pntab
[0073]
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pk18mobsacb-cg12680::pntab转入cgmcc no.13407中，获得cg12680失活和pntab过表达的重组菌株，菌株命名为13407-cg12680::pntab。
[0074]
4、在cgmcc no.11942中失活cg12680
[0075]
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pk18mobsacb
‑△
cg12680转入cgmcc no.11942中，获得失活cg12680的重组菌株，菌株命名为11942
‑△
cg12680。
[0076]
5、在cgmcc no.11942中过表达pntab
[0077]
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pk18mobsacb-pntab转入cgmcc no.11942
中，获得过表达pntab的重组菌株，菌株命名为11942-pntab。
[0078]
6、在cgmcc no.11942中失活cg12680同时过表达pntab
[0079]
参照实施例1的方法，将构建的重组质粒pk18mobsacb-cg12680::pntab转入cgmcc no.11942中，获得cg12680失活和pntab过表达的重组菌株，菌株命名为11942-cg12680::pntab。
[0080]
7、摇瓶测试重组菌株发酵性能
[0081]
参照实施例3的方法对cgmcc no.13407、cgmcc no.11942及其改造后的重组菌13407
‑△
cg12680、13407-cg12680::pntab、11942
‑△
cg12680、11942-cg12680::pntab、13407-pntab和11942-pntab进行发酵验证。赖氨酸发酵实验结果如表3所述。
[0082]
表3重组菌株的赖氨酸产量和生长检测
[0083]
菌株l-赖氨酸(g/l)糖酸转化率％od
562
cgmcc no.1340715.225.3％49.013407
‑△
cg1268016.627.7％47.713407-pntab15.826.3％46.913407-cg12680::pntab17.829.7％47.9cgmcc no.1194218.030.0％39.411942
‑△
cg1268019.532.5％38.711942-pntab18.530.8％39.111942-cg12680::pntab20.534.2％38.9
[0084]
发酵结果表明，同批次测试2种赖氨酸生产菌、携带有失活转录调控因子cg12680的改造菌、携带有过表达pntab的改造菌、携带有失活转录调控因子cg12680和过表达转氢酶pntab的改造菌，所有改造菌赖氨酸产量和糖酸转化率均有显著提高，其中携带有失活转录调控因子cg12680和过表达转氢酶pntab的改造菌效果更好，且高于单独失活转录调控因子cg12680和单独过表达转氢酶pntab的提升效果。
[0085]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种重组微生物的构建方法，其特征在于，包括：降低微生物中的转录调控因子cg12680的表达水平，提高转氢酶基因pntab的表达水平。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述转录调控因子cg12680包括如seq id no.1所示的氨基酸序列；和/或，所述转氢酶基因pntab所编码的pnta蛋白包括如seq id no.2所示的氨基酸序列，所编码的pntb蛋白包括如seq id no.3所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述转录调控因子cg12680的编码基因包括如seq id no.4所示的核苷酸序列；和/或，所述转氢酶基因pntab中的pnta编码基因包括如seq id no.5所示的核苷酸序列，pntb编码基因包括如seq id no.6所示的核苷酸序列。4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述降低微生物中的转录调控因子cg12680的表达水平包括如下任意一种或多种方式：i)rna干扰；ii)基因突变；iii)基因敲除技术；v)引入反义寡核苷酸；和/或，所述提高转氢酶基因pntab的表达水平包括如下任意一种或多种方式：i)增加拷贝数；ii)基因突变；iii)更换强启动子；iv)缩短启动子和编码基因间的距离。5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述降低微生物中的转录调控因子cg12680的表达水平为通过同源重组技术进行基因敲除实现，所用的引物对包括：cg12680-1f：5
’‑
cgggatccttgaccgtgactacacccc-3’；cg12680-1r：5
’‑
ggtgcctctttaatgggc-3’；cg12680-2f：5
’‑
ccggcccattaaagaggcaccggacgtcactttccacgag-3’；cg12680-2r：5
’‑
cggctagccctggggagatgaccatcaat-3’。6.根据权利要求1-5任一项所述的构建方法，其特征在于，所述提高转氢酶基因pntab的表达水平为通过采用如seq id no.20所示的启动子。7.根据权利要求1-6任一项所述的构建方法，其特征在于，所述微生物包括棒杆菌、大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中的一种或多种；优选为棒杆菌。8.权利要求1-7任一项所述的构建方法构建得到的重组微生物。9.权利要求1-7任一项所述的构建方法，或权利要求8所述的重组微生物在提高微生物生产氨基酸或其衍生物能力中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述氨基酸为天冬氨酸族氨基酸；优选为赖氨酸。

技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组微生物的构建方法及其应用。所述构建方法包括：降低微生物中的转录调控因子Cg12680的表达水平，提高转氢酶基因pntAB的表达水平。本发明研究发现转录调控因子Cg12680的失活可以在一定程度上提升棒杆菌生产赖氨酸的能力，而在同时提高转氢酶基因pntAB的表达水平时，棒杆菌生产赖氨酸的能力进一步大幅度提高，这在赖氨酸或其他天冬氨酸家族的生产领域有重要意义。要意义。


技术研发人员：王亚迪 胡丹 冯帆 赵津津 李岩
受保护的技术使用者：廊坊梅花生物技术开发有限公司
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/8/28