一种低温油藏空气驱催化岩石耗氧的嗜盐盐乳杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于油田微生物技术领域，具体涉及低温油藏空气驱催化岩石耗氧的嗜盐盐乳杆菌及其在催化岩石耗氧中应用。


背景技术：

2.注空气是一种利用空气压缩机将空气注入油藏，从而提高采收率的技术，具有气源丰富、成本低、不受地域及环境限制的优点。前人对空气驱的氧化原理、氧化动力等方面进行了详尽研究，并认为油藏温度高于60 ℃时，氧气与原油发生一系列复杂的化学反应，油藏中氧气才能消耗在地层内部，而不至于因氧气突破出现危险。
3.2007年以来，延长油区在宝塔油田长6油藏进行了空气泡沫驱油试验，该油藏地层温度为26~30 ℃，地层压力为4.2 mpa，平均渗透率为0.82
×
10-3
μm2，平均孔隙度为7.9%，是典型的低温低压低孔特低渗透油藏。由最初的2个井组扩大到目前61个井组，证明空气泡沫驱在该油藏是安全可行的，同时发现低温油藏空气驱耗氧主要因素是岩石矿物的吸附和氧化反应、原油消耗和地层水的溶解反应。但随着空气的不断注入，剩余氧气浓度随之升高，仍然存在安全隐患。
4.微生物耗氧/微生物催化岩石矿物耗氧作为一项安全环保的绿色技术，已被大量用于生物冶金、生物化工、环境保护等各个领域。在石油工业中，微生物耗氧技术常被用于原油的脱硫、石油污染土壤的修复、含油污水的处理等方面，而微生物采油主要集中于内源微生物的耗氧激活，或空气辅助微生物驱油等方面的研究，而关于微生物作为生物催化剂催化岩石矿物耗氧等方面研究却未见报道。


技术实现要素：

5.本发明提供低温油藏空气驱催化岩石耗氧的嗜盐盐乳杆菌及其应用，该菌株可利用空气中的co2为碳源，通过生物氧化作用氧化岩石矿物（富含黄铁矿）中的s
2-离子或单质s，获得生长所需的能量，同时在生长过程中产生大量的酸，进一步加速岩石矿物中s
2-或单质s等的溶解，并快速消耗空气中的氧气。
6.一种低温油藏空气驱催化岩石耗氧的嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)，为嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)yggs-81，所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)yggs-81于2022年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.25748。
7.所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)在原油开采空气驱催化岩石耗氧中的应用，所述岩石为含有黄铁矿的岩石。
8.优选地，所述应用在空气驱过程中，向油藏注入空气的同时，将所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)的发酵液稀释后注入油藏。
9.更优选地，稀释方式如下：将所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)的发酵液用注入水稀释至15%~20wt%后直接注入油藏。
10.更优选地，稀释方式如下：将所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)的发酵液用注入水稀释至5~10wt%，然后向其中加入营养物质混合后，再注入油藏，使所述嗜盐盐乳杆菌在油藏中进行激活和繁殖；其中，每升注入水对应的营养物质为(nh4)2so40.1~0.3g、k2hpo4·
3h2o 2.8~3.2g、mgso4·
7h2o 0.4-0.6g、cacl20.18~0.20g中的至少一种。
11.优选地，所述发酵液为将嗜盐盐乳杆菌的种子液接种于改良waksman液体培养基上，在28-32℃、160-180rpm下培养72-84h得到的发酵液。
12.更优选地，所述培养为在30℃、160rpm下培养72h。
13.优选地，所述改良waksman液体培养基如下：(nh4)2so40.1-0.3g，mgso4·
7h2o 0.4-0.6g，k2hpo4·
3h2o 2.8-3.2g，cacl2·
2h2o 0.18-0.20g，1000ml去离子水，用1:1硫酸溶液调ph 值至3.0-4.0，121℃高温高压灭菌15分钟；然后将10g单质硫s0经紫外照射灭菌后与该高压蒸汽灭菌后的培养基进行混合，得到改良waksman液体培养基。
14.本发明中嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)yggs-81的生物保藏信息：保藏日期：2022年9月16日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏编号：cgmcc no.25748；分类命名：嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)。
15.本发明的优点：本发明提供的嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)yggs-81，可以利用空气中的co2为碳源，通过氧化岩石矿物中黄铁矿中的s
2-离子或单质s0获得生长的能量，同时在生长过程中产生大量的酸，通过自身产酸过程加速黄铁矿在水溶液中的溶解速度，使黄铁矿更快速分解成fe
2+
和s
2-，并进一步将s
2-氧化成so
42-，同时不断产生h
+
。因此，该菌可作为一种微生物催化剂应用于空气驱或微生物辅助空气驱采油中，对保证空气驱安全性具有很好的应用潜力。
附图说明
16.图1为菌株yggs-81的16s rdna进化树；图2为菌株yggs-81的生物量与生物活性的关系；图3为菌株yggs-81的生物量与硫氧化率的关系；图4为菌株yggs-81对试验区岩石矿物的硫氧化速率。
具体实施方式
17.一. 培养基配方1. 改良waksman液体培养基：(nh4)2so40.1-0.3g，mgso47h2o 0.4-0.6g，k2hpo4·
3h2o2.8-3.2g，cacl2·
2h2o0.18-0.20g，1000ml去离子水，用1:1硫酸溶液调ph 值至3.0-4.0，121℃高温高压灭菌15分钟；然后将10g单质硫s0经紫外照射灭菌后与该高压蒸汽灭菌后的培养基进行混合，得到改良waksman液体培养基。
18.2. starky-na2s2o3固体培养基：a液：500ml去离子水中加入(nh4)2so42.0g，
k2hpo4·
3h2o3.0g，mgso47h2o 0.5g，cacl2·
2h2o0.25g，用1:1硫酸溶液调ph至3.0，121℃高温高压灭菌15分钟；b液：300ml去离子水中加入feso4·
7h2o 0.001g，na2s2o310g溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌；c液：将15g琼脂溶于200ml去离子水中，121℃高温灭菌15分钟；灭菌结束后待a液、c液温度降至60℃后将两者与b液混合即可。
19.3. 不含s0或s
2-的富集培养基：，k2hpo4·
3h2o 2.8~3.2g，mgso4·
7h2o 0.4-0.6g，cacl20.18~0.20g，去离子水1l，用1:1硫酸溶液调至培养基ph=3-4，121℃高温高压灭菌15分钟。
20.二. 嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)菌株的筛选1、菌株的富集将延长油田宝塔区块的油水样在采出后24h内于6000rpm离心30min，收集沉淀，接种于100ml改良waksman液体培养基中，放入30℃，转速160rpm的摇床中培养，直至锥形瓶中的培养基ph下降到2.0以下，取10ml培养液转接入90ml新鲜的改良waksman液体培养基中继续培养。重复以上培养操作连续转接3-4代；2、单菌株的分离在菌群驯化3-4代后，在无菌条件下，将驯化后得到的混合菌群分别稀释0、100、10000倍涂布到starky-na2s2o3固体培养基(平板)，倒置于30℃的恒温培养箱中培养。直到固体培养基上陆续出现直径为1 mm左右的圆形、边缘整齐、中间微凸的乳白色或淡黄色菌落时，挑取单菌落于改良waksman液体培养基中于30 ℃摇床中继续培养，待其ph降到2.0以下时，再同以上10倍稀释法步骤在固体培养基上再次进行划线分离培养，经过多次反复纯化，直至分离出单菌株，并命名为yggs-81，在4℃下储存；其中，所述改良waksman液体培养基：(nh4)2so40.2g，mgso4·
7h2o 0.5g，k2hpo4·
3h2o 3.0g，cacl2·
2h2o 0.20g，1000ml去离子水，用1:1硫酸溶液调ph 值至3.0，121℃高温高压灭菌15分钟；然后将10g单质硫s0经紫外照射灭菌后与该高压蒸汽灭菌后的培养基进行混合，得到改良waksman液体培养基。
21.三.菌株yggs-81的鉴定分离的菌株通过比对16s rdna序列来确定种属。使用powersoil dna isolation kit试剂盒提取菌株yggs-81的基因组，并以此为模板，使用下列引物对16s rdna序列进行pcr扩增：上游引物（f27）：5
’‑
agtttgatcmtggctcag
ꢀ‑3’
；下游引物（r1492）：5
’‑
ggttaccttgt tacgactt
ꢀ‑3’
；pcr反应体系如下：2
×
pfu master mix25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，模板2μl，ddh2o至50μl；pcr反应条件：预变性94℃ 3min；30次循环：变性94℃ 30s，退火57℃ 30s，延伸72℃ 2min；后续延伸72℃ 5min，4℃停止反应并保温；得到的pcr产物经回收纯化后，送至上海美吉生物工程技术服务有限公司进行
sanger测序。所得序列经blast(ncbi)后，使用mega软件绘制进化树，如图1所示，最终确定菌株yggs-81属于嗜盐盐乳杆菌属(halolactibacillushalophilus)，命名为嗜盐盐乳杆菌属(halolactibacillushalophilus)yggs-81。
22.所述菌株yggs-81已于2022年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.25748，分类命名为盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)。
23.四.菌株yggs-81的硫氧化活性（1）种子培养：将4℃保藏的菌株yggs-81活化后接种于100ml 改良waksman液体培养基中，于30℃160rpm过夜振荡培养至对数生长期，得嗜盐盐乳杆菌yggs-81种子液；（2）硫氧化活性测定：将全部种子液经中性定性滤纸过滤，滤液用10000
×
g离心后收集下部菌体，用ph=3的硫酸水溶液清洗3次除去杂质离子，再次离心沉淀后重新悬浮于100ml的的硫酸水溶液中，按照0%、5%、10%、15%20%(v/v)的接种量接种至ph=3的硫酸水溶液中，然后按10g/ｌ加入单质硫，于30℃，160rpm恒温振荡培养7天，培养结束后，反应液于8000rpm/min冷冻离心5分钟，收集上清液，用ph测定仪测定反应液的ph（图2），同时采用离子色谱测定反应液中so
42-浓度，计算反应体系中硫的氧化率（图3）；以不加嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)的作为对照组，即接种量为0%的实验样品；通过考察菌株生物量分别为5%，10%、15%、20%（v/v）时的反应液最终ph值（图2）和反应液中硫的氧化率（图3），发现随着盐乳杆菌生物量的增加，反应液ph值逐渐降低，在生物量为15%时，反应液中ph值可由初始的3.0下降至1.2左右，这表明盐乳杆菌在不断繁殖的同时产生大量的h
+
，使反应液ph值降低。同时，反应液中浓度逐渐增加，且生物量越大，so
42-浓度增加的速度越快，表明嗜盐盐乳杆菌生物量越大，其催化氧化单质硫的活性就越强，单质硫的氧化率就越高。当嗜盐盐乳杆菌生物量为15%时，反应结束后单质硫的氧化率可达91.2%，相对于对照组的7.2%，硫氧化率提高了84%。
24.说明嗜盐盐乳杆菌的生物量对岩石矿物中硫的氧化速度和氧化效率是其主控因素，当生物量为15-20%时，硫的氧化率较高。
25.五. 菌株yggs-81对试验区岩石矿物生物氧化试验测试将不含s0或s
2-的富集培养基85%（v/v）、15%(v/v)嗜盐盐乳杆菌yggs-81种子液4g/l粒径为1-2mm的延长油田宝塔区块试验区岩石样品（富含黄铁矿）混合后，30℃，160 r/min振荡培养最少30天，培养期间分别在第0、5、10、15、20、25、30天取反应液5ml于8000rpm /min冷冻离心5分钟，收集上清液，离子色谱法测定反应体系中so
42-的浓度，以不加嗜盐盐乳杆菌yggs-81种子液的作为对照，见图4；其中，所述不含s0或s
2-的富集培养基如下：(nh4)2so40.2g，k2hpo4·
3h2o 3.0g，mgso4·
7h2o 0.5g，cacl20.20g，去离子水1l，用1:1硫酸溶液调制培养基ph=3，121℃高温高压灭菌15分钟。
26.结果显示，随着反应时间的延长，30天检测显示嗜盐盐乳杆菌可使岩石矿物中氧化速率大幅提高，与未加菌的对照相比，so
42-浓度是未加嗜盐盐乳杆菌对照组的5倍（图4），由此可知，嗜盐盐乳杆菌可加快岩石矿物中硫的氧化速率。
27.盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus) yggs-81是一种化能自养型微生物，可利用空气中的co2为碳源，通过氧化富含黄铁矿的岩石矿物中的离子获得生长所需的能量，在生长过程中加速黄铁矿岩石矿物的快速氧化，消耗空气中的氧气。因此，在空气驱提
高采收率过程中，可利用该菌对岩石矿物的生物氧化作用，快速消耗空气中的氧气，保证空气驱油藏的安全生产。在空气驱提高采收率过程中，向油藏注入空气的同时，将所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)的发酵液稀释后注入油藏；其中，稀释方式为以下两种方式中的任意一种：a. 将所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)的发酵液用注入水稀释至15%~20wt%后直接注入油藏；b. 将所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillushalophilus)的发酵液用注入水稀释至5~10wt%，然后向其中加入营养物质混合后，再注入油藏，使所述嗜盐盐乳杆菌在油藏中进行激活和繁殖；其中，每升注入水对应的营养物质为(nh4)2so40.1~0.3g、k2hpo4·
3h2o 2.8~3.2g、mgso4·
7h2o 0.4-0.6g、cacl20.18~0.20g中的至少一种。
28.优选地，所述发酵液如下：将嗜盐盐乳杆菌的种子液，按照5-20%的接种量接种于新鲜的改良waksman液体培养基上，在28-32℃、160-180rpm下培养72-84h得到发酵液。
29.更优选地，所述发酵液如下：将嗜盐盐乳杆菌的种子液，按照15-20%的接种量接种于新鲜的改良waksman液体培养基上，在30℃、160rpm下培养72h得到发酵液。

技术特征：
1.一种低温油藏空气驱催化岩石耗氧的嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)，其特征在于：其为嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)yggs-81，所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)yggs-81于2022年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.25748。2.权利要求1所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)在原油开采空气驱催化岩石耗氧中的应用，其特征在于：所述岩石为含有黄铁矿的岩石。3.根据权利要求2所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)在原油开采空气驱催化岩石耗氧中的应用，其特征在于：在空气驱过程中，向油藏注入空气的同时，将所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)的发酵液稀释后注入油藏。4.根据权利要求3所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)在原油开采空气驱催化岩石耗氧中的应用，其特征在于：将所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)的发酵液用注入水稀释至15%~20wt%后直接注入油藏。5.根据权利要求3所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)在原油开采空气驱催化岩石耗氧中的应用，其特征在于：将所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)的发酵液用注入水稀释至5~10wt%，然后向其中加入营养物质混合后，再注入油藏；其中，每升注入水对应的营养物质为(nh4)2so
4 0.1~0.3g、k2hpo4·
3h2o 2.8~3.2g、mgso4·
7h2o 0.4-0.6g、cacl20.18~0.20g中的至少一种。6.根据权利要求3或4或5所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)在原油开采空气驱催化岩石耗氧中的应用，其特征在于：所述发酵液为将嗜盐盐乳杆菌的种子液接种于改良waksman液体培养基上，在28-32℃、160-180rpm下培养72-84h得到的发酵液。7.根据权利要求6所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)在原油开采空气驱催化岩石耗氧中的应用，其特征在于：在30℃、160rpm下培养72h。8.根据权利要求7所述嗜盐盐乳杆菌(halolactibacillus halophilus)在原油开采空气驱催化岩石耗氧中的应用，其特征在于：所述改良waksman液体培养基如下：(nh4)2so40.1-0.3g，mgso4·
7h2o 0.4-0.6g，k2hpo4·
3h2o 2.8-3.2g，cacl2·
2h2o 0.18-0.20g，1000ml去离子水，用1:1硫酸溶液调ph 值至3.0-4.0，121℃高温高压灭菌15分钟；然后将10g单质硫s0经紫外照射灭菌后与该高压蒸汽灭菌后的培养基进行混合，得到改良waksman液体培养基。

技术总结
本发明公开一种低温油藏空气驱催化岩石耗氧的嗜盐盐乳杆菌，于2022年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.25748。同时，本发明还公开所述嗜盐盐乳杆菌在原油开采空气驱催化岩石耗氧中的应用，该菌株可利用空气中的CO2为碳源，通过生物氧化作用氧化岩石矿物中的S


技术研发人员：康宵瑜 薛媛 王维波 王锰 管雅倩 冯震 薛迪 霍庆丰 董小刚
受保护的技术使用者：陕西延长石油（集团）有限责任公司
技术研发日：2023.05.05
技术公布日：2023/8/28