一株小单孢菌及其吸附矿化稀土元素的应用

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株小单孢菌及其吸附矿化稀土元素的应用。


背景技术：

2.放线菌是一群革兰氏阳性、高(g+c)mol％含量(》55％)的微生物，因其绝大多数菌体形态为长丝状而得名，在矿山环境中广泛分布，已经有报道各种不同类型的岩石环境都有放线菌生存。一般认为放线菌能够在有机质的矿化、矿物营养固定、保护环境等方面发挥重要的作用，通过生物力学、生物化学过程与矿物、金属、类金属相互作用，从而达到固定、释放各种金属元素的目的，参与了基本营养和金属的生物地球化学循环。小单孢菌是一类优势放线菌，因产生结构新颖的天然活性产物在新型抗菌药物及抗肿瘤抗生素方面备受关注，从小单孢菌属中发现天然活性物质位居稀有放线菌的榜首。不仅如此，小单孢菌在生物吸附矿化方面也有优异表现：实验室前期研究发现，小单孢菌属放线菌吸附稀土元素镧的能力高于其他种属放线菌，并可通过细胞表面的羧基、氨基和羟基等官能团通过静电吸附和配体交换提供结合位点将稀土元素吸附于细胞表面。
3.稀土元素因其独特性质能够广泛参与多种微生物中化合物的代谢，有关稀土元素的微生物矿化研究也逐渐引起学者们的关注。稀土元素共有17种，分为轻、中、重稀土元素，包括15种镧系元素(lns)及与镧系同族的元素钇(y)和钪(sc)，它们因具有类似的化学性质而表现出类似的生物效应。稀土是先进装备制造业、新能源、新兴产业等高新技术产业不可缺少的原材料，在各种材料的制备过程中添加稀土可以显著地改变材料性质，提高材料性能，因此长期以来被广泛地应用于各种尖端科技、军工领域和核工业等40多个行业领域，被誉为“新材料之母”、“现代工业的维生素”等。随着稀土需求的不断增加，稀土矿山大量露天开采，导致越来越多的外源稀土进入到土壤及地下水中，影响动植物及人类的生长、发育及繁殖，给生态环境和人类健康带来严重威胁。全球范围内的稀土矿资源普遍存在着过度开发、资源利用率低及环境污染严重等问题，因此，采用绿色环保的提纯方法从环境中去除稀土元素变得非常重要。
4.目前对稀土元素的富集的方法主要有物理、化学方法和微生物方法。然而，由于受污染环境中的稀土浓度通常偏低，使用物理或化学方法成本偏高且还会造成二次污染。微生物通过生物吸附、矿化和共沉淀等方法可高效固定环境中稀土元素，达到修复土壤污染及水生生态系统污染的目的。自上世纪八十年代以来，人们就已经开始尝试使用微生物通过生物浸出、生物吸附和矿化等方法对采矿废物和工业废弃物中的稀土元素进行回收和利用。国内外报道的生物吸附矿化稀土元素的微生物多集中在细菌和真菌，如姜明玉等人报道利用酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)吸附水溶液中的ce、yb、sm，在微生物的作用下形成了纳米级的独居石相晶体。maleke等人采用细菌(thermus scotoductus sa-01)生物矿化eu形成碳酸盐矿物。horiike等人利用真菌(penidiella sp.t9)诱导形成含dy
无定型磷酸盐矿物。程扬健等人通过地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)吸附矿化水溶液中的ce，形成磷酸铈矿物。然而，目前关于放线菌生物吸附矿化稀土元素的相关报道较少。


技术实现要素：

5.发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明目的是提供一株金黑小单孢菌及其吸附矿化稀土元素的应用，该金黑小单孢菌能够吸附矿化稀土元素，如镧(laⅲ)、钐(smⅲ)、镝(dyⅲ)等，从而达到吸附固定溶液中的稀土元素，实现对稀土元素的富集，该方法对比物理或化学方法具有更加环境友好的优点，并且为实现稀土元素回收、提纯提供参考依据。
6.技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
7.一株小单孢菌，所述小单孢菌为金黑小单孢菌klbmp 9673(micromonospora auratinigra.klbmp 9673)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2023年03月15日，保藏编号为gdmcc 63268。
8.所述菌株金黑小单孢菌klbmp 9673分离自贵州白云岩风化壳剖面稀土层土壤，其菌落在isp2脂培养基上为橙色，不透明，菌落表面褶皱状，具有分支的基内菌丝。
9.所述小单孢菌klbmp 9673的16s基因序列如seq id no.1所示。
10.本发明还提供了所述的小单孢菌在吸附矿化稀土元素中的应用。
11.优选的，所述稀土元素包括稀土元素镧、钐、镝。
12.本发明还提供了所述的小单孢菌在制备吸附矿化稀土元素产品中的应用。
13.优选的，所述稀土元素包括稀土元素镧、钐、镝。
14.本发明还提供了一种组合物，包含所述的小单孢菌。
15.本发明还提供了所述的组合物在吸附矿化稀土元素中的应用。
16.优选的，所述稀土元素包括素镧、钐、镝。
17.有益效果：与现有技术相比，本发明提供一株新的金黑小单孢菌klbmp 9673，其可耐受高浓度稀土元素，利用本发明所述菌株，能高效吸附固定溶液中的稀土元素，有效降低稀土采矿废水和工业废弃物中的稀土浓度。由于该菌种普遍存在于土壤中，不会破坏土壤自身的生物多样性，在吸附矿化过程中，安全且高效，不会产生对环境不利的污染物，在修复环境污染方面具有极大的应用前景。
附图说明
18.图1为本发明菌株的培养特征图，(a)klbmp 9673在isp2培养基上培养7d的形态特征图(b)klbmp 9673在isp2培养基上培养14d的扫描电子显微镜图。
19.图2为基于本发明菌株的16s rdna基因序列构建的系统发育树。
20.图3为本发明菌株对la(ⅲ)的耐受结果柱状图。
21.图4为本发明菌株吸附稀土元素的吸附量及吸附率，(a)吸附量(b)吸附率。
22.图5为本发明菌株生物吸附矿化后的电镜图及能谱图，(a)阴性对照(b)klbmp 9673吸附矿化la(ⅲ)后的电镜及能谱图(c)klbmp 9673吸附矿化sm(ⅲ)后的电镜及能谱图(d)klbmp 9673吸附矿化dy(ⅲ)后的电镜及能谱图。
23.图6为本发明菌株生物吸附矿化后的傅里叶红外光谱图。
具体实施方式
24.通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
25.实施例1：菌株的分离与鉴定
26.本实施例提供的一株高效生物吸附矿化稀土元素镧的小单孢菌是从在贵州省安顺市(26
°
34
′‑
26
°
46
′
n，106
°
11
′‑
106
°
53
′
e)的白云岩风化壳剖面稀土层土壤样品中分离、筛选和纯化后获得的。具体方法如下：采集土壤样品后低温保存运回实验室，在实验室无菌风干后，取1g样品于无菌玻璃瓶中，120℃烘干1h，冷却后加无菌水9ml，充分混匀制成10-1
土壤悬液并稀释100为10-2
，吸取200μl涂布平板，28℃培养28d。待平板上长出单菌落后挑取橙色不透明单菌落多次划线纯化后获得klbmp 9673。该菌株于isp2平板上的培养特征为(图1a)：菌落为橙色，表面褶皱状，生长周期后期会变成黑色，无气生菌丝，在isp2培养基上不产生色素。通过扫描电子显微镜观察了klbmp 9673在isp2平板上培养了14d后的培养特征，实验结果表明，该小单孢菌孢子单生，圆形或椭圆形，表面瘤状，着生在短孢子梗，无鞭毛不游动；无孢子链和孢子囊。将菌株划线于斜面试管，置恒温培养箱中28℃培养7d后，于4℃的冰箱中保存。本实施例1中的isp2培养基配方为：酵母提取物4.0g，麦芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0l，ph7.2，高压蒸汽灭菌20分钟后备用。
27.该菌株的16s rdna基因序列特征：采用微波法结合酚-氯仿法提取放线菌基因组dna。利用通用引物primer a(5'-cagagtttgatcctggct-3')和primer b(5'-aggaggtgatccagccgca-3')对16s rrna基因进行扩增，50μl反应体系和pcr扩增反应条件参照杜瑞等的方法。pcr扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，其16s基因序列如seq id no.1所示。使用chromas(version 2.6.5)软件查看dna峰图质量，将得到的16s rrna基因序列上传至数据库ezbiocloud(http：//www.ezbiocloud.net/)进行同源序列blast比对分析。克隆测序结果显示该菌株为小单孢菌属(micromonospora)放线菌，与金黑小单孢菌(micromonosporaauratinigra dsm 44815
t
)相似度为99.4％。该菌株的16s rrna基因序列与genbank中的相应菌株序列进行比对，使用mega7.0软件按邻接法构建系统发育树，基于1000次重复的抽样分析。构建得到的该菌的16s rrna基因系统发育树如图2所示，菌株klbmp 9673和金黑小单孢菌m.auratinigra dsm 44815
t
聚集在一个分支上。结合菌株的培养基观察特征、形态学特征和16s rrna基因系统发育特征，我们确定klbmp 9673归属于金黑小单孢菌，菌株名为micromonospora auratinigra.klbmp 9673。
28.将上述菌株进行保藏，菌株名为金黑小单孢菌klbmp 9673(micromonospora auratinigra.klbmp 9673)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2023年03月15日，保藏编号为gdmcc 63268，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼。
29.实施例2：小单孢菌klbmp 9673的耐受
30.将实施例1筛选得到的小单孢菌klbmp 9673通过下述实验证实有较好的耐受稀土
元素的作用：从保存的斜面中挑取klbmp 9673菌体，接种于isp2固体培养基中进行活化，培养7d后，从固体培养基上挑取新鲜菌体接种于含镧元素的isp2液体培养基中进行耐受培养。耐受浓度梯度为0、100、200、300、400mg/l，在28℃，180rpm条件下培养5天。培养结束后，7000rpm离心10分钟，收集菌体称量湿重生物量后获得klbmp 9673对镧元素的耐受结果(图3)。在耐受培养期间观察到，该小单孢菌培养液颜色会发生变化；0浓度条件下培养3d，培养液会变为橙黄色；100mg/l浓度下颜色有轻微变化；培养至第五天，200mg/l和300mg/l浓度下培养液颜色发生变化，均为淡橙黄色。400mg/l条件下，培养液颜色均无变化。通过耐受结果(图3)可知，klbmp 9673在含镧元素为0-300mg/l的培养基中能正常生长，但当培养基中镧元素浓度添加到400mg/l时菌体生长受到抑制。鉴于此可知，浓度越高，对于细胞影响作用越大，当la浓度达到400mg/l时，klbmp 9673菌体受到严重影响，近乎停止生长。
31.实施例3：小单孢菌klbmp 9673对稀土元素镧(laⅲ)、钐(smⅲ)、镝(dyⅲ)的生物吸附
32.按照实施例2所述方法将本发明菌株活化培养后，挑取新鲜菌体接种入液体isp2培养基中28℃，180rpm培养5d后收集菌体，用无菌蒸馏水清洗菌体3次。分别将20ml的镧(laⅲ)、钐(smⅲ)、镝(dyⅲ)溶液(20mg/l)与0.5g/l干重的菌体混合，28℃，180rpm条件下振荡吸附，做3个重复，阴性对照为不加菌体。
33.镧元素浓度检测方法为使用偶氮胂ⅲ分光光度法：每间隔30min取0.5ml上清液，加入3.1ml超纯水，0.4ml显色剂，1ml缓冲液，在od
660nm
处测定吸光度，测定上清液中稀土元素的浓度，直至达到吸附平衡(同理，钐元素与镝元素也采用偶氮胂ⅲ分光光度法检测)。用紫外分光光度计测定吸附前后溶液中稀土离子浓度，吸附量q(mg/g)和吸附率r(％)的计算方法如下：
34.q ＝ (c
0-ce)/m
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
35.r ＝ (c
0-c
e)
/c0·
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(2)
36.式中c0：吸附前溶液中初始稀土离子浓度(mg/l)，ce：吸附后剩余的浓度(mg/l)，m：吸附剂用量(g/l)。
37.基于吸附曲线可观察到，klbmp 9673在吸附液中摇瓶培养30min后，溶液中的稀土元素已经低于检测阈值，达到吸附平衡，整个实验持续3h。根据计算公式可得出，klbmp 9673对镧(laⅲ)的吸附量为34.7mg/g，吸附率为78.1％；对钐(smⅲ)的吸附量为37.9mg/g，吸附率为84.7％；对镝(dyⅲ)的吸附量为32.8mg/g，吸附率为75.3％(图4)。
38.实施例4：小单孢菌klbmp 9673对稀土元素镧(laⅲ)、钐(smⅲ)、镝(dyⅲ)吸附矿化的扫描电镜表征
39.为了进一步了解小单孢菌klbmp 9673对稀土元素镧(laⅲ)、钐(smⅲ)、镝(dyⅲ)生物吸附矿化机制，采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，sem)及能量色散x射线谱仪(energy dispersive spectrometer，eds)研究了klbmp 9673的形貌变化及其对稀土元素的吸附和/或积累，采用傅里叶红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy，ftir)分析方法探讨了稀土元素与klbmp 9673细胞壁表面相互作用的官能团。挑取新鲜菌体接种入液体isp2培养基中28℃，180rpm培养5d后收集菌体，用无菌蒸馏水清洗菌体3次。分别将20ml的镧(laⅲ)、钐(smⅲ)、镝(dyⅲ)溶液(20mg/l)与0.5g/l干重的菌体混合，28℃，180rpm，12h条件下振荡培养，做3个重复，阴性对照为不加菌体。12h后去除
吸附液，5000rpm，10min条件下收集菌体，并用无菌水冲洗3次。用2.5％戊二醛溶液中固定后，真空冷冻干燥后获得的菌体，一部分菌体喷金，用于扫描电镜下观察，一部分菌体与kbr混合压成薄片，样品/kbr重量比为1：30。将薄片放置在ftir光谱仪的红外光束中，并在4000-400cm-1
的范围内扫描。
40.观察扫描电镜结果图5可知，klbmp 9673在添加了镧(laⅲ)(图5b)、钐(smⅲ)(图5c)、镝(dyⅲ)(图5d)元素的吸附液中反应后，菌丝上出现了明显的颗粒状物体，未加稀土元素的阴性对照菌丝表面光滑(图5a)。eds结果表明，在细胞表面分别检测到了镧(la)、钐(sm)、镝(dy)元素，阴性对照组中仅检测到共有元素c、n、o、pt(强烈的钯峰存在归因于用于镀膜的pt)。
41.通过比较klbmp 9673吸附稀土元素前后的傅里叶红外光谱图(图6)可知，3500-3200cm-1
处的出现较宽的吸收峰是羟基和氨基的伸缩振动峰的叠加引起的；2923cm-1
左右处峰值发生偏移，是—ch键的伸缩振动引起；在2360cm-1
处峰值偏移通常归因于p—o拉伸振动；1644cm-1
左右出现的低强度峰值和发生峰偏移是酰胺和多糖中的醛基、羰基和羧基伸缩振动引起的；1400cm-1
处为—cooh的特征峰，1045cm-1
左右出现的峰值对应磷酸基团吸收峰发生偏移。总体而言，峰值的偏移和强度的变化表明稀土元素与细胞分子键相关的官能团量的变化，傅里叶红外光谱分析表明小单孢菌klbmp 9673与稀土元素的相互作用主要通过酰胺基团的羧基、氨基、羰基和磷酸盐发生。
42.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一株小单孢菌，其特征在于，所述金黑小单孢菌为klbmp 9673(micromonospora auratinigra.klbmp 9673)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2023年03月15日，保藏编号为gdmcc 63268。2.根据权利要求1所述的高耐受稀土元素小单孢菌，其特征在于，所述金黑小单孢菌klbmp 9673的16s基因序列如seq id no.1所示。3.权利要求1所述的小单孢菌在吸附矿化稀土元素中的应用。4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述稀土元素包括素镧、钐、镝。5.权利要求1所述的小单孢菌在制备吸附矿化稀土元素产品中的应用。6.权利要求5所述的应用，其特征在于，所述稀土元素包括稀土元素镧、钐、镝。7.一种组合物，包含权利要求1所述的小单孢菌。8.权利要求7所述的组合物在吸附矿化稀土元素中的应用。9.权利要求8所述的应用，其特征在于，所述稀土元素包括稀土元素镧、钐、镝。

技术总结
本发明公开了一株小单孢菌及其吸附矿化稀土元素的应用，所述小单孢菌为金黑小单孢菌KLBMP 9673(Micromonospora auratinigra.KLBMP 9673)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期为2023年03月15日，保藏编号为GDMCC 63268。所述金黑小单孢菌KLBMP 9673可耐受高浓度稀土元素，利用本发明所述菌株，能高效吸附固定溶液中的稀土元素，有效降低稀土采矿废水和工业废弃物中的稀土浓度。由于该菌种普遍存在于土壤中，不会破坏土壤自身的生物多样性，在吸附矿化过程中，安全且高效，不会产生对环境不利的污染物，在修复环境污染方面具有极大的应用前景。复环境污染方面具有极大的应用前景。复环境污染方面具有极大的应用前景。


技术研发人员：曹成亮 张娅 刘凌霄 姚佳琪 汪莉莉 马周爱 蒋继宏
受保护的技术使用者：江苏师范大学
技术研发日：2023.05.06
技术公布日：2023/8/28