一种发光菌阵列传感器检测手性物质的方法与流程

1.本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种发光菌阵列传感器检测手性物质的方法。


背景技术：

2.目前手性分离和手性传感技术是主要的手性分析手段。其中，手性分离技术包括结晶法、酶动力学法、色谱法、毛细管电泳法等，这些技术己被证明是有效的手性分析方法，但也有明显的不足之处，如容易引起生物类手性选择剂和分析对象的构型变化或失活、仪器成本高、操作繁琐、分析时间长以及难以实现原位和在线检测等缺点。相对于手性分离技术的不足，手性传感技术具有简单、经济、快速和高通量等优点，更能满足药物开发、临床诊断和手性催化剂筛选等领域的要求。与所有手性识别方法一样，手性传感器也需要有手性选择剂用于实现对映体识别。通常，手性选择剂可以是常规的手性分子如手性冠醚、环糊精及蛋白质等，也可能是一些手性的超分子组装体及纳米复合材料等。迄今为止手性传感技术已得到蓬勃发展并取得长足进步，但它们在手性药物分析实践中的应用远没有经典手性色谱分离等手段广泛。制约手性传感器的广泛应用的瓶颈在于，不管是基于手性分子、超分子组装体乃至纳米复合材料的手性传感器，当不同对映体共存时，它们同时产生的信号往往无法区分而相互干扰。因此，推进手性传感器在药物分析领域的实际应用的一个主要途径为提高其对映体差异性识别能力。
3.众所周知，组成生物体的主要生物分子都是以严格单一手性形式存在的。因此生物体系具有超强的手性识别能力，相关的生理过程可呈现出100％的对映体选择性。手性在药物研究中的重要性就是来源于生物体的这种超强对映体识别能力。这也表明，生物体系具有人工合成手性选择剂以及蛋白质等生物分子完全无法比拟的对映体差异性识别效果。因此，如果能以活的“生物体”为手性选择剂用于手性传感技术，将大大提高其手性分析的能力。而细菌等微生物也是一个精密、复杂的单一手性体系，并且是可以被不断消耗的资源，尤其是发光细菌恰好兼具了手性识别及信号转导两个功能。因此，发光细菌就是一个完整的手性生物发光传感器。不同的手性对映体会对发光细菌造成不同的生物效应，从而会改变发光细菌的某些生物化学过程，进而造成其生物发光系统受到影响
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促进或抑制。
4.目前，已有多家仪器公司利用天然的发光细菌开发出了各种环境毒物检测仪器，在环境监测领域发挥重要的作用。然而，基于天然发光细菌的毒物检测是不具有分子选择性的，只是一个模糊的衡量指标。最大的原因在于天然发光细菌的功能单一，尽管具有潜力但还无法满足更精细的定性及定量分析需求。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供一种发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，以实现对手性物质进行同时定性及定量分析，为手性物质的检测提供可参考的新的分析方法。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.第一方面，一种发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，所述方法是将发光菌阵列传感器与待测液混合反应后进行吸收光谱扫描，得到待测液的光谱数据，对光谱数据进行线性判别lda分析，将lda图谱中未知样本数据点的位置与已知类型手性物质数据点进行比对，即可判定待测液中手性物质的类型组成和含量；所述发光菌阵列传感器由至少两种发光细菌组成。
8.在某些具体实施方案中，所述发光细菌为重组大肠杆菌e.coli、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58、枯草芽孢杆菌b.subtilis和天然发光细菌费氏弧菌v.fischeri。
9.在某些具体实施方案中，所述已知类型手性物质的lda图谱是将发光菌阵列传感器与不同浓度的已知类型手性物质混合后进行扫描，得到待测液的光谱数据，对光谱数据进行线性判别lda分析获得的。
10.在某些具体实施方案中，所述手性物质为单糖、手性催化剂和药物中的一种。
11.进一步，所述单糖为葡萄糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖中的一种或多种。
12.进一步，所述单糖为葡萄糖、木糖和甘露糖中的一种或多种。
13.在某些具体实施方案中，所述单糖浓度为10-1000μm。
14.进一步，所述单糖的浓度为50-500μm。
15.第二方面，根据前述方法在手性物质检测方面的应用。
16.与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
17.本发明的方法用于手性识别，通过lda处理矩阵数据，从而同时对不同手性和浓度的手性物质(单糖、甜味剂)进行了正确识别，并对其识别的机理进行了初步的探究；该方法具操作简单，能够用于手性快速检测，具有一定的实用性和应用前景。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
19.图1为本发明所提供的方法中四种发光细菌的归一化生物发光光谱(a)和生物发光强度(b)；
20.图2为本发明实施例2中不同单糖的分类散点图；
21.图3为实施例3中不同l/d构型比例单糖线性回归图；
22.图4为实施例4中不同甜味剂的分类散点图；
23.图5为本发明所提供的发光菌阵列传感器检测手性物质的方法的四种发光细菌测试核糖时mtt结晶量柱状图。
具体实施方式
24.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
25.下述实施例中，本技术人以手性物质-单糖为例，对发光菌阵列传感器检测手性物质的方法进行举例说明。
26.下述实施例中，所使用的发光细菌的浓度均为1.3
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，同时发光细菌与单糖的体积比均为1:1。
27.实施例1：发光细菌的构建
28.本技术中的发光细菌为重组大肠杆菌e.coli、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58、枯草芽孢杆菌b.subtilis和天然发光细菌费氏弧菌v.fischeri。其中重组大肠杆菌e.coli(ec-lux)、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58(at-lux)、枯草芽孢杆菌b.subtilis(bs-lux)的构建方法为：将购买的含有lux发光基因的商业质粒，通过cacl2化学诱导法转化至相应的细菌中，成功构建重组大肠杆菌e.coli、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58、枯草芽孢杆菌b.subtilis三种重组发光细菌，并用酶标仪对三种重组菌和天然发光细菌费氏弧菌(v.fischeri)在相同的细胞浓度(1.3
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)下进行了发光性能的表征，得到发光细菌的发光光谱，其发光光谱图如图1所示，从图中可知，其发光光谱分布在400nm到650nm之间，并且在490nm处有最大发光强度，说明质粒导入细菌成功，且重组细菌的发光性能良好，能够用于后续实验。
29.当然，本技术中的重组大肠杆菌e.coli、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58、枯草芽孢杆菌b.subtilis的构建属于本领域的常规技术，本领域技术人员可以直接购买获得，也可以通过本领域的公开的已知方法制备获取。
30.实施例2：发光菌对不同类型对映体单糖的区别检测
31.在实施例1的基础上，本实施例分别将待测液加入重组大肠杆菌e.coli、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58、枯草芽孢杆菌b.subtilis和天然发光细菌费氏弧菌v.fischeri中进行混合反应后进行扫描，得到待测液的光谱数据，对光谱数据进行线性判别lda分析，将lda图谱中未知样本数据点的位置与已知类型金属离子数据点进行比对，即可判定待测液中单糖的类型组成。
32.具体的，我们选取六种常用的单糖，分别是葡萄糖glucose、核糖ribose、木糖mannose、甘露糖mannose、半乳糖galactose、阿拉伯糖arabinose，作为发光细菌检测的标准样品。我们先利用发光细菌对不同浓度单糖进行响应，以找到最佳识别浓度。我们分别配制了六种单糖的l和d型溶液，设置了10μm、50μm、100μm、500μm、1mm、5mm、10mm七个浓度梯度，加入到96孔板中，做六组平行实验。然后再分别加入等体积量的实施例1中的四种浓度为1.3
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的发光细菌(重组大肠杆菌e.coli、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58、枯草芽孢杆菌b.subtilis和天然发光细菌费氏弧菌v.fischeri)，利用四种发光细菌对六种单糖的不同浓度和构型进行反应识别，再利用酶标仪对其反应后进行发光强度测定，通过与相同条件下空白对照相比较，对所测得的发光数据进行归一化处理。再利用spss进行lda判别分析，采用origin软件进行分析作图，得到每个浓度的数据如图2所示，从图2所示的三维散点图可以发现，各种单糖对应的数据能被正确分类，六种单糖完全被区分，落在不同的区域；同时每组三维图中样品点均分散开来，spss输出结果中分类准确率为100％。说明了发光细菌对不同种类，不同手性的单糖的发光强度存在差异。因此，可利用这四种细菌构建阵列，对单糖等物质进行种类和手性分析。同时，对比分析所得数据图像，我们发现四种重组发光细菌对葡萄糖、木糖、甘露糖三种单糖对应在50μm、1mm、50μm浓度下的发光强度差异
最大，识别效果最好，即最能将不同类型对映体区分开。
33.实施例3：发光菌阵列传感器对不同对映体单糖混合物的区别检测
34.在实施例2的基础上，本技术中将重组大肠杆菌e.coli、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58、枯草芽孢杆菌b.subtilis和天然发光细菌费氏弧菌v.fischeri组成发光菌阵列传感器，用于对多种不同对映体的单糖同时存在时的检测性能，从实施例2可知，选用发光强度差异最大的葡萄糖、木糖、甘露糖，以及他们对应的最佳识别浓度分别为50μm、1mm、50μm。然后在最佳识别浓度下，分别配制下列不同l/d构型比例的葡萄糖、木糖、甘露糖溶液：100％l、80％l+20％d、60％l+40％d、40％l+60％d、20％l+80％d、100％d，然后加入等量至96孔板中，再加入等体积的发光菌阵列传感器，利用由四种发光细菌组成的发光菌阵列传感器进行反应识别，用酶标仪测定反应后的发光强度。通过与相同条件下空白对照相比较，对所测得的数据进行归一化处理后，利用spss进行判别分析，采用origin作图得到图3，图3的线性图是用spss软件对数据进行lda处理后，最佳判别因子下数据集对应的线性投影坐标值，对其进行线性分析所得每组线性较好，说明所构建的发光细菌阵列能正确分类识别不同比例的混合构型溶液，即能对不同构型手性单糖分子进行识别。
35.实施例4：发光菌阵列传感器在实际样品-甜味剂中的识别应用
36.为了评估该方法在实际应用中的潜力，将该发光菌阵列传感器检测手性物质的方法应用于实际糖类样品的检测。具体为：
37.本技术选取五种常用的甜味剂作为实际样品用于阵列识别，分别是阿斯巴甜、山梨糖醇、木糖醇、糖精钠、甜蜜素。为了寻找到对单糖分子手性对映体的最佳识别浓度和糖类，我们先利用四种发光细菌分别对不同浓度甜味剂进行响应识别找到最佳浓度。首先我们设置了10μm、50μm、100μm、500μm、1mm、5mm、10mm七个浓度梯度，分别配制了五种甜味剂溶液，加入到96孔板中，做六组平行实验。然后再加入等体积量的发光菌阵列传感器(重组大肠杆菌e.coli、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58、枯草芽孢杆菌b.subtilis和天然发光细菌费氏弧菌v.fischeri组成发光菌阵列传感器)，利用其对五种甜味剂的种类进行反应识别，再利用酶标仪对其反应后进行发光强度测定。通过与相同条件下空白对照相比较，对所测得的发光数据进行归一化处理，再利用spss进行lda判别分析，采用origin软件进行分析作图，得到每个浓度的数据图如图4所示(图中的散点图是对每一个数据用lda进行分析过后，将数据转化成判别分数，再转化成的三维图)，从图4中可以看出，各种甜味剂所得的数据能被正确分类成各组，说明本技术中的发光菌阵列传感器可以识别不同种类的甜味剂。
38.实施例5：发光菌阵列传感器在实际样品-饮料中的识别应用
39.本实施例选用市面上同种饮料的有糖和无糖两种类型进行了检测，分别是普通可乐，无糖可乐，普通雪碧，无糖雪碧，普通绿茶，无糖绿茶。同时设置成50μm和500μm两个浓度梯度，分别配制六种饮料溶液，做六组平行实验，加入到96孔板中。然后加入等体积量的重组大肠杆菌e.coli和天然发光细菌费氏弧菌v.fischeri组成的发光菌阵列传感器，对六种饮料的种类进行反应识别，再利用酶标仪对其反应后进行发光强度测定；通过与相同条件下空白对照相比较，对所测得的发光数据进行归一化处理；对不同饮料的数据取平均值，可以发现同种饮料的有糖饮料的测量值明显高于无糖饮料，初步判断所构建阵列可以区分不同含糖量的饮料。
40.实施例6：发光菌阵列传感器对单糖手性的识别机理
41.细菌对单糖的利用主要通过糖酵解和tca循环，而其中nadh和dadph的产生会影响细菌的发光强度，因此初步判断其机理主要是单糖通过影响细菌糖代谢途径从而影响细菌的发光强度，细菌对不同构型单糖的利用程度不同，所以发光强度不同。mtt法能够用来检测活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，而琥珀酸脱氢酶是糖代谢过程中重要酶类。因此在细菌含量一致的基础上，通过酶标仪检测mtt结晶形成的量间接反应琥珀酸脱氢酶，从而来检验不同手性单糖是否对重组发光细菌代谢程度影响不同，影响其发光强度。我们选取比较明显的核糖进行实验验证，配制500μm、50mm、100mm三个浓度，先通过与不同浓度菌液反应，进行预实验找到每种细菌的最佳反应浓度，然后再96孔板上加入糖溶液、菌液和mtt溶液进行反应，然后用酶标仪在570nm处检测mtt结晶量，得到数据与相同条件下对照相比较，对所测得的数据进行处理分析，结果如图5所示，图中横坐标表示核糖浓度，纵坐标表示实验组相当于对照组的mtt结晶量，四种发光细菌数据图可知，对于l和d型两种构型的糖，四种细菌的琥珀酸脱氢酶含量和活性不同，说明四种细菌对不同手性的单糖利用程度不同，对d型利用更高，从而说明单糖可能是通过影响细菌呼吸代谢过程从而影响其发光强度。
42.本技术所提供的一种发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，通过不同手性构型和种类的手性物质影响重组发光细菌的发光强度，获得其响应数据，通过lda(线性辨别式分析)进行识别分析，成功对其进行了识别区分，表明此阵列具有较好的识别能力。其能够用来进行单糖的手性识别，同时初步探究了其识别的机理，并对实际样品中的甜味剂和饮料进行了检测。
43.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

技术特征：
1.一种发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，其特征在于，所述方法是将发光菌阵列传感器与待测液混合反应后进行吸收光谱扫描，得到待测液的光谱数据，对光谱数据进行线性判别lda分析，将lda图谱中未知样本数据点的位置与已知类型手性物质数据点进行比对，即可判定待测液中手性物质的类型组成和含量；所述发光菌阵列传感器由至少两种发光细菌组成。2.根据权利要求1所述的发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，其特征在于，所述发光细菌为重组大肠杆菌e.coli、根癌农杆菌a.tumefaciens/c58、枯草芽孢杆菌b.subtilis和天然发光细菌费氏弧菌v.fischeri。3.根据权利要求1或2所述的发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，其特征在于，所述已知类型手性物质的lda图谱是将发光菌阵列传感器与不同浓度的已知类型手性物质混合后进行扫描，得到待测液的光谱数据，对光谱数据进行线性判别lda分析获得的。4.根据权利要求1所述的发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，其特征在于，所述手性物质为单糖、手性催化剂和药物中的一种。5.根据权利要求4所述的发光菌阵列传感器在单糖识别中的应用方法，其特征在于，所述单糖为葡萄糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖中的一种或多种。6.根据权利要求5所述的发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，其特征在于，所述单糖为葡萄糖、木糖和甘露糖中的一种或多种。7.根据权利要求1所述的发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，其特征在于，所述单糖浓度为10-1000μm。8.根据权利要求7所述的发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，其特征在于，所述单糖的浓度为50-500μm。9.根据权利要求1-8任一项所述方法在手性物质检测方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种发光菌阵列传感器检测手性物质的方法，该方法是将发光菌阵列传感器与待测样品混合反应后进行吸收光谱扫描，得到待测液的光谱数据，对光谱数据进行线性判别LDA分析，将LDA图谱中未知样本数据点的位置与已知类型手性物质数据点进行比对，即可判定待测液中手性物质的类型组成和含量；所述发光菌阵列传感器由多种发光细菌组成。本发明还公开了其在手性物质检测方面的应用。本发明所提供的方法用于手性识别，通过LDA处理矩阵数据，从而对不同手性和浓度的手性物质进行了正确识别，并对其识别的机理进行了初步的探究；该方法具操作简单，能够用于手性快速检测，具有一定的实用性和应用前景。定的实用性和应用前景。定的实用性和应用前景。


技术研发人员：蒋雪梅 苏玉陈 岳思成 朱彦华 李玉芳 彭兴杰 盖增 段红英
受保护的技术使用者：重庆大清医疗器械有限公司
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/8/28