一种罗氏沼虾分子辅助育种标记

attctttagcttcgttctttttgaaatctgtataagtggttatgaattcccacgcccctcattcttctgtctcaatc gttagcacagccctcaggaac；其中n为8-9，
9.lszx405的序列如下：
10.aggctacgacatcatcccacacaccgcgcat(gctc)ntcgctgcgtcgctgtcgcttcgtttctgg cgcctctctttctctctttctctcttctttcggccaatcacttcgtccaccggaaaaggcagtcgtcaaaaggt tattacataggctcttttatggtttgtatgtttgcgca；其中n为1-4；
11.本发明所提供的lszx302和lszx405标记与罗氏沼虾体长相关，因此，用于检测上述两个标记的引物对可用于筛选罗氏沼虾高体长的亲本；
12.其中lszx302标记的核心序列为(catt)n，检测该核心序列多态性引物对，其上游引物序列为5
′‑
cgttgtcatcaccgtttcac-3
′
，下游引物序列为5
′‑
gttcctgagggctgtgctaa-3
′
；
13.标记lszx405核心序列为(gctc)n，检测该核心序列多态性引物对，其上游引物序列为5
′‑
aggctacgacatcatcccac-3
′
，下游引物序列为5
′‑
tgcgcaaacatacaaaccat-3
′
。
14.本发明所提供的分子标记可用于生长性状关联分析、遗传图谱构建，qtl定位的分析中；
15.本发明再一个方面是提供一种筛选高体长罗氏沼虾的方法，是通过检测待筛选个体中lszx302标记的基因型是否为266/266；lszx405标记的基因型是否为174/190来实现的。
16.所述的方法，是通过pcr引物进行扩增后，再对扩增产物进行测序，对基因型进行分析完成的。
17.其中检测lszx302标记的引物，其上下游引物序列信息如下：
18.f：5
′‑
cgttgtcatcaccgtttcac-3
′
，
19.r：5
′‑
gttcctgagggctgtgctaa-3
′
；
20.其中检测lszx405标记的引物，其上下游引物序列信息如下：
21.f：5
′‑
aggctacgacatcatcccac-3
′
，
22.r：5
′‑
tgcgcaaacatacaaaccat-3
′
。
23.本发明所提供的筛选高体长罗氏沼虾的方法，是在正向引物的5
′
端标记荧光素进行pcr反应，pcr产物进行自动荧光检测；将荧光检测的数据用genemapper4.0软件生成位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型；根据基因型确定是否为高体长罗氏沼虾。
24.本发明筛选获得的罗氏沼虾体长相关ssr标记是与功能基因相关，可用于生长性状关联分析、遗传图谱构建，qtl定位等方面的研究。
附图说明
25.图1：罗氏沼虾转录组中unigenes的ssr分析结果图，
26.图2：lszx302位点基因型分型结果图，
27.图3：lszx405位点基因型分型结果图。
具体实施方式
28.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
29.实施例1：筛选ssr标记
30.1、获得实验虾
31.通过群体随机交配繁殖出苗，设置养殖密度2万/亩，养殖4个月，随机起捕199尾虾，测定每尾虾的体长。剪取肌肉组织，固定于95％的乙醇中用于dna提取。
32.2、多态性ssr引物筛选
33.采用illumina hiseqtm 4000高通量测序平台对罗氏沼虾卵巢组织进行转录组测序，原始数据经质控、组装后，拼接获得95379个unigenes，采用misa软件对unigenes进行ssr检测。选取重复次数在5次以上的三碱基、四碱基或五碱基重复序列，使用primer premier5.0软件进行引物设计，随机选择10个个体进行多态性ssr位点筛选，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
34.3、基因组dna提取
35.采用takara基因组抽提试剂盒对两个群体的样品进行基因组dna抽提，具体操作方法参照说明书，1％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测dna质量和浓度，dna样品保存于-20℃备用。
36.4、pcr扩增与荧光检测
37.pcr反应总体积为25μl，模板为基因组dna 50ng，其它组分根据taq酶(takara)说明书要求，在正向引物5’端标记荧光素fam(蓝色)。pcr反应条件为：94℃2min；94℃30s，60℃45s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。用abi3730xl(美国应用生物系统公司)dna分析仪对pcr产物进行自动荧光检测。
38.5、数据分析
39.用genemapper4.0软件生成每个位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型。popgene32计算等位基因数(numbers of the alleles，na)、有效等位基因数(numbers of the effective alleles，ne)、期望杂合度(expected heterozygosity，he)、观测杂合度(observed heterozygosity，ho)及hard-weinberg平衡检验(p值)。参照botstein等的方法计算多态信息含量(polymorphism information content，pic)。
40.利用spss17.0软件进行统计分析，首先对表型数据正态性检验，应用一般线性模型(general linear model，glm)进行微卫星位点与体长关联分析，并对同一位点不同基因型进行多重比较(lsd)。
41.共查找到18592个由一至六个核苷酸重复序列组成的ssr位点，占unigenes总数的比例为19.49％。单核苷酸重复类型比例最高，达52.71％，随后依次为二、三、四、五、六核苷酸重复类型，占比分别为32.61％、15.90％、0.80％、0.05％、0.04％。在单、二、三核苷酸重复类型中，数量最多的重复基元分别为a/t(9407个)、ag/ga(2244个)、aat/ata/taa(344个)，数量最少的重复基元分别为c/g(392个)、cg/gc(12个)、cgg/ggc/gcg(15个)。随机选取了63个位点进行了多态性筛选，结果31个位点表现出多态，32个位点没有多态性，多态位点比例占49.2％(图1)。
42.群体遗传多样性分析
43.在31个多态位点中，选取19个位点进行遗传多样性分析。结果显示，共检测到65个等位基因，平均等位基因数为3.4211，有效等位基因数为1.0901-4.2309，平均值为2.0941，观测杂合度为0.0854-0.6734，平均值为0.4105，期望杂合度为0.0826-0.7656，平均值为0.4496，多态信息含量为0.0805-0.7267，平均值为0.3882,6个位点pic值大于0.5,4个位点pic值小于0.25，9个位点的pic值在0.25至0.5之间，19个位点中，lszx008、lszx100、lszx107、lszx202、lszx207、lszx300、lszx304、lszx406与lszx605位点符合hard-weinberg平衡，其余10个位点显著(p＜0.05)或极显著(p＜0.01)偏离hard-weinberg平衡(表1)。
44.表1：群体遗传多样性分析
[0045][0046]
实施例2：与体长关联的ssr位点
[0047]
利用glm模型进行筛选的ssr位点与罗氏沼虾体长关联分析，结果显示，lszx302、lszx405两个ssr位点与体长显著相关(p＜0.05)(表2)。
[0048]
表2：lszx302、lszx405位点与体长性状的关联性
[0049][0050]
注：表中数值为微卫星位点与体长关联分析的概率值，上标“*”代表体长性状与标记呈显著相关(p＜0.05)。
[0051]
对具有显著差异的ssr位点进行不同基因型与体长多重比较，其中lszx302位点
266/266基因型个体体长均值显著高于270/270基因型个体(p＜0.05)；lszx405位点174/190基因型个体体长均值显著高于182/190基因型个体(p＜0.05)(表3)。同时富集lszx302位点266/266和lszx405位点174/190基因型个体有26尾，而所有具有lszx405位点174/190基因型个体也是同时包含lszx302位点266/266基因型。
[0052]
表3：基因型与体长多重比较
[0053][0054]
比较同时包含266/266和174/190基因型个体与只包含266/266一种基因型个体进行比较，结果显示富集两种基因型个体平均体长为9.02
±
0.29cm、平均体重为19.83
±
1.90g，而只有266/266一种基因型个体平均体长为8.51
±
1.52cm、平均体重为17.21
±
0.74g。即同时具有266/266和174/190基因型个体相比于只包含单个进行个体，其体长均值高5.99％、体重均值高15.22％。
[0055]
实施例3：两个位点在养殖群体中的验证
[0056]
本发明所筛选到的与体长相关标记可以快速准确筛选生长性状优良亲本用于罗氏沼虾育种，其一种方法步骤如下：
[0057]
1、takara基因组抽提试剂盒对两个群体的样品进行基因组dna抽提，具体操作方法参照说明书，1％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测dna质量和浓度，dna样品保存于-20℃备用。
[0058]
2、pcr扩增与荧光检测
[0059]
pcr反应总体积为25μl，模板为基因组dna 50ng，其它组分根据taq酶(takara)说明书要求，在正向引物5’端标记荧光素fam(蓝色)。pcr反应条件为：94℃2min；94℃30s，60℃45s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。用abi3730xl(美国应用生物系统公司)dna分析仪对pcr产物进行自动荧光检测。
[0060]
3、数据分析
[0061]
用genemapper4.0软件生成每个位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型。
[0062]
其中检测lszx302标记的引物，其上下游引物的序列信息如下：
[0063]
f:5
’‑
cgttgtcatcaccgtttcac-3’、
[0064]
r:5
’‑
gttcctgagggctgtgctaa-3’；
[0065]
其中检测lszx405标记的引物，其上下游引物的序列信息如下：
[0066]
f:5
’‑
aggctacgacatcatcccac-3’、
[0067]
r:5
’‑
tgcgcaaacatacaaaccat-3’。
[0068]
两个位点扩增的基因型如下表4
[0069]
表4：lszx001和lszx304的基因型信息
[0070][0071]
随机抽取同塘养殖的一个养殖群体56尾虾，测定每尾虾的体长与体重，对筛选到的ssr标记进行验证。结果显示，lszx302位点的266/266基因型个体体长显著高于其他基因型个体(p＜0.05)，体长平均高13.15％，266/266基因型高体长个体在体重方面显著高于其他基因型个体，体重平均高32.86％(表5)。lszx405位点的174/190基因型个体体长显著高于其他基因型个体(p＜0.05)，体长平均高12.61％，174/190基因型高体长个体在体重方面显著高于其他基因型个体，体重平均高34.48％(表5)。
[0072]
表5：两个位点在养殖群体中的验证结果表
[0073][0074]
上述研究结果表明用本发明两个标记可以快速准确筛选生长性状优良亲本用于罗氏沼虾的遗传选育。

技术特征：
1.一种与罗氏沼虾体长相关的ssr标记，其特征在于，所述的标记为lszx302或lszx405，其中lszx302序列如下：cgttgtcatcaccgtttcactttctgtgc(catt)
n
ctactcttctgtcttcgttcaccactcatcattcacacacaaaattg agcatctgtgggttgcttagaagaagaagaaccttttgaggaggtgaaatcactatcttcattctttagcttcgttctttttgaaat ctgtataagtggttatgaattcccacgcccctcattcttctgtctcaatcgttagcacagccctcaggaac；其中n为8-9；lszx405的序列如下：aggctacgacatcatcccacacaccgcgcat(gctc)
n
tcgctgcgtcgctgtcgcttcgtttctggcgcctctctttc tctctttctctcttctttcggccaatcacttcgtccaccggaaaaggcagtcgtcaaaaggttattacataggctcttttatggttt gtatgtttgcgca；其中n为1-4。2.一种引物对，其特征在于，所述的引物对检测权利要求1所述的ssr标记的核心区域。3.用于检测权利要求2所述的ssr标记的核心区域的引物对，其特征在于，用于检测lszx302标记的核心区域的引物对，其上游引物序列为5
′‑
cgttgtc atcaccgtttcac-3
′
，下游引物序列为5
′‑
gttcctgagggctgt gctaa-3
′
；用于检测lszx405核心序列的引物对，其上游引物序列为5
′‑
aggctac gacatcatcccac-3
′
，下游引物序列为5
′‑
tgcgcaaacatacaaaccat-3
′
。4.权利要求1所述的ssr标记在罗氏沼虾生长性状关联分析、遗传图谱构建，qtl定位的分析中的应用。5.一种筛选高体长罗氏沼虾的方法，其特征在于，所述的方法是检测待筛选个体中权利要求1所述的lszx302标记的基因型是否为266/266；lszx405标记的基因型是否为174/190来筛选高体长罗氏沼虾。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法，是通过pcr引物进行扩增后，再对扩增产物进行测序，对基因型进行分析完成的。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增，其中检测lszx302标记的引物，其上下游引物序列信息如下：f：5
′‑
cgttgtcatcaccgtttcac-3
′
，r：5
′‑
gttcctgagggctgtgctaa-3
′
。8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的pcr扩增，其中检测lszx405标记的引物，其上下游引物序列信息如下：f：5
′‑
aggctacgacatcatcccac-3
′
，r：5
′‑
tgcgcaaacatacaaaccat-3
′
。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法，，是在正向引物的5
′
端标记荧光素进行pcr反应，pcr产物进行自动荧光检测；将荧光检测的数据用genemapper4.0软件生成位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型；根据基因型确定是否为高体长罗氏沼虾。

技术总结
本发明提供一种罗氏沼虾分子辅助育种SSR标记，所提供的SSR标记是通过对转录组中的SSR位点进行了多态性筛选，然后进行SSR标记与体长关联分析获得，能够用于罗氏沼虾的遗传选育。本发明所提供的与罗氏沼虾体长相关的SSR标记，所述的标记为LSZX302和LSZX405。本发明所提供的筛选高体长罗氏沼虾的方法，是在正向引物的5


技术研发人员：陈雪峰 楼宝
受保护的技术使用者：浙江省农业科学院
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/28