基于ARGETATRP和ROP双聚合级联放大的高灵敏cTnI检测试剂盒及其应用

基于arget atrp和rop双聚合级联放大的高灵敏ctni检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及基于arget atrp和rop双聚合级联放大的高灵敏ctni检测试剂盒、使用方法及其应用，属于生物分析技术领域。


背景技术：

2.心肌梗死已成为直接威胁生命的心血管疾病之一，其中超过一半的患者被诊断为急性心肌梗死(ami)。一些ami患者前期几乎没有明显症状，如胸部或背部疼痛、呼吸短促和烧心等，因此开发灵敏高效的ami检测方法至关重要。ami可通过多种心脏生物标志物进行诊断，包括心肌肌钙蛋白i(ctni)、心肌肌钙蛋白t、肌酸激酶mb和肌红蛋白。这其中，ctni已被公认为诊断ami的首选生物标志物，ctni的高灵敏和高选择性检测对ami的早期诊断、疾病评估和预后分析具有重要意义。
3.目前，已有多种方法被报道用于检测ctni，如酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、化学发光免疫分析、荧光免疫分析、表面等离子体共振法、比色法和电化学生物传感器。电化学生物传感器是一种典型的多学科交叉和发展的产物，作为一种新兴的检测方法，由于其灵敏度高、操作简单、特异性强等优点受到了广泛关注。特别是基于适配体的电化学传感器，由于其对抗体具有特异性高、免疫原性低、体积小、化学稳定性好、电化学单元易于修饰等优点，越来越受到研究人员的青睐。
4.传统的电化学方法是将一个电活性标记物偶联到目标生物分子上，操作简单，价格低廉，但其灵敏度有限不能实现高灵敏检测。研究表明，与纳米技术放大信号相比，聚合反应通过控制聚合物链的动态生长实现信号放大，可有效提高检测灵敏度。而且其具有反应条件温和、操作简便的优势。其中，原子转移自由基聚合(atrp)具有适用的单体种类较多，分子量分布较窄，可以用来制备接枝共聚物等优良特性。arget atrp反应主要基于使用有机还原剂如抗坏血酸和葡萄糖来平衡cui和cuii，以将cu催化剂的浓度从10000ppm降低到10ppm，允许受控聚合更进一步，在工业和生物医学方面具有很大的应用前景。开环聚合(rop)是一种高效的活性聚合反应，具有原子经济性和化学特异性的优点，所制备的聚合物具有良好的生物相容性和生物降解性，在农业、医学和制药等领域引起广泛关注。
5.综上，本发明目的是研发出以nca-fc作为单体，生成的atrp聚合物作为rop反应的大分子引发剂，基于arget atrp和rop双聚合级联放大的电化学试剂盒，使其具有灵敏度高、选择性好等特点，可用于ctni的高灵敏检测。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于arget atrp和rop双聚合级联放大的高灵敏ctni检测试剂盒、使用方法及其应用，该试剂盒具有选择性好、灵敏度高等特点，在分析真实血清样品时也具有良好的准确性和适用性。
7.为了实现上述目的，本发明的技术方案之一是：
8.基于arget atrp和rop双聚合级联放大的高灵敏ctni检测试剂盒，其特征在于，包括：金电极、apt1、apt2、mch、bibb、arget atrp反应溶液、nca-fc、liclo4、dmso、dmf、乙醇、pbs缓冲液。
9.进一步，apt1和apt2的序列分别为：
10.apt1：5
’‑
sh-(ch2)
6-cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta-3’11.apt2：5
’‑
nh
2-(ch2)
6-cgcatgccaaacgttgcctcatagttccctccccgtgtcc-3’。
12.进一步，arget atrp反应溶液的制备方法为：
13.①
将cubr2和me6tren溶解在dmso中，制备成cubr2和me6tren浓度均为10mm的cubr2/me6tren溶液；
14.②
将单体nama溶解在pbs缓冲液中，制备成浓度为40mm的单体nama溶液；
15.③
将aa溶解在pbs缓冲液中，制备成浓度为2mm的aa溶液；
16.④
将上述
①②③
中溶液分别量取0.4ml，再加入2.8ml pbs缓冲液混合均匀，得到arget atrp反应溶液。
17.进一步，nca-fc的合成方法为：
18.(1)称取二茂铁甲酸溶于dcm中，滴加三乙胺，再依次加入hbtu和hobt，反应后，旋转蒸干，得到产物fc-obt；
19.(2)将tfa滴入boc-l-lys nca的dcm溶液中，反应后，移入室温搅拌过夜，得到nca产物；
20.(3)将三乙胺滴入所制备的fc-obt中，然后加入所制备的nca，室温反应，薄层色谱法监测反应过程，反应结束后进行后处理得到单体nca-fc。
21.进一步，步骤(1)和(2)中二茂铁甲酸：三乙胺：hbtu：hobt：boc-l-lys nca的摩尔比为1：2：1：1：1；
22.步骤(2)中tfa：boc-l-lys nca：dcm的比例关系为0.41ml：1mmol：3ml；
23.步骤(1)和(3)中三乙胺的用量相同；
24.步骤(1)-(3)中滴加条件均为0℃；步骤(1)的反应时间为1h，步骤(2)的反应时间为1h；
25.步骤(3)中后处理为依次用饱和nahco3溶液、0.5m盐酸溶液、饱和nahco3溶液和超纯水洗涤，分离dcm有机相，用无水na2so4干燥、过滤，真空干燥。
26.本发明的技术方案之一是：一种所述检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
27.(1)金电极的修饰
28.①
将apt1溶液滴加到金电极上，反应，洗涤，吹干；
29.②
将步骤
①
的电极浸泡在mch溶液中，反应，洗涤，吹干；
30.③
将待检测样品滴加至步骤
②
的电极表面，孵育，洗涤，吹干；
31.④
将apt2溶液滴加到步骤
③
的电极上，反应，洗涤，吹干；
32.⑤
将步骤
④
的电极浸泡在bibb溶液中，反应，洗涤，吹干；
33.⑥
将步骤
⑤
的电极浸泡在arget atrp反应溶液中，反应，洗涤，吹干；
34.⑦
将nca-fc溶液滴加到步骤
⑥
的电极表面，反应，洗涤，吹干；
35.(2)电化学检测
36.将修饰后的电极浸入liclo4溶液中，通过方波伏安法记录电流响应，根据电信号
大小分析ctni含量。
37.进一步，金电极先进行前处理，前处理方法为：
38.①
将金电极分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤；
39.②
分别用0.3μm和0.05μm氧化铝粉对金电极表面进行抛光打磨；
40.③
依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声洗涤；
41.④
用新配制的水虎鱼酸溶液浸泡金电极；
42.⑤
重复步骤
③
；
43.⑥
在0.5m h2so4溶液中浸泡电极，电位范围设定为-0.3～1.5v，扫描速率为0.2v/s，重复扫描直至得到重合的循环伏安图；
44.⑦
用超纯水洗涤电极，氮气吹干。
45.进一步，步骤
①
的反应温度为35-40℃，时间为2.0h；步骤
②
的反应温度为35-40℃，时间为0.5h；步骤
③
的孵育温度为35-40℃，时间为1.0-2.0h；步骤
④
的反应温度为35-40℃，时间为1.0h；步骤
⑤
的反应温度为35-40℃，时间为0.5-1.0h；步骤
⑥
的反应温度为37℃，时间为0.5-1.0h；步骤
⑦
的反应温度为室温，时间为1.0-1.5h；步骤(2)中方波伏安法的增加电位：4.0mv，电位幅度：25mv，静止时间：30s。
46.本发明的技术方案之一是：一种所述的检测试剂盒在制备ctni检测试剂中的应用。
47.本发明检测方法的构建过程如图1所示。
48.本发明的有益效果：
49.1、本发明基于arget atrp和rop双聚合级联放大构建了一种新型的ctni适配体检测试剂盒。避免了目前常用信号放大策略中纳米材料(操作复杂，成本高)和生物酶(易受外界环境如ph和温度的影响)的使用，极大提高灵敏度的同时，该试剂盒还具有选择性好、稳定性强等优点。
50.2、二茂铁及其衍生物具有良好的氧化还原特性、稳定性和低毒性，已被广泛用作电化学传感器的电活性探针。本发明合成的单体nca-fc，反应条件温和，室温下即可顺利反应得到。该单体进行rop反应时，不需要高温高压的反应条件，操作相对简单，且可直接接枝到电极表面，能够高效地应用到ctni检测中。
51.3、本发明基于arget atrp和rop双聚合扩增策略成功构建了一种新型电化学适配体检测试剂盒，该试剂盒包括：金电极、apt1、apt2、mch、bibb、atrp反应溶液、nca-fc。apt1探针通过au-s键自组装在金电极表面，通过特异性识别捕获ctni，引入apt2形成三明治夹心结构，通过溴化反应在apt2连接上引发剂bibb，同时将生成的atrp聚合物作为rop反应的大分子引发剂，大量的电活性聚合物链通过氨基引发的rop反应接枝到电极表面，提高了检测的灵敏度。其检测线性范围为100fg/ml～100ng/ml，检出限低至32.24fg/ml，连续存放两周后稳定性达到初始值的92.28％，抗干扰性达到95.2％～98.7％。同时，本发明在分析真实血清样品时也具有良好的准确性和适用性，为后期应用于医学领域ctni的检测及ami的早期诊断奠定了基础。
附图说明
52.图1为基于arget atrp和rop双信号扩增策略的ctni检测试剂盒构建示意图。
53.图2为单体nca-fc的红外谱图。
54.图3a为不同修饰条件下电极的swv信号图；图3b为不同扫描速率的cv曲线；图3c为每个步骤修饰后的电极的eis曲线；图3d为每个步骤修饰后的电极的cv曲线。
55.图4为电极表面发生arget atrp和rop反应前后的原子力显微镜(afm)表征。
56.图5为不同修饰电极表面的水接触角(wca)表征。
57.图6a为bibb反应时间的优化；图6b为arget atrp反应时间的优化；图6c为rop反应时间的优化。
58.图7a为不同浓度ctni的swv电流强度；图7b为ctni浓度与电流强度之间的线性关系图。
59.图8a为本发明试剂盒的选择性研究；图8b为本发明试剂盒的抗干扰性研究。
具体实施方式
60.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
61.ctni特异性抗原标准液(l4c00102)购自上海领潮生物科技有限公司。
62.适配体apt1和apt2均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下：
63.apt1：5
’‑
sh-(ch2)
6-cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta-3’64.(seq id no.1)。
65.apt2：5
’‑
nh
2-(ch2)
6-cgcatgccaaacgttgcctcatagttccctccccgtgtcc-3’(seq id no.2)。
66.实施例1：材料的准备
67.(1)arget atrp反应溶液的制备：
68.①
将cubr2和三(2-二甲氨基乙基)胺(me6tren)溶解在二甲基亚砜(dmso)中，制备成cubr2和me6tren浓度均为10mm的cubr2/me6tren溶液；
69.②
将单体n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(nama)溶解在pbs缓冲液中，制备成浓度为40mm的单体nama溶液；
70.③
将抗坏血酸(aa)溶解在pbs缓冲液中，制备成浓度为2mm的aa溶液；
71.④
将上述
①②③
中溶液分别量取0.4ml，再加入2.8ml pbs缓冲液混合均匀，得到arget atrp反应溶液。
72.(2)nca-fc的合成：
73.①
称取3mmol二茂铁甲酸溶于60ml无水二氯甲烷(dcm)中，0℃条件下缓慢滴加6mmol三乙胺，再依次加入3mmol苯并三氮唑-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)和3mmol 1-羟基苯并三唑(hobt)，0℃反应1h后，旋转蒸干，得到产物fc-obt；
74.②
将1230μl三氟乙酸(tfa)在0℃条件下缓慢滴入叔丁氧羰基-l-赖氨酸环内酸酐(boc-l-lys nca，cas号：33043-60-6)溶液(3mmol boc-l-lys nca溶于9ml dcm)中，0℃反应1h后，移入室温搅拌过夜，得到nca产物；
75.③
将6mmol三乙胺在0℃条件下缓慢滴入所制备fc-obt的dcm溶液(溶剂为20ml dcm)中，然后在混合物中加入所制备的nca，室温反应，薄层色谱法监测反应过程，反应结束后，依次用饱和nahco3溶液、0.5m盐酸溶液、饱和nahco3溶液和超纯水洗涤，分离dcm有机相，用无水na2so4干燥、过滤，真空干燥，得到单体nca-fc。
76.为了验证nca-fc的成功合成，采用傅里叶变换红外光谱对其进行了表征。图2为单体nca-fc的红外谱图。由图2可知，3088cm-1
处的峰归因于二茂铁环c-h键的拉伸振动。二茂铁环的c-c键拉伸振动的特征峰在1162cm-1
。494cm-1
处的峰是c-fe键拉伸振动的特征峰。此外，3290cm-1
和1665cm-1
处的峰值分别是n-h键拉伸振动和变形振动的特征峰值。1256cm-1
处的峰来自c-c键的拉伸振动。酰胺键中c＝o的拉伸振动是1530cm-1
处出现峰值的原因。因此，这些结果证明了单体nca-fc的成功制备。
77.实施例2：试剂盒的构建
78.基于arget atrp和rop双信号扩增策略的高灵敏ctni检测试剂盒，包括：金电极、apt1、apt2、6-巯基-1-己醇(mch)、2-溴异丁酰溴(bibb)、arget atrp反应溶液、nca-fc、pbs缓冲液、liclo4、dmso、dmf、乙醇、超纯水。
79.使用时，部分原料需配制成溶液，其中，apt1溶液浓度为1μm，mch溶液浓度为2mm，apt2溶液浓度为1μm，bibb溶液的浓度为10mm，nca-fc溶液浓度为40mm，pbs缓冲液浓度为0.1m，ph＝7.4，liclo4溶液浓度为1.0m。
80.实施例3：检测方法
81.一种检测ctni的方法，包括以下步骤：
82.(1)电极的前处理
83.①
将金电极分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤30s；
84.②
分别用0.3μm和0.05μm氧化铝粉对金电极表面进行抛光打磨3～5min；
85.③
依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声洗涤30s；
86.④
用新配制的水虎鱼酸溶液(30％ h2o2溶液和98％ h2so4溶液，v/v＝1:3)浸泡金电极15min；
87.⑤
重复步骤
③
；
88.⑥
在0.5m h2so4溶液中浸泡电极，电位范围设定为-0.3～1.5v，扫描速率为0.2v/s，重复扫描直至得到重合的循环伏安图；
89.⑦
用超纯水洗涤电极，氮气吹干。
90.(2)金电极的修饰
91.①
将10μl apt1溶液(1μm)滴加到金电极上，在37℃下反应2h，洗涤，吹干。
92.②
将步骤
①
的电极浸泡在300μl mch溶液(2mm)中，在37℃下反应0.5h，洗涤，吹干。
93.③
将10μl待检测样品溶液(含ctni特异性抗原标准液)滴加至步骤
②
的电极上，在37℃下孵育1h，洗涤，吹干。
94.④
将10μl apt2溶液(1μm)滴加到步骤
③
的电极上，在37℃下反应1h，洗涤，吹干。
95.⑤
将步骤
④
的电极上浸泡在200μl bibb溶液(10mm)中，在37℃下反应40min，洗涤，吹干。
96.⑥
将步骤
⑤
的电极浸泡在200μl arget atrp反应溶液中，在37℃下反应50min，洗涤，吹干。
97.⑦
将10μl nca-fc溶液(40mm)滴加到步骤
⑥
的电极表面，室温下真空反应1h(rop反应)，洗涤，吹干。
98.步骤
①③④⑥
洗涤用pbs缓冲液轻轻洗涤金电极表面，以除去未反应完的物质，避
免非特异性吸附。步骤
②
洗涤用70％(v/v)乙醇溶液洗涤，步骤
⑤
洗涤用dmso溶液洗涤，步骤
⑦
洗涤用30％(v/v)dmf溶液洗涤。步骤
①‑⑦
吹干均为氮气吹干。
99.(3)swv检测
100.将步骤(2)所得电极浸入15ml liclo4溶液(1.0m)中，通过方波伏安法(swv)(增加电位：4.0mv；电位幅度：25mv，静止时间：30s)来记录电流响应，通过电信号大小来分析ctni的含量。
101.实施例4：可行性验证
102.为了评价本发明检测ctni的可行性，采用swv测量了一系列修饰电极的氧化还原电流信号，并进行比较，各种修饰电极的swv曲线见图3a。图中的a～g曲线反映了在电极构建过程中不添加apt1、mch、ctni、apt2、bibb、arget atrp、rop任一物质时，在二茂铁的电位范围内未观察到明显的电流信号，表明开环聚合不会发生，信号单元在电极表面的非特异性吸附可以忽略不计。当上述所有成分被连续修饰到电极表面时，可以明显观察到峰值电位为～0.41v的强氧化电流信号(曲线h)。因此，上述实验结果表明发明的试剂盒用于ctni检测是可行的。
103.实施例5：修饰电极的电化学表征
104.为了证明聚合反应的切实发生，在1.0m liclo4溶液中用循环伏安法(cv)对修饰电极进行表征，研究不同扫描速率对氧化还原电流强度的影响，电位为0～0.8v。结果如图3b所示，在0.01～0.25v s-1
的扫描速率下，峰值电流与扫描速率之间呈现良好的线性关系，表明电活性聚合物是通过共价键固定到金电极上的，与扩散无关。
105.为了证明电化学适配体试剂盒的构建过程是成功的，在含有0.1m kno3的5mm[fe(cn)6]
3-/4-电解质溶液中，逐步收集同一电极在连续制备过程中的电化学阻抗谱(eis)。在nyquist图中，高频区半圆的直径表示电荷转移电阻(r
ct
)，是电子在电极表面转移时受到的阻碍。结果如图3c所示，裸金电极的r
ct
仅有256ω(曲线a)，表明电极表面是干净的，电子可以在电极与溶液界面之间快速转移。在电极表面修饰apt1，由于形成的自组装单分子层与[fe(cn)6]
3-/4-溶液之间存在静电排斥导致r
ct
增加(～597ω，曲线b)。之后，电极表面多余的结合位点被mch占据，导致r
ct
(～810ω，曲线c)进一步增大。接下来，ctni与apt1特异性识别，在电极表面形成蛋白质层，阻碍了电子转移的效率，导致r
ct
进一步增加(～1156ω，曲线d)。随后，apt2的引入形成了三明治夹心结构，导致r
ct
继续增加(～1560ω，曲线e)。引发剂bibb固定到电极上后，r
ct
(～2106ω，曲线f)再次增大。当发生arget atrp反应后，r
ct
(～926ω，曲线g)显著降低，这是由于arget atrp聚合物上的大量氨基促进电子转移效率造成的。最后，rop反应后由于大量疏水性聚合物链接枝到电极表面r
ct
显著增加(～3903ω，曲线h)。上述eis结果表明，本发明的构建过程是成功的。
[0106]
此外，用循环伏安法评价了不同修饰步骤时电极表面的特性。结果如图3d所示，裸金电极的界面有一对明显的氧化还原峰(曲线a)。当apt1、mch、ctni、apt2和bibb(曲线b～f)在电极表面逐渐修饰时，观察到峰值电流随电子转移速率的降低而依次降低，这与eis结果一致。当电极表面发生arget atrp反应后，峰值电流显著提高(曲线g)。最后，rop反应后峰值电流显著降低(曲线h)，这是由于大量的电活性聚合物链增大了空间位阻。这些结果表明，制备的ctni检测试剂盒是可行的。
[0107]
实施例6：电极表面形貌表征
[0108]
为了进一步证明聚合物的形成，通过原子力显微镜(afm)观察了修饰电极的表面形貌。其中，apt1/mch/ctni/apt2/bibb修饰的金电极的高度为17.0nm(图4a)，发生arget atrp反应后，由于聚合物在金电极上形成，金电极高度增长为26.8nm(图4b)。此外，进一步发生rop反应后，其表面高度继续增长到38.0nm(图4c)，这是由于大量的电活性聚合物链通过氨基引发的rop反应连接到电极表面，表明了制备的ctni检测试剂盒是可行的。此外，由于修饰电极表面基团的亲水性和疏水性不同，水接触角(wca)可用来表征电极表面基团的变化。结果如图5所示，对arget atrp和rop反应前后的电极表面进行表征，au/apt1/mch/ctni/apt2/bibb的wca值为82.5
°
(图5a)，电极表面发生arget atrp反应后，由于聚合物中存在大量的亲水性氨基基团，其wca值下降到78.8
°
(图5b)。最后，在rop反应后，wca急剧增加到87.1
°
(图5c)，这种明显的差异是因为大量的疏水性聚合物链被修饰到电极表面。wca的变化进一步证明电极已被成功修饰。上述结果证明本发明用于检测ctni是可行的。
[0109]
实施例7：检测条件优化
[0110]
为了使试剂盒的检测性能达到最佳，本发明对电极构建过程中的关键参数进行优化，包括bibb反应时间、arget atrp和rop反应时间等，以提高试剂盒的分析性能。
[0111]
(1)bibb反应时间
[0112]
bibb作为arget atrp反应的引发剂，连接到电极上的量将直接影响聚合反应的发生。随着反应时间的延长，越来越多的引发剂附着到电极上，为聚合提供更多的反应位点，电流强度逐渐增大。相应的电流强度关系如图6a所示。结果表明，在前40min内，电流随反应时间增长，40min后电流强度几乎保持不变，这是因为反应达到了平衡。因此，选择40min作为bibb的最佳反应时间。
[0113]
(2)arget atrp反应时间
[0114]
同样的，探究了arget atrp反应时间对ctni检测的影响。由图6b可知，随着聚合时间的延长，电流强度逐渐增大，在50min左右达到最大值。这是因为大量的聚合物被接枝到电极上，电极表面的位阻逐渐增大。因此，atrp的最佳反应时间为50min。
[0115]
(3)rop反应时间
[0116]
电极表面二茂铁电活性分子的数量在很大程度上影响试剂盒的分析性能。为了保证试剂盒的分析灵敏度，研究了rop反应时间对氧化电流值的影响。结果如图6c所示，当rop反应时间在30～60min范围内时，电流强度随着反应时间的增加而增加，之后信号强度趋于稳定，这是由于空间阻力的增加限制了聚合物链的进一步增长。因此，选择最佳rop反应时间为60min。
[0117]
实施例8：分析性能
[0118]
在最佳实验条件下，检测不同浓度的ctni(100fg/ml、1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)产生的电流强度大小，来研究本发明对ctni的检测性能。结果如图7a所示，在100fg/ml～100ng/ml的浓度范围内，随着ctni浓度的增加其电流响应也逐渐增大。如图7b所示，ctni浓度的对数与电流响应间呈现出良好的线性关系。线性回归方程为i(μa)＝1.045log[c
ctni
/ng ml-1
]+5.362(r2＝0.998)，检测限(c
lod
)为32.24fg/ml(c
lod
＝3σ/斜率，σ表示空白组的标准偏差)。结果表明，本发明所制备的ctni检测试剂盒具有较宽的线性范围和较低的检测限，本发明方法在检测超低水平的ctni方面显示出巨大的应用潜力。本发明与现有其它检测方法的检测范围和检测限比较见下表。
[0119][0120]
实施例9：选择性实验
[0121]
为了验证该信号放大方法的选择性，本发明比较了相同条件下空白组(blank)、牛血清白蛋白(bsa)、癌胚抗原(cea)、细胞角蛋白19片段(cyfra21-1)和雌激素受体(erα)使用本发明方法所产生的电流强度。具体是通过比较10ng/ml的ctni和其它同浓度干扰蛋白所产生的电化学信号强度。结果如图8a所示，其他干扰蛋白所产生的电流信号相对ctni较小，且基本与空白组信号相当，证明本发明方法具有较高的选择性。
[0122]
实施例10：重现性及稳定性研究
[0123]
为了评价本发明的稳定性，比较了新构建的电极和储存一段时间后的电极的信号强度。在相同条件下制备了两组修饰电极，一组构建完成后立即用swv检测信号强度，另一组储存在4℃冰箱中。经过两周储存后进行测量，修饰电极的电流信号仍可保持为初始电流的92.28％。因此，证明本发明方法具有良好的稳定性。
[0124]
通过批内和批间实验对本发明方法的重现性进行了研究。在相同的实验条件下，进行批内和批间实验(n＝3)。当ctni的浓度为10ng/ml时，批内和批间的相对标准偏差分别为4.06％和3.56％，证明本发明方法对ctni的检测具有良好的重现性。
[0125]
实施例11：抗干扰性及实际样本分析
[0126]
为了评估本发明方法的抗干扰能力，使用5％(v/v)和10％(v/v)人血清样品制备三种不同浓度的ctni(1pg/ml、100pg/ml、10ng/ml)，并将其电流强度与同浓度ctni在pbs缓冲液中的电流信号进行比较。结果如图8b所示，当ctni的浓度分别为1pg/ml、100pg/ml、10ng/ml时，来自5％和10％正常人血清(nhs)中的电流信号分别为来自pbs缓冲液峰电流的95.2％和97.6％、97.7％和98.5％、97.7％和98.7％，表明本发明方法对正常人血清中的ctni检测具有较强的抗干扰能力。
[0127]
最后，为了验证该试剂盒的实际应用价值，对获得的6个不同的临床血清样品进行检测。该研究临床样本的使用已获得河南省中医院伦理委员会的批准。该方法测定的结果与临床中常用的荧光免疫分析的结果比较见下表，相对误差范围为-4.52％～3.26％，rsd均小于5％。
[0128]
这些结果表明该试剂盒在ctni临床样本检测中结果准确，具有一定的临床应用价
值。
[0129]

技术特征：
1.基于arget atrp和rop双聚合级联放大的高灵敏ctni检测试剂盒，其特征在于，包括：金电极、apt1、apt2、mch、bibb、arget atrp反应溶液、nca-fc。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括liclo4、dmso、dmf、乙醇、pbs缓冲液。3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，apt1和apt2的序列分别为：apt1：5
’‑
sh-(ch2)
6-cgtgcagtacgccaacctttctcatgcgctgcccctctta-3’apt2：5
’‑
nh
2-(ch2)
6-cgcatgccaaacgttgcctcatagttccctccccgtgtcc-3’。4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，arget atrp反应溶液的制备方法为：
①
将cubr2和me6tren溶解在dmso中，制备成cubr2和me6tren浓度均为10mm的cubr2/me6tren溶液；
②
将单体nama溶解在pbs缓冲液中，制备成浓度为40mm的单体nama溶液；
③
将aa溶解在pbs缓冲液中，制备成浓度为2mm的aa溶液；
④
将上述
①②③
中溶液分别量取0.4ml，再加入2.8ml pbs缓冲液混合均匀，得到arget atrp反应溶液。5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，nca-fc的合成方法为：(1)称取二茂铁甲酸溶于dcm中，滴加三乙胺，再依次加入hbtu和hobt，反应后，旋转蒸干，得到产物fc-obt；(2)将tfa滴入boc-l-lys nca的dcm溶液中，反应后，移入室温搅拌过夜，得到nca；(3)将三乙胺滴入所制备的fc-obt中，然后加入所制备的nca，室温反应，薄层色谱法监测反应过程，反应结束后进行后处理得到单体nca-fc。6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)和(2)中二茂铁甲酸：三乙胺：hbtu：hobt：boc-l-lys nca的摩尔比为1：2：1：1：1；步骤(2)中tfa：boc-l-lys nca：dcm的比例关系为0.41ml：1mmol：3ml；步骤(1)和(3)中三乙胺的用量相同；步骤(1)-(3)中滴加条件均为0℃；步骤(1)的反应时间为1h，步骤(2)的反应时间为1h；步骤(3)中后处理为依次用饱和nahco3溶液、0.5m盐酸溶液、饱和nahco3溶液和超纯水洗涤，分离dcm有机相，用无水na2so4干燥、过滤，真空干燥。7.一种如权利要求1-6任一项所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)金电极的修饰
①
将apt1溶液滴加到金电极上，反应，洗涤，吹干；
②
将步骤
①
的电极浸泡在mch溶液中，反应，洗涤，吹干；
③
将待检测样品滴加至步骤
②
的电极表面，孵育，洗涤，吹干；
④
将apt2溶液滴加到步骤
③
的电极上，反应，洗涤，吹干；
⑤
将步骤
④
的电极浸泡在bibb溶液中，反应，洗涤，吹干；
⑥
将步骤
⑤
的电极浸泡在arget atrp反应溶液中，反应，洗涤，吹干；
⑦
将nca-fc溶液滴加到步骤
⑥
的电极表面，反应，洗涤，吹干；
(2)电化学检测将修饰后的电极浸入liclo4溶液中，通过方波伏安法记录电流响应，根据电信号大小分析ctni含量。8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，金电极先进行前处理，前处理方法为：
①
将金电极分别用无水乙醇和超纯水超声洗涤；
②
分别用0.3μm和0.05μm氧化铝粉对金电极表面进行抛光打磨；
③
依次用超纯水、无水乙醇和超纯水超声洗涤；
④
用新配制的水虎鱼酸溶液浸泡金电极；
⑤
重复步骤
③
；
⑥
在0.5m h2so4溶液中浸泡电极，电位范围设定为-0.3～1.5v，扫描速率为0.2v/s，重复扫描直至得到重合的循环伏安图；
⑦
用超纯水洗涤电极，氮气吹干。9.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，步骤
①
的反应温度为35-40℃，时间为2.0h；步骤
②
的反应温度为35-40℃，时间为0.5h；步骤
③
的孵育温度为35-40℃，时间为1.0-2.0h；步骤
④
的反应温度为35-40℃，时间为1.0h；步骤
⑤
的反应温度为35-40℃，时间为0.5-1.0h；步骤
⑥
的反应温度为37℃，时间为0.5-1.0h；步骤
⑦
的反应温度为室温，时间为1.0-1.5h；步骤(2)中方波伏安法的增加电位：4.0mv，电位幅度：25mv，静止时间：30s。10.一种如权利要求1-6任一项所述的检测试剂盒在制备ctni检测试剂中的应用。

技术总结
本发明公开了基于ARGET ATRP和ROP双聚合级联放大的高灵敏cTnI检测试剂盒、使用方法及其应用，该试剂盒包括：金电极、Apt1、Apt2、MCH、BIBB、ARGET ATRP反应溶液、NCA-Fc。原理是：Apt1探针通过Au-S键自组装在金电极表面，通过特异性识别捕获cTnI，引入Apt2形成三明治夹心结构，通过溴化反应在Apt2连接上引发剂BIBB，同时将生成的ATRP聚合物作为ROP反应的大分子引发剂，大量的电活性聚合物链通过氨基引发的ROP反应接枝到电极表面，提高了检测的灵敏度。其检测线性范围为100fg/mL～100ng/mL，检出限低至32.24fg/mL。同时，本发明在分析真实血清样品时也具有良好的准确性和适用性，为后期应用于医学领域cTnI的检测及AMI的早期诊断奠定了基础。了基础。了基础。


技术研发人员：高天雨 杨怀霞 周振波 程迪 刘艳菊
受保护的技术使用者：河南中医药大学
技术研发日：2023.05.15
技术公布日：2023/8/28