一种琼氏不动杆菌及其应用

1.本发明属于微生物领域，特别涉及一种琼氏不动杆菌及其应用。


背景技术：

2.如何高效、环保地处理含氮废水一直是水处理研究的热点问题。传统生物脱氮工艺通常包括两个过程，首先由自养硝化菌在好氧条件下将氨氮转化为硝氮或亚硝氮，然后再由异养反硝化菌在厌氧条件下将硝氮或亚硝氮转化为含氮气体以达到脱氮目的。因此，传统生物脱氮过程不能在同一反应器内完成，往往需要大型设备或较长的水力停留时间(hydraulic retention time,hrt)。
3.好氧反硝化菌是一类能够在有氧条件下进行反硝化作用的微生物。目前，关于好氧反硝化菌的研究多集中于常规环境，而对极端环境下菌株脱氮特性的关注较少。实际上，好氧反硝化菌对ph的变化敏感，当ph值超过其最适范围，好氧反硝化菌的活性就会受到抑制，进而影响菌株的反硝化作用。因此，急需筛选能耐受强碱环境的好氧反硝化菌用以简化处理流程，降低处理成本，以期应用于更广泛的处理领域。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种琼氏不动杆菌及其应用，填补现有耐受性生物脱氮的空白。
5.本发明的一种琼氏不动杆菌，所述琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)5-2，保藏号为(cgmcc no 27105)，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.本发明的琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)5-2，已于2023年4月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no.27105，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
7.本发明所述的一种琼氏不动杆菌在生物脱氮中的应用。
8.本发明所述的一种琼氏不动杆菌的应用，用于含氮废水。
9.将含所述对数期(od
600＝
0.6～0.8)琼氏不动杆菌的富集培养基悬浮液接种于含氮废水进行脱氮。
10.所述富集培养基为蛋白胨5.0g/l，酵母5.0g/l，nacl 30.0g/l，ph 7.0
±
0.2。
11.所述接种量为2％～3％。
12.所述脱氮温度为：30～35℃条件下，ph＝6.0～12.0，振荡。
13.本发明所述的一种琼氏不动杆菌的筛选方法，包括：
14.(1)将土壤和无菌水混合，得到悬液，然后将悬液于富集培养基中，30～35℃振荡培养2～3天；
15.(2)将取步骤(1)中的富集培养液，加入反硝化培养基中，30～35℃振荡培养46～50h，得到富集液；
16.(3)取步骤(2)富集液加入反硝化培养基中，30～35℃振荡培养，并测试no
3-的去除
效率；重复该步骤直到no
3-的去除效率达到稳定80％以上；
17.(4)取步骤(3)no
3-去除率达到稳定80％以上的悬液进行稀释，10-1
～10-8
涂布在溴百里酚蓝培养基中，于30℃培养直至出现可见的菌株周边变蓝菌落；
18.(5)将上述步骤(4)中长出的变蓝菌落用接种环挑出至固体lb培养基平板上，反复划线3～5次，直到出现单菌落为止；
19.(6)将上述步骤(5)中单菌落用无菌接种环挑出至反硝化液体培养基中，振荡，每隔24h测定菌株反硝化能力。
20.上述制备方法的优选方式如下：
21.所述步骤(1)中土壤和无菌水的体积比例为1:9。
22.所述步骤(1)中富集培养基为蛋白胨5.0g/l，酵母5.0g/l，nacl 30.0g/l，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。
23.所述步骤(1)-(3)中振荡均为90～120r/min。
24.所述步骤(2)、(3)中反硝化培养基配方为:乙酸钠1.3g/l，硝酸钾0.722g/l，磷酸二氢钾0.877g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，2ml微量元素，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。微量元素：edta 10.0g/l，硫酸锌0.2g/l，四水合氯化锰1.2g/l,七水合硫酸亚铁1.0g/l,五水合硫酸铜0.5g/l，六水合氯化钴0.3g/l，二水合钼酸钠0.2g/l，氯化钙0.1g/l，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。
25.所述步骤(4)中溴百里酚蓝培养基配方为:乙酸钠1.3g/l，硝酸钾0.722g/l，磷酸二氢钾0.877g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，微量元素2ml，琼脂20g/l，1％溴百里酚蓝1ml，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。
26.有益效果
27.(1)本发明通过选择上海市稻田土壤作为菌种来源，选用合适的培养基，先后通过好氧菌种富集、好氧初筛、获得了耐碱好氧反硝化菌，同一种菌种在强碱条件下具有良好的脱氮效果，解决了传统的反硝化菌在极端条件下脱氮效果差的弊端。
28.(2)本发明对好氧反硝化菌富集驯化方法简单，操作容易，驯化周期短，筛选效率明显提升。
29.(3)本发明驯化出的耐碱好氧反硝化菌能够直接以no
3-‑
n为电子受体高效脱氮，对no
3-‑
n和tn的去除率达到98.75％及58.54％，相比于传统脱氮工艺，极大的提高了微生物对ph的耐受性，具有较大的经济效益和环境效益。
30.(4)本发明选择从上海市稻田土壤作为菌种来源，选择合适的培养基，先后通过好氧菌种富集、驯化、初筛、培养获得了同时具有良好脱氮效果的好氧反硝化菌，琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)5-2，保藏号为(cgmcc no 27105)，在碱性条件下具有良好的脱氮效果。
31.(5)本发明菌株在乙酸钠为碳源，菌株接种量为2％，c/n＝12，ph＝10.0，温度35℃，90r/min条件下(转速只是设定的一个反应条件，起提供溶解氧，营造有氧环境的作用)，该菌株对硝氮及总氮的去除率分别为98.75％及58.54％。为生物脱氮提供了良好的菌种资源。
附图说明
32.图1为5-2菌株的扫描电镜图。
33.图2为不同ph下培养72h后菌株5-2对no
3-‑
n与tn的去除效果。
具体实施方式
34.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
35.实施例1
36.菌株的富集与分离
37.(1)菌种来源：土壤样品来自于上海市稻田土壤。将土壤样品与无菌水按体积比1：9的比例放入250ml锥形瓶中，在30℃，100r/min，振荡20min，使土壤与无菌水均匀分布。
38.(2)配置富集培养基：蛋白胨5.0g/l，酵母5.0g/l，nacl 30.0g/l，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。
39.(3)将(1)中与无菌水混合后的土壤悬液取5ml加入到100ml灭菌后的富集培养基中，于30℃，100r/min，振荡48h。
40.(4)好氧反硝化菌驯化：配置反硝化培养基：乙酸钠1.3g/l，硝酸钾0.722g/l，磷酸二氢钾0.877g/l，七水合硫酸镁0.2g/l,2ml微量元素，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。微量元素：edta 10.0g/l，硫酸锌0.2g/l，四水合氯化锰1.2g/l,七水合硫酸亚铁1.0g/l,五水合硫酸铜0.5g/l，六水合氯化钴0.3g/l，二水合钼酸钠0.2g/l，氯化钙0.1g/l，ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。取上述(3)中富集液2ml加入100ml灭菌后的反硝化培养基中，于30℃，100r/min，振荡48h。随后取2ml上述悬液加入到新鲜的灭菌后的反硝化培养基中。再次于30℃，100r/min，振荡48h。并于反应结束时用分光光度计法测量no3
‑‑
n的去除效果。重复上述操作，直到no3
‑‑
n的去除效果达到稳定80％以上。
41.(5)好氧反硝化菌初筛：配置溴百里酚蓝培养基：乙酸钠1.3g/l，硝酸钾0.722g/l，磷酸二氢钾0.877g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，微量元素2ml，琼脂20g/l，1％溴百里酚蓝1ml ph 7.0
±
0.2，蒸馏水1l。121℃高压灭菌后，制作成固体平板。取最后一个驯化周期的液体培养基1ml，按10倍稀释法将菌液稀释成10-1
～10-8
梯度的菌悬液，取0.1ml涂布于含溴百里酚蓝的反硝化固体培养基上，用无菌涂布器涂布均匀。置于30℃的生化培养箱中培养直至长出清晰的菌落。挑选溴百里酚蓝培养基由绿色变为蓝色的单菌落，继续在溴百里酚蓝固体培养基上划线纯化，如此重复3-5次，直至分离出单菌落。把各个单菌分别命名为a菌，b菌，c菌等。这是初步得到具有反硝化能力的菌株。
42.(6)好氧反硝化菌复筛：将上述(5)初筛中得到的具有反硝化能力的菌株按2％转接至100ml灭菌后的反硝化培养基中，每隔24h取样用分光光度计法测定no3
‑‑
n的去除效果,得到高效的好氧反硝化能力菌株。
43.(7)菌株保藏：制备纯化保藏培养基:蛋白胨10.0g/l，酵母浸粉5.0g/l，nacl 1.0g/l，琼脂20.0g/l，ph 7.0-7.2，蒸馏水1l。121℃灭菌30min。经过划线分离培养，得到一株编号为5-2的好氧反硝化菌。将其在平板划线纯化，用50％甘油在-80℃冰箱中保藏备用。
44.(8)菌种的鉴定
45.参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行。
46.菌落形态特征：菌株5-2的菌落为圆形，边缘整齐，米黄色，光滑。
47.16s rdna序列测定：
48.16s rdna序列测定由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。pcr体系(50.00μl):1.00μl基因组dna，5.00μl 10
×
buffer(含2.50mmol/l mg
2+
)，1.00μldntp，1.00μltaq聚合酶，1.50μl 27f，1.50μl1492r，39.00μl ddh2o。pcr反应温度条件:95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸120s，35个循环。测序后，得到菌株5-2的16srdna序列(如seq id no.1所示)，如下所示。
49.ttggttacctttttacgacttcaccccagtcatcggccacaccgtggtaagcgtcct
50.ccttgcggttagactacctacttctggtgcaacaaactcccatggtgtgacgggcgg
51.tgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcg
52.attccgacttcatggagtcgagttgcagactccaatccggactacgatcggcttttt
53.gagattagcatcacatcgctgtgtagcaaccctttgtaccgaccattgtagcacgtg
54.tgtagccctggccgtaagggccatgatgacttgacgtcgtccccgccttcctccagt
55.ttgtcactggcagtatccttaaagttcccatccgaaatgctggcaagtaaggaaaag
56.ggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagc
57.catgcagcacctgtatctagattcccgaaggcaccaatccatctctggaaagtttct
58.agtatgtcaaggccaggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaaaccacatgctcc
59.accgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttagtcttgcgaccgtactcc
60.ccaggcggtctacttatcgcgttagctgcgccactaaagcctcaaaggccccaacg
61.gctagtagacatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgtttgctcccc
62.atgctttcgtacctcagcgtcagtattaggccagatggctgccttcgccatcggtatt
63.cctccagatctctacgcatttcaccgctacacctggaattctaccatcctctcccata
64.ctctagcttcccagtatcgaatgcaattcccaagttaagctcggggatttcacatccg
65.acttaaaaagccgcctacgcacgctttacgcccagtaaatccgattaacgctcgcac
66.cctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgcgagtaa
67.cgtccactatccaagagtattagtctcagtagcctcctcctcgcttaaagtgctttac
68.aaccataaggccttcttcacacacgcggcatggctggatcagggttccccccattgt
69.ccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtg
70.tggcggatcatcctctcagacccgctacagatcgtcgccttggtaggcctttacccc
71.accaactagctaatccgacttaggctcatctattagcgcaaggtccgaagatcccct
72.gctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcattcctttcggaatgttgtcccccac
73.taataggcagattcctaagcattactcacccgtccgccgctaagataaggtgcaagc
74.acctcatctccgctcgacttgcatgtgttaagcctgccgccagcgttc
75.实施例2
76.不同ph下菌株5-2好氧反硝化效果步骤如下：
77.(1)配置以no
3-‑
n为氮源的模拟污水:称取0.288g/l kno3、0.615g/l ch3coona、0.439g/l kh2po4、0.20g/l mgso4·
7h2o、2ml微量元素：edta 10.0g/l，硫酸锌0.2g/l，四水
合氯化锰1.2g/l,七水合硫酸亚铁1.0g/l,五水合硫酸铜0.5g/l，六水合氯化钴0.3g/l，二水合钼酸钠0.2g/l，氯化钙0.1g/l，ph 7.0
±
0.2)溶于1l去离子水中，分别取100ml配置好的溶液于150ml锥形瓶中。
78.(2)分别取2ml处于对数期(od
600＝
0.6～0.8)的富集培养基悬浮液(富集培养基：蛋白胨5.0g/l，酵母5.0g/l，nacl 30.0g/l，ph 7.0
±
0.2)接种到上述锥形瓶中，在35℃条件下，设置不同溶液ph＝6.0,7.0,8.0,10.0,12.0于水浴恒温振荡器中培养，每隔24h检测no
3-‑
n与tn含量。
79.如图2所示是72h时菌株5-2在不同ph下对no3‑‑
n和tn的去除情况。由图2可知，no3
‑‑
n和tn去除率随着ph的升高逐步增大，no
3-‑
n和tn去除效率(no
3—
n是指好氧反硝化培养基中以乙酸钠做氮源所提供的硝氮；tn是指好氧反硝化培养基中含有的总氮)在ph为10.0时达到最高分别为98.75％及58.54％。表明琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)5-2在碱性条件下具有良好的脱氮效果。

技术特征：
1.一种琼氏不动杆菌，其特征在于，所述琼氏不动杆菌为琼氏不动杆菌(acinetobacter junii)5-2，保藏号为(cgmcc no 27105)，其核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种权利要求1所述琼氏不动杆菌在生物脱氮中的应用。3.一种权利要求1所述琼氏不动杆菌的应用，其特征在于，用于含氮废水。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，将含权利要求1所述琼氏不动杆菌的富集培养基悬浮液接种于含氮废水进行脱氮。5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述富集培养基为蛋白胨5.0g/l，酵母5.0g/l，nacl 30.0g/l，ph 7.0
±
0.2。6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述接种量为2％～3％；温度为：30～35℃条件下，ph＝6.0～12.0，振荡。7.一种权利要求1所述琼氏不动杆菌的筛选方法，包括：(1)将土壤和无菌水混合，得到悬液，然后将悬液于富集培养基中，30～35℃振荡培养2～3天；(2)将取步骤(1)中的富集培养液，加入反硝化培养基中，30～35℃振荡培养46～50h，得到富集液；(3)取步骤(2)富集液加入反硝化培养基中，30～35℃振荡培养，并测试no
3-的去除效率；重复该步骤直到no
3-的去除效率达到稳定80％以上；(4)取步骤(3)no
3-去除率达到稳定80％以上的悬液进行稀释，10-1
～10-8
涂布在溴百里酚蓝培养基中，于30℃培养直至出现可见的菌株周边变蓝菌落；(5)将上述步骤(4)中长出的变蓝菌落用接种环挑出至固体lb培养基平板上，反复划线3～5次，直到出现单菌落为止；(6)将上述步骤(5)中单菌落用无菌接种环挑出至反硝化液体培养基中，振荡，每隔24h测定菌株反硝化能力。8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中富集培养基为蛋白胨5.0g/l，酵母5.0g/l，nacl 30.0g/l，ph 7.0
±
0.2。9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤(2)、(3)中反硝化培养基配方为:乙酸钠1.3g/l，硝酸钾0.722g/l，磷酸二氢钾0.877g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，2ml微量元素，ph 7.0
±
0.2。微量元素：edta 10.0g/l，硫酸锌0.2g/l，四水合氯化锰1.2g/l,七水合硫酸亚铁1.0g/l,五水合硫酸铜0.5g/l，六水合氯化钴0.3g/l，二水合钼酸钠0.2g/l，氯化钙0.1g/l，ph 7.0
±
0.2。10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中溴百里酚蓝培养基配方为:乙酸钠1.3g/l，硝酸钾0.722g/l，磷酸二氢钾0.877g/l，七水合硫酸镁0.2g/l，微量元素2ml，琼脂20g/l，1％溴百里酚蓝1ml，ph 7.0
±
0.2。

技术总结
本发明涉及一种琼氏不动杆菌及其应用，所述琼氏不动杆菌为琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii)5-2，保藏号为(CGMCC No 27105)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明菌株在乙酸钠为碳源，菌株接种量为2％，C/N＝12，pH＝10.0，温度35℃，90r/min条件下，该菌株对硝氮及总氮的去除率分别为98.75％及58.54％。为生物脱氮提供了良好的菌种资源。为生物脱氮提供了良好的菌种资源。为生物脱氮提供了良好的菌种资源。


技术研发人员：赵晓祥 段兴帆 郑文丽 王佳健 宋新山 孙铸宇 许中硕 王宇晖
受保护的技术使用者：东华大学
技术研发日：2023.05.18
技术公布日：2023/8/28