一种牛黄解毒片中2种抑菌性功效成分的检出方法与流程

1.本发明属于中药制剂分析测试领域，具体涉及一种牛黄解毒片中2种抑菌性功效成分的分析测试方法。


背景技术：

2.中医药是我国的民族瑰宝和独特的医疗卫生资源，具有丰富完善的理论体系和天人合一的哲学内涵，尤其在近些年的疫情中发挥着中流砥柱的作用。然而，鉴于中药制剂处方涉及药材多、化学成分复杂等原因，中药制剂中发挥药效成分的物质基础一直模糊不清。这已经成为中药现代化和国际化发展道路上的瓶颈。近年来，中药功效成分的理念不断创新，研究技术日趋成熟，并涌现出很多的研究成果。据查中国知网等数据库，却未发现牛黄解毒片的功效成分研究成果。
3.牛黄解毒片由人工牛黄、雄黄、冰片、黄芩、大黄、石膏、甘草、桔梗八味药材制成，其中黄芩、甘草等药材中化学成分具有抑菌性。在微生物限度检查时，牛黄解毒片表现出较强的抑菌作用，尤其对金黄色葡萄球菌抑菌性最强。这对牛黄解毒片微生物限度检查和方法学验证带来了一定的难度。
4.牛黄解毒片具有清热解毒功效，主治火热内盛、咽喉肿痛、牙龈肿痛、口生舌疮、目赤肿痛。现代中医学认为，“毒”不仅包括传统中医学范畴的湿毒、火毒、热毒、药毒等；也包括近现代西医学范畴的病原微生物，例如：细菌、真菌、衣原体、支原体与病毒等。牛黄解毒片具有的抑菌作用，是对传统的清热解毒功效的补充，属于解毒新功效。查阅文献资料，未有涉及牛黄解毒片抑菌性解毒功效的研究成果。
5.中药指纹图谱技术与药效学的有机结合而建立起来的谱效关系学方法，为牛黄解毒片中2种抑菌性功效成分检出提供了理论基础。该方法具有先进性、科学性、准确性、创新性，在国际上得到广泛认可。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于：针对上述存在的问题与不足，提供一种牛黄解毒片中2种抑菌性功效成分的检出方法。
7.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.一、牛黄解毒片指纹图谱的建立、相似度评价与共有峰指认，步骤如下：
9.1.供试品溶液的制备：取牛黄解毒片10片（包衣片除去包衣），研细，取约2.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率400w，频率40khz）30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
10.2.对照品溶液的制备：分别取黄芩苷对照品、甘草苷对照品约1mg，精密称定，分别置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。
11.3.采用高效液相色谱法，分别吸取供试品溶液与对照品溶液10ul注入液相色谱仪，记录色谱图；用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 （2012年版）建立指纹图谱，并进
行相似度评价与共有峰指认。
12.步骤3所述中的高效液相色谱法色谱分析条件设置如下：色谱柱为diamonsil c18(250mm
×
4.6mm,5um)，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm，柱温为30
°
c，进样量为10ul，流动相为0.15%磷酸溶液和乙腈。
13.步骤3所述中的高效液相色谱法流动相采取梯度洗脱程序，其中流动相a组分为0.15%磷酸溶液，流动相b组分为乙腈，具体比例设置见表1：
14.表1
15.时间（min）a组分（%）b组分（%）0-1197311-15881215-1006832100-1056040105-120973
16.优选的，检测波长为237nm、260nm、280nm；进一步的，检测波长为280nm。
17.优选的，超声处理时间为30分钟、40分钟、50分钟、60分钟；进一步的，超声处理时间为30分钟。
18.二、牛黄解毒片抑菌性功效测试，步骤如下：
19.1.供试品溶液的制备：取牛黄解毒片（包衣片除去包衣）适量，研细，取约2.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加灭菌的ph7.8磷酸盐缓冲液适量溶解，超声处理（功率400w，频率40khz）30min，放冷，加灭菌的ph7.8磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，得供试品溶液。
20.2.对照溶液的制备：取阿莫西林胶囊内容物适量，研匀，精密称定，置50ml容量瓶中，加灭菌水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml置200ml容量瓶中，加灭菌的ph7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，得对照溶液。
21.3.金黄色葡萄球菌培养与计数：取第ⅱ代金黄色葡萄球菌菌种放置至室温，移至生物安全柜，用接种环取适量至10ml的生理盐水试管中，进行10倍稀释，取稀释液1ml至平皿中，倒入20ml新鲜的平板计数培养基，凝固后至32
°
c的生化培养箱培养3d，计数。
22.4.抑菌试验：取灭菌的抗生素鉴定用培养基ⅰ号200ml，加入0.12ml的第ⅱ代金黄色葡萄球菌菌液，混匀，取20ml加入平皿中，冷却凝固后，在培养基表面放置牛津杯。分别向牛津杯中加入供试品溶液与对照溶液，置37.0
°
c培养箱中培养24h。
23.优选的，第ⅱ代金黄色葡萄球菌菌液量为0.05ml、0.10ml、0.12ml、0.15ml；进一步的，第ⅱ代金黄色葡萄球菌菌液量为0.12ml。
24.优选的，超声处理时间为30分钟、40分钟、50分钟；进一步的，超声处理时间为30分钟。
25.三、牛黄解毒片中2种抑菌成分检出，步骤如下：
26.1.确定分析序列：取牛黄解毒片样品的相对抑菌活性数值为参考序列，抑菌性成分的相对峰面积数值为比较序列。
27.2.数据预处理：采用均值化方法处理牛黄解毒片样品的相对抑菌活性数值、抑菌性成分的相对峰面积数值。
28.3.计算灰色关联系数：将相对抑菌活性数据记为参考数列y(k)|k=1,2,3
……
n，指纹图谱甘草苷与黄芩苷峰相对峰面积记为比较数列xi(k)|i=1,2,3
……
n，则绝对差计算公式为
△
i(k)=| y(k)
‑ꢀ
xi(k)|，i表示指纹图谱中共有峰编号（i=1,2,3
……
n）；关联系数计算公式为ai(k)=[
△
i(k)min+ ρ
×△
i(k)max]/[
△
i(k)+ ρ
×△
i(k)max]，其中ρ表示分辨系数（取0.5）。
[0029]
4.计算关联度：取各组灰色关联系数的均值。
[0030]
由于采用上述技术方案，所述的指纹图谱有9个共有峰组成，经与参考图谱对比与计算，牛黄解毒片样品的相似度值不低于0.937；经甘草苷与黄芩苷对照品指认，其峰3保留时间39.326min为甘草苷，峰4保留时间63.187min为黄芩苷；通过灰色关联度分析法，甘草苷的关联度数值为0.696，黄芩苷的关联度数值为0.680；这2种物质与牛黄解毒片的抑菌功能相关，可以作为牛黄解毒片中抑菌功效成分的检出方法。
[0031]
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0032]
（1）建立了牛黄解毒片的指纹图谱，经计算牛黄解毒片样品的相似度均高于0.937，并指认出甘草苷与黄芩苷两个共有物质成分。
[0033]
（2）运用谱效关系学原理，对牛黄解毒片新解毒功效成分进行研究，检测出甘草苷与黄芩苷是牛黄解毒片中的抑菌性功效成分。该方法具有创新性、科学性、前瞻性，可以为牛黄解毒片制剂或其他中药制剂的功效成分研究提供参考。
[0034]
（3）牛黄解毒片抑菌功效成分的研究，对牛黄解毒片微生物限度检查以及方法学验证具有指导意义。
附图说明
[0035][0036]
图1牛黄解毒片样品指纹图谱图2牛黄解毒片样品、黄芩苷对照品与甘草苷对照品重叠色谱图图3牛黄解毒片抑菌试验图谱
具体实施方式
[0037][0038]
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
[0039]
一、牛黄解毒片指纹图谱的建立、相似度评价与共有峰指认
[0040]
1.仪器与材料
[0041]
waters2695/2489型hplc仪器（美国waters公司），xp6型电子分析天平与xs205型电子分析天平（均为mettler toledo），kh7200de型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。
[0042]
甲醇与乙腈（均为国药集团化学试剂有限公司，均为色谱纯），磷酸（上海久亿化学试剂有限公司，分析纯），实验用水为纯化水。
[0043]
甘草苷对照品（批号：111610-201607，含量：93.1%），黄芩苷对照品（批号：110715-201821，含量：95.4%），均来源于中国食品药品检定研究院。
[0044]
牛黄解毒片样品为市售otc药品，具体见表2。
[0045]
表2。
[0046]
编号厂家批号s1葵花药业集团（伊春）有限公司20210414s2湖北仁悦药业股份有限公司210417s3昆明中药厂有限公司410266s4四川旭阳药业有限责任公司201102s5山东仁和制药有限公司002200602s6吉林省华侨药业集团有限公司20210501s7太极集团四川绵阳制药有限公司2106006s8贵州百灵企业集团制药股份有限公司20210304s9江西省芙蓉堂药业股份有限公司210401s10北京同仁堂科技发展股份有限公制药厂21122629s11亚宝药业集团股份有限公司210418s12河北唐威药业有限公司d08002
[0047]
2.溶液的制备
[0048]
（1）供试品溶液的制备：取牛黄解毒片10片（包衣片除去包衣），研细，取约2.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入水50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率400w，频率40khz）30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
[0049]
（2）对照品溶液的制备：分别取黄芩苷对照品、甘草苷对照品约1mg，精密称定，分别置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。
[0050]
3.高效液相色谱法色谱条件：diamonsil c18(250mm
×
4.6mm,5um)为色谱柱；流速为1.0ml/min；检测波长为280nm；柱温为30
°
c；进样量为10ul；以0.15%磷酸水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按表3进行梯度洗脱。
[0051]
表3
[0052]
时间（min）a组分（%）b组分（%）0-1197311-15881215-1006832100-1056040105-120973
[0053]
4.试验条件优化：以黄芩苷对照品作为参照物质，分别在237nm、260nm、280nm的波长条件下测定牛黄解毒片。色谱结果显示在280nm波长条件下黄芩苷的响应值最大，其峰面积是237nm波长条件下黄芩苷峰面积的2.74倍，是260nm波长条件下黄芩苷峰面积的1.80倍。同时，对牛黄解毒片的提取时间进行优化，分别将样品超声处理30min、40min、50min、60min。色谱结果表明，黄芩苷峰面积在30分钟时已经达到最大，且4个时间峰面积的rsd为0.6%。故选择280nm波长的色谱条件与超声处理30min的提取方法。具体数值见表4。
[0054]
表4
[0055][0056]
5.方法学考察
[0057]
（1）精密度试验: 取s4样品制备的供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。结果显示，甘草苷与黄芩苷的相对保留时间rsd均为0.1%、峰面积的rsd均为0.2%（见表5），表明精密度良好。
[0058]
表5
[0059]
峰名相对保留时间rsd（%）峰面积rsd（%）甘草苷0.10.2黄芩苷0.10.2
[0060]
（2）稳定性试验：取s12样品制备的供试品溶液，分别于室温下放置0h、2h、6h、12h、18h、20h、24h后进样，记录色谱图。结果显示，甘草苷与黄芩苷的相对保留时间rsd均为0.2%、峰面积的rsd分别为1.8%和1.3%（见表6），表明供试品溶液在室温下放置24h内稳定性良好。
[0061]
表6
[0062]
峰名相对保留时间rsd（%）峰面积rsd（%）甘草苷0.21.8黄芩苷0.21.3
[0063]
（3）重复性试验：取s4样品制备的供试品溶液6份，进样，记录色谱图。结果显示，甘草苷与黄芩苷的相对保留时间rsd分别为0.9%和0.7%、峰面积的rsd分别为1.0%和0.6%（见表7），表明方法重复性良好。
[0064]
表7
[0065]
峰名相对保留时间rsd（%）峰面积rsd（%）甘草苷0.91.0黄芩苷0.70.6
[0066]
6.指纹图谱的建立与相似度评价
[0067]
取s1-s12样品制备的供试品溶液，进样，记录色谱图。选取s12为hplc对照指纹图谱（r），采用 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》 （2012年版）建立指纹图谱，并进行相似度评价。结果显示，与对照指纹图谱相比，12个厂家的牛黄解毒片hplc图谱整体峰形一致，相似度均不低于0.937（见表8）。表明不同厂家的牛黄解毒片成分差异较小，具有较好的一致性。
[0068]
表8
[0069]
编号s12（对照）编号s12（对照）编号s12（对照）
s10.958s50.958s90.994s20.988s60.937s100.959s30.962s70.937s110.947s40.973s80.951s121.000
[0070]
7.共有峰指认与相对峰面积
[0071]
（1）采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）软件，设置时间窗口为0.1min，选择指纹图谱中峰形较好的色谱峰进行多点校正，采用中位数法生成图谱，同时结合对照品的hplc图谱，指认出3号共有峰为甘草苷、4号共有峰为黄芩苷。
[0072]
（2）采用waters2695/2489高效液相色谱仪数据处理软件对2个共有峰进行积分，计算各个峰相对峰面积（峰面积/取样量），结果见表9。
[0073]
表9
[0074]
编号甘草苷黄芩苷s1353479619888742s2175087539083982s3177804619432938s4164687318011067s5236957516372118s6144968723436212s7150271022720317s8127728213342528s9194299117835683s10175615113548002s11172788917040963s12165196618733829
[0075]
二、牛黄解毒片抑菌性功效测试
[0076]
1.仪器与材料
[0077] yxq-ls-75sll型立式压力蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司），spx-300
‑ⅱ
型生化培养箱与g2x-gf101-3bs型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司），zy-300iv多功能微生物自动测量分析仪（北京先驱威锋技术开发公司）。
[0078]
磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），磷酸氢二钾（汕头市西陇化工厂有限公司，分析纯），平板计数培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号1104435），抗生素检定用培养基ⅰ号（广东环凯微生物科技有限公司，批号1094651）。
[0079]
金黄色葡萄球菌[cmcc(b) 26003]购自江苏省食品药品监督检验研究院。
[0080]
阿莫西林胶，安徽安科恒益药业有限公司，批号210431，规格0.25g。
[0081]
2.溶液的制备
[0082]
（1）供试品溶液：取牛黄解毒片适量，研细，取约2.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加灭菌的ph7.8磷酸盐缓冲液适量溶解，超声处理（功率400w，频率40khz）30min，放冷，加灭菌的ph7.8磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，得供试品溶液。
[0083]
（2）对照溶液：取阿莫西林约5mg，精密称定，置50ml 容量瓶中，加灭菌水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml置200ml容量瓶中，加灭菌的ph7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，得对照溶液。
[0084]
3.金黄色葡萄球菌培养与计数：取第ⅱ代金黄色葡萄球菌菌种放置至室温，移至生物安全柜，用接种环取适量至10ml的生理盐水试管中，进行10倍稀释，取稀释液1ml至平皿中，倒入20ml新鲜的平板计数培养基，凝固后至32
°
c的生化培养箱培养3d，计数，菌液浓度为2.7
×
107cfu/ml。
[0085]
4.菌液用量的优化
[0086]
取金黄色葡萄球菌的菌液0.05ml、0.10ml、0.12ml、0.15ml，加入到200ml已灭菌的抗生素鉴定用ⅰ号培养基中，混匀。取20ml含菌培养基加入灭菌平皿中，待冷却凝固后，在老化的培养基表面放置牛津杯。分别向牛津杯中加入阿莫西林对照溶液、阴性对照溶液，置37.0
°
c培养箱中培养24h。结果显示，阴性对照无抑菌圈出现，阿莫西林对照有抑菌圈出现。经抑菌圈扫描仪测量，取0.12ml菌液量时，阿莫西林对照抑菌圈直径为19.75mm（见表10），符合《中国药典》2020年版四部要求。
[0087]
表10
[0088]
菌液量（ml）培养基加入量（ml）菌液浓度（ml/ml）阿莫西林对照抑菌圈直径（mm）0.052000.0002524.510.102000.000522.690.122000.000619.750.152000.0007517.27
[0089]
5.提取时间的优化
[0090]
按供试品溶液制备方法，精密称取3份供试品，分别超声处理（功率400w，频率40khz）30min、40min、50min，作为供试品溶液；取金黄色葡萄球菌的菌液0.12ml，加入到200ml已灭菌的抗生素鉴定用ⅰ号培养基中，混匀。取20ml含菌培养基加入灭菌平皿中，待冷却凝固后，在老化的培养基表面放置牛津杯。再分别向牛津杯中加入3份供试品溶液及对阿莫西林照溶液，置37.0
°
c培养箱中培养24h。经抑菌圈扫描仪测量，并经计算，3份供试品溶液直径值的rsd为0.5%（见表11）。结果表明，供试品溶液的提取时间可为30min。
[0091]
表11
[0092][0093]
6.抑菌试验
[0094]
（1）取灭菌的抗生素鉴定用培养基ⅰ号200ml，加入0.12ml的第ⅱ代金黄色葡萄球菌菌液，混匀，取20ml加入平皿中，冷却凝固后，在培养基表面放置牛津杯。分别向牛津杯中加入供试品溶液与对照溶液，置37.0
°
c培养箱中培养24h。
[0095]
（2）采用抑菌圈扫描仪，测定抑菌圈直径，计算抑菌圈面积大小及相对抑菌活性（相对抑菌活性=牛黄解毒片样品抑菌圈面积
×
阿莫西林对照取样量/牛黄解毒片样品取样量
×
阿莫西林对照抑菌圈面积）。结果见表12。
[0096]
表12
[0097]
编号样品抑菌圈面积（mm2）对照抑菌圈面积（mm2）相对抑菌活性s1239.43295.89222.92s2255.03322.70218.51s3171.11332.64142.39s4229.66303.26210.40s5227.25297.73211.24s6232.35300.18215.27s7190.16302.02175.52s8283.83320.47246.55s9201.31300.18186.49s10282.93294.98267.27s11224.32286.82217.11s12201.82306.04182.77
[0098]
三、灰色关联度分析
[0099]
1.数据处理
[0100]
采用均值法处理表9与表12的试验数据，对各个数据归一化。将变换后的相对抑菌活性数据记为参考数列y(k)|k=1,2,3
……
n，指纹图谱中甘草苷与黄芩苷峰相对峰面积记为比较数列xi(k)|i=1,2,3
……
n，则绝对差计算公式为
△
i(k)=| y(k)
‑ꢀ
xi(k)|，i表示指纹图谱中共有峰编号（i=1,2,3
……
n）；关联系数计算公式为ai(k)=[
△
i(k)min+ ρ
×△
i(k)max]/[
△
i(k)+ ρ
×△
i(k)max]，其中ρ表示分辨系数（取0.5）。
[0101]
2.灰色关联度分析
[0102]
计算各个色谱峰关联系数并计算其平均值，作为关联度，结果见表13。表13中，甘草苷与黄芩苷关联度数值均大于0.6，表明其与抑菌活性有关联性；甘草苷关联度数值为0.696，表明其与抑菌活性有较大的关联性。
[0103]
表13
[0104][0105]
本具体实施例仅仅是对本发明的详细说明，其并不是对本发明的专利申请范围的限制，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

技术特征：
1.一种牛黄解毒片中 2 种抑菌性功效成分的检出方法，其特征在于，步骤如下：（1）牛黄解毒片指纹图谱的建立、相似度评价与共有峰指认；（2）牛黄解毒片抑菌性功效测试；（3）牛黄解毒片中 2 种抑菌成分检出。2.根据权利要求 1 所述的一种牛黄解毒片中 2 种抑菌性功效成分的检出方法，其特征在于，对步骤（1）所述牛黄解毒片指纹图谱的建立、相似度评价与共有峰确认的方法如下：s1.供试品溶液的制备：取牛黄解毒片 10 片（包衣片除去包衣），研细，取约 2.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入水 50ml，密塞，称定重量，超声处理（功率 400w，频率 40khz）30min，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得供试品溶液;s2.对照品溶液的制备：分别取黄芩苷对照品、甘草苷对照品约 1mg，精密称定，分别置 10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液;s3.采用高效液相色谱法，分别吸取供试品溶液与对照品溶液 10ul 注入液相色谱仪，记录色谱图；用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012 年版）建立指纹图谱，并进行相似度评价与共有峰指认。3.根据权利要求 1 所述的一种牛黄解毒片中 2 种抑菌性功效成分的检出方法，其特征在于，对步骤（2）所述牛黄解毒片抑菌性功效测试的方法如下：s1.供试品溶液的制备：取牛黄解毒片（包衣片除去包衣）适量，研细，取约 2.5g，精密称定，置 25ml 容量瓶中，加灭菌的 ph7.8 磷酸盐缓冲液适量溶解，超声处理（功率 400w，频率40khz）30min，放冷，加灭菌的 ph7.8 磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，得供试品溶液;s2.对照溶液的制备：取阿莫西林约 5mg，研匀，精密称定，置 50ml 容量瓶中，加灭菌水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 1ml 置 200ml 容量瓶中，加灭菌的 ph7.8磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，得对照溶液;s3.金黄色葡萄球菌培养与计数：取第ii代金黄色葡萄球菌菌种放置至室温，移至生物安全柜，用接种环取适量至 10ml 的生理盐水试管中，进行 10 倍稀释，取稀释液 1ml 至平皿中，倒入 20ml 新鲜的平板计数培养基，凝固后至 32
°
c 的生化培养箱培养 3d，计数;s4.抑菌试验：取灭菌的抗生素鉴定用培养基i号 200ml，加入 0.12ml 的第ii代金黄色葡萄球菌菌液，混匀，取 20ml 加入平皿中，冷却凝固后，在培养基表面放置牛津杯。分别向牛津杯中加入供试品溶液与对照溶液，置 37.0
°
c 培养箱中培养 24h。4.根据权利要求 1 所述的一种牛黄解毒片中 2 种抑菌性功效成分的检出方法，其特征在于，对步骤（3）所述牛黄解毒片中 2 种抑菌成分检出的方法如下：s1.确定分析序列：取牛黄解毒片样品的相对抑菌活性数值为参考序列，抑菌性成分的相对峰面积数值为比较序列；s2.数据预处理：采用均值化方法处理牛黄解毒片样品的相对抑菌活性数值、抑菌性成分的相对峰面积数值；s3.计算灰色关联系数：将相对抑菌活性数据记为参考数列 y(k)|k=1,2,3......n，指纹图谱甘草苷与黄芩苷峰相对峰面积记为比较数列 xi(k)|i=1,2,3......n，则绝对差计
算公式为
△
i(k)=|y(k)-xi(k)|， i 表示指纹图谱中共有峰编号（ i=1,2,3......n）；关联系数计算公式为ai(k)=[
△
i(k)min+ρ
×△
i(k)max]/[
△
i(k)+ρ
×△
i(k)max]，其中 ρ 表示分辨系数（取 0.5）；s4. 计算关联度：取各组灰色关联系数的平均值 。5.根据权利要求 2 所述的一种牛黄解毒片中 2 种抑菌性功效成分的检出方法，其特征在于，对步骤 s3 所述中的高效液相色谱分析条件设置如下：色谱柱为 diamonsil c18(250mm
×
4.6mm,5um)，流速为 1.0ml/min，检测波长为 280nm，柱温为 30
°
c，进样量为 10ul，流动相为 0.15%磷酸溶液和乙腈。6.根据权利要求 2 所述的一种牛黄解毒片中 2 种抑菌性功效成分的检出方法，其特征在于，对步骤 s3 所述中的高效液相色谱色谱法中流动相采用梯度洗脱程序，流动 a 组分为 0.15%磷酸溶液，流动相 b 组分为乙腈，具体比例设置如下，见表 1：时间（min）a组分（%）b组分（%）0-1197311-15881215-1006832100-1056040105-120973。7.根据权利要求 1-6 所述的一种牛黄解毒片中 2 种抑菌性功效成分的检出方法，其特征在于：所述的指纹图谱有 9 个共有峰组成，经与参考图谱对比与计算，牛黄解毒片样品的相似度值不低于 0.937；经甘草苷与黄芩苷对照品指认，其峰 3 保留时间 39.326min 为甘草苷，峰4 保留时间 63.187min 为黄芩苷；通过灰色关联度分析法，甘草苷的关联度数值为 0.696，黄芩苷的关联度数值为 0.680；这两个物质与牛黄解毒片的抑菌功能相关，可以作为牛黄解毒片中抑菌性功效成分的检出方法。

技术总结
本发明属于中药制剂分析测试领域，具体涉及一种牛黄解毒片中2种抑菌性功效成分的检出方法。本发明所述方法通过灰色关联度法将牛黄解毒片指纹图谱中的化学物质信息与牛黄解毒片的药效信息相互关联，构建了牛黄解毒片的谱效关系，从而达到牛黄解毒片中药效成分检出的目的。本发明直观反映了牛黄解毒片的抑菌效果，并对其抑菌性功效成分进行检测，得到甘草苷与黄芩苷两种已知成分的抑菌性物质。本发明可为牛黄解毒片制剂或其他中药制剂的药效成分检出提供科学依据与参考作用，对牛黄解毒片的微生物限度检查及其质量控制提供指导意义。的微生物限度检查及其质量控制提供指导意义。


技术研发人员：张伟
受保护的技术使用者：淮安市食品药品检验所
技术研发日：2023.05.23
技术公布日：2023/8/28