一种细胞保存液及其应用和细胞保存方法与流程

1.本发明涉及细胞保存技术领域，尤其涉及一种细胞保存液及其应用和细胞保存方法。


背景技术：

2.免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。自然杀伤t细胞由胸腺t细胞的分支发育而来，是一群细胞表面既有t细胞受体tcr，又有nk细胞特征的免疫细胞。自然杀伤t细胞具有增强和抑制免疫反应的双重免疫调节作用。它将先天性免疫应答和获得性免疫应答连接起来，可识别由cd1d呈递的糖脂类抗原，活化后迅速分泌大量细胞因子从而调节机体的免疫应答。调控自然杀伤t细胞的功能可达到对肿瘤以及多种人类疾病的治疗效果。
3.目前自然杀伤t细胞常见的保存方式是将自然杀伤t细胞在液氮中进行超低温保存，虽然该方法适合长期保存，但对于需短时间保存即会利用的细胞采用液氮保存存在诸多不便，同时液氮保存对自然杀伤t细胞损伤极大，影响细胞活性。
4.随着细胞培养技术的发展，应用于临床的细胞药物逐渐增多，作为细胞治疗产品的主要成分，其活率的高低等参数直接影响后续治疗效果。目前，制备一种即可满足自然杀伤t细胞短时间运输保存且无需超低温环境的保存液，以提高细胞保存活率，具有极好的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种细胞保存液及其应用和细胞保存方法。
6.一种细胞保存液，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠0.1-1mg/ml，d-甘露醇20-26μg/ml，五羟黄酮10-16μg/ml，l-谷氨酰胺1-3mg/ml，山柰素-3-鼠李葡糖苷0.2-0.6mg/ml，木兰花碱1-2mg/ml，羟乙基淀粉10-14mg/ml，二硫苏糖醇0.01-0.1mg/ml，氯化钠9mg/ml，人血清白蛋白0.5-1.5mg/ml。
7.优选地，五羟黄酮和山柰素-3-鼠李葡糖苷的质量比为11-15：300-500。
8.优选地，山柰素-3-鼠李葡糖苷和木兰花碱的质量比为0.3-0.5：1.3-1.7。
9.上述细胞保存液用于免疫细胞保存的应用。
10.优选地，免疫细胞为自然杀伤t细胞。
11.一种细胞保存方法，包括如下步骤：
12.(1)将细胞悬浮于上述细胞保存液中得到细胞密度为1-2
×
108cells/ml的细胞悬液；
13.(2)将细胞悬液分装在冻存管中，在温度为10-15℃环境中保存。
14.优选地，保存时间为5-15天。
15.本发明的技术效果如下所示：
16.本发明首次将五羟黄酮、山柰素-3-鼠李葡糖苷复配添加至细胞保存液中用于细胞保存，当细胞在10-15℃保存时，五羟黄酮、山柰素-3-鼠李葡糖苷复配可有效避免对细胞膜蛋白质损伤，防止细胞损伤，有效提高保存液稳定性，但申请人通过大量实验发现，即使可保证细胞活率，但其杀伤能力降低。
17.申请人进一步向其中添加木兰花碱，在为细胞提供更为稳定的保存环境的基础上，可延长细胞(尤其自然杀伤细胞t细胞)的保存时间长达15天，而且保存后的自然杀伤t细胞仍具有极好的杀伤能力，其杀伤活性可达71.46％，充分满足临床需求。
18.本发明所得保存液无需dmso和动物血清，并且降低了人血清白蛋白的用量，其安全性更高，可有效提高保存细胞的活率，增强其杀伤活性。
19.本发明不仅操作简便，有效降低保存成本，同时保存时间长，为自然杀伤t细胞的非冻存运输提供便利。
附图说明
20.图1为采用实施例5和对比例1-2所得细胞保存液在不同保存时间时活率对比图。
21.图2为采用实施例5和对比例1-2所得细胞保存液在保存15天时杀伤活性对比图。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
23.实施例1
24.一种细胞保存液，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠0.1mg/ml，d-甘露醇20μg/ml，五羟黄酮10μg/ml，l-谷氨酰胺1mg/ml，山柰素-3-鼠李葡糖苷0.2mg/ml，木兰花碱1mg/ml，羟乙基淀粉10mg/ml，二硫苏糖醇0.01mg/ml，氯化钠9mg/ml，人血清白蛋白0.5mg/ml。
25.一种细胞保存方法，包括如下步骤：
26.(1)将细胞悬浮于上述细胞保存液中得到细胞密度为1
×
108cells/ml的细胞悬液；
27.(2)将细胞悬液分装在冻存管中，在温度为10℃环境中保存5天。
28.实施例2
29.一种细胞保存液，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠1mg/ml，d-甘露醇26μg/ml，五羟黄酮16μg/ml，l-谷氨酰胺3mg/ml，山柰素-3-鼠李葡糖苷0.6mg/ml，木兰花碱2mg/ml，羟乙基淀粉14mg/ml，二硫苏糖醇0.1mg/ml，氯化钠9mg/ml，人血清白蛋白1.5mg/ml。
30.一种细胞保存方法，包括如下步骤：
31.(1)将细胞悬浮于上述细胞保存液中得到细胞密度为2
×
108cells/ml的细胞悬液；
32.(2)将细胞悬液分装在冻存管中，在温度为11℃环境中保存10天。
33.实施例3
34.一种细胞保存液，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠0.2mg/ml，d-甘露醇24μg/ml，五羟黄酮11μg/ml，l-谷氨酰胺2.5mg/ml，山柰素-3-鼠李葡糖苷0.3mg/ml，木兰花碱1.7mg/ml，羟乙基淀粉11mg/ml，二硫苏糖醇0.08mg/ml，氯化钠9mg/ml，人血清白蛋白0.8mg/ml。
35.一种细胞保存方法，包括如下步骤：
36.(1)将细胞悬浮于上述细胞保存液中得到细胞密度为1.7
×
108cells/ml的细胞悬液；
37.(2)将细胞悬液分装在冻存管中，在温度为12℃环境中保存12天。
38.实施例4
39.一种细胞保存液，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠0.8mg/ml，d-甘露醇22μg/ml，五羟黄酮15μg/ml，l-谷氨酰胺1.5mg/ml，山柰素-3-鼠李葡糖苷0.5mg/ml，木兰花碱1.3mg/ml，羟乙基淀粉13mg/ml，二硫苏糖醇0.02mg/ml，氯化钠9mg/ml，人血清白蛋白1.2mg/ml。
40.一种细胞保存方法，包括如下步骤：
41.(1)将细胞悬浮于上述细胞保存液中得到细胞密度为1.3
×
108cells/ml的细胞悬液；
42.(2)将细胞悬液分装在冻存管中，在温度为14℃环境中保存8天。
43.实施例5
44.一种细胞保存液，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠0.5mg/ml，d-甘露醇23μg/ml，五羟黄酮13μg/ml，l-谷氨酰胺2mg/ml，山柰素-3-鼠李葡糖苷0.4mg/ml，木兰花碱1.5mg/ml，羟乙基淀粉12mg/ml，二硫苏糖醇0.05mg/ml，氯化钠9mg/ml，人血清白蛋白1mg/ml。
45.一种细胞保存方法，包括如下步骤：
46.(1)将细胞悬浮于上述细胞保存液中得到细胞密度为1.5
×
108cells/ml的细胞悬液；
47.(2)将细胞悬液分装在冻存管中，在温度为15℃环境中保存。
48.对比例1
49.一种细胞保存液，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠0.5mg/ml，d-甘露醇23μg/ml，五羟黄酮13μg/ml，l-谷氨酰胺2mg/ml，木兰花碱1.5mg/ml，羟乙基淀粉12mg/ml，二硫苏糖醇0.05mg/ml，氯化钠9mg/ml，人血清白蛋白1mg/ml。
50.对比例2
51.一种细胞保存液，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠0.5mg/ml，d-甘露醇23μg/ml，五羟黄酮13μg/ml，l-谷氨酰胺2mg/ml，山柰素-3-鼠李葡糖苷0.4mg/ml，羟乙基淀粉12mg/ml，二硫苏糖醇0.05mg/ml，氯化钠9mg/ml，人血清白蛋白1mg/ml。
52.将收集得到的自然杀伤t细胞分别置于实施例5和对比例1-2所得细胞保存液中，按实施例5中细胞保存方法保存15d。每组设置6个小组，每个小组设置5个重复。分别在保存1天、2天、5天、10天、15天时用台盼蓝染色法统计自然杀伤t细胞的活率。
53.然后以k562细胞为靶细胞，将上述剩余保存15d的细胞细胞离心除去保存液，采用添加1％胎牛血清的rpmi1640培养基重悬细胞，调整细胞密度为1
×
106cells/ml。以未经保存的自然杀伤t细胞作为空白对照。按效靶比为20：1接种至96孔板中，同时设置效应细胞孔和靶细胞孔，每组设置3个复孔，在37℃、5％co2的培养箱中共培养4h，检测各组的吸光度(a)值，
54.杀伤活性＝[1-(a
实验孔-a
效应孔
/a
靶细胞孔
)]
×
100％。
[0055]
如图1和图2所示，采用实施例5所得保存液对自然杀伤t细胞进行保存，其活率为最高，杀伤活性与原始自然杀伤t细胞的杀伤活性极为接近。说明本技术采用五羟黄酮、山柰素-3-鼠李葡糖苷、木兰花碱等各成分协同作用，为自然杀伤t细胞提供稳定的外环境，减
少自然杀伤t细胞凋亡，有助于自然杀伤t细胞维持活性，而且保存后的自然杀伤t细胞仍具有极好的杀伤能力，其杀伤活性可达71.46％。
[0056]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种细胞保存液，其特征在于，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠0.1-1mg/ml，d-甘露醇20-26μg/ml，五羟黄酮10-16μg/ml，l-谷氨酰胺1-3mg/ml，山柰素-3-鼠李葡糖苷0.2-0.6mg/ml，木兰花碱1-2mg/ml，羟乙基淀粉10-14mg/ml，二硫苏糖醇0.01-0.1mg/ml，氯化钠9mg/ml，人血清白蛋白0.5-1.5mg/ml。2.根据权利要求1所述细胞保存液，其特征在于，五羟黄酮和山柰素-3-鼠李葡糖苷的质量比为11-15：300-500。3.根据权利要求1所述细胞保存液，其特征在于，山柰素-3-鼠李葡糖苷和木兰花碱的质量比为0.3-0.5：1.3-1.7。4.如权利要求1-3任一项所述细胞保存液用于免疫细胞保存的应用。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，免疫细胞为自然杀伤t细胞。6.一种细胞保存方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将细胞悬浮于权利要求1-3任一项所述细胞保存液中得到细胞密度为1-2
×
108cells/ml的细胞悬液；(2)将细胞悬液分装在冻存管中，在温度为10-15℃环境中保存。7.根据权利要求6所述细胞保存方法，其特征在于，保存时间为5-15天。

技术总结
本发明公开了一种细胞保存液，其组分包括：乙二胺四乙酸二钠0.1-1mg/mL，D-甘露醇20-26μg/mL，五羟黄酮10-16μg/mL，L-谷氨酰胺1-3mg/mL，山柰素-3-鼠李葡糖苷0.2-0.6mg/mL，木兰花碱1-2mg/mL，羟乙基淀粉10-14mg/mL，二硫苏糖醇0.01-0.1mg/mL，氯化钠9mg/mL，人血清白蛋白0.5-1.5mg/mL。本发明还公开了上述细胞保存液的应用。本发明还公开了一种细胞保存方法，将细胞悬浮于上述细胞保存液中得到细胞悬液；将细胞悬液分装在冻存管中，在温度为10-15℃环境中保存。℃环境中保存。


技术研发人员：彭昉 俞英豪 张孝松 陈波
受保护的技术使用者：杭州中赢生物医疗科技有限公司
技术研发日：2023.05.25
技术公布日：2023/8/28