一种肉豆蔻曲的炮制方法及其应用

1.本发明涉及中药炮制领域，特别是一种肉豆蔻曲的炮制方法及其应用。


背景技术：

2.肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻myristica fragrans houtt.的干燥种仁，常绿乔木，原产于马来西亚、印度尼西亚等地，现中国广东、广西、云南亦有栽培，是著名的香料和药用植物。其味辛，性温，归脾、胃、大肠经，具有温中行气、涩肠止泻的功效，临床可用于治疗脾胃虚寒，久泻不止，脘腹胀痛，食少呕吐。
3.肉豆蔻生品中含有大量油类物质(挥发油和脂肪油)，有滑肠之弊，古籍中对肉豆蔻炮制的记载多以去油为主要目的，炮制后入药一方面可降低毒性成分的含量，另一方面可增强固肠止泻的功效。肉豆蔻挥发油中既含有有效成分，又有毒性成分。肉豆蔻具有温中行气、涩肠止泻的功效，发挥止泻作用的有效成分为甲基丁香酚和异丁香酚甲醚，炮制后，挥发油含量显著降低，其止泻成分甲基丁香酚、甲基异丁香酚含量升高，毒性成分肉豆蔻醚、黄樟醚含量降低，故临床多用其炮制品，但大剂量的使用煨肉豆蔻亦可能有产生毒性的风险。
4.现行《中国药典》(2020版)中记载了麸煨肉豆蔻的炮制方法，取净肉豆蔻，加入麸皮(每100kg肉豆蔻用麦麸40kg)同置锅内，文火加热并适当翻动(150～160℃)，约15分钟，至麸皮呈焦黄色，肉豆蔻呈棕褐色，表面有裂隙时取出，筛去麦麸，放凉，用时捣碎。
5.发酵是近些年来中药炮制研究的热点，中药发酵是借助微生物的自身代谢，对原药材中化学成分进行分解、加工、结构修饰，可以较大幅度地改变药性、提高疗效、降低毒副作用，这也为中药的发展提供了广阔空间。传统中药发酵通常有两种方法，一种是药料与面粉进行简单混合发酵，如六神曲、半夏曲、建神曲等；另外一种是用药料直接进行发酵，如淡豆豉、百药煎等。近年来，中药发酵炮制机制研究取得了长足进展，但对肉豆蔻的发酵炮制研究还未见相关文献报导。其发酵后化学成分及药性、药理作用的变化尚不明确。


技术实现要素：

6.针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种肉豆蔻曲的炮制方法及其应用，可有效解决对肉豆蔻的发酵炮制并无研究的问题。
7.为实现上述目的，本发明解决的技术方案是，一种肉豆蔻曲的炮制方法，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉75-85g、麦麸10-15g及面粉5-10g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为30～35℃，湿度为85％～90％，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。
8.所述方法制备的肉豆蔻曲在制备治疗脾肾阳虚泄泻药物中的应用。
9.所述方法制备的肉豆蔻曲在制备二神丸药物中的应用。
10.所述的二神丸药物包括肉豆蔻曲和盐补骨脂，其中将盐补骨脂和肉豆蔻曲按质量
比2:1混匀，粉碎成细粉，加蒸馏水均匀混合配制成0.24g
·
ml-1
的混悬液，即得。
11.本发明采用自然发酵的方法炮制肉豆蔻制备肉豆蔻曲，制备的肉豆蔻曲中止泻成分甲基丁香酚和异丁香酚甲醚含量升高，毒性成分肉豆蔻醚含量降低，且肉豆蔻曲与盐补骨脂配伍使用制得的二神丸对脾肾阳虚泄泻的作用效果显著，为临床治疗脾肾阳虚泄泻药物提供了技术支持，是肉豆蔻炮制方法上的一大创新，社会和经济效益显著。
附图说明
12.图1是本发明肉豆蔻曲发酵结束后的照片。
13.图2是本发明各组小鼠病理组织的he染色切片图(
×
200)。
14.图3是本发明各组小鼠肠道菌群otu聚类分析结果图。
15.图4是本发明各组小鼠肠道菌群结构分析图(a：科水平b：属水平)。
具体实施方式
16.以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
17.实施例1
18.一种肉豆蔻曲的炮制方法，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉75g、麦麸10g及面粉5g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为30℃，湿度为85％，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。
19.实施例2
20.一种肉豆蔻曲的炮制方法，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉80g、麦麸13g及面粉8g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为32℃，湿度为87％，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。
21.实施例3
22.一种肉豆蔻曲的炮制方法，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉85g、麦麸15g及面粉10g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为35℃，湿度为90％，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。
23.实施例4
24.一种肉豆蔻曲的炮制方法，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉82g、麦麸13g及面粉6g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为31℃，湿度为86％，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。
25.本发明方法制备的肉豆蔻曲，经实际试验和测定，取得非常好的有益技术效果，以
实施例2为例，有关资料如下：
26.一、hplc法测定不同炮制品肉豆蔻挥发油中甲基丁香酚、异丁香酚甲醚、肉豆蔻醚等有效成分
27.1.材料
28.1.1仪器
29.agilent 1260型高效液相色谱仪(配置pda检测器，美国安捷伦科技公司)；恒温恒湿培养箱(上海一恒)；sartorius bt25s型十万分之一电子分析天平；优普超纯水机；kq-500dv型数控超声波清洗器；hwl-125型电热恒温干燥箱；fa2104b型电子天平；znhw型智能控温电热套；sc-150t型打粉机。
30.1.2试剂与药物
31.肉豆蔻(批号：211201，安徽惠丰国药有限公司)、甲醇(批号：23025047，美国tedia公司)、磷酸、对照品甲基丁香酚(批号：h27o9z73672)、异丁香酚甲醚(批号：y20j7k9339)、肉豆蔻醚(批号：y18j10h80279)均购自上海源叶生物科技有限公司。
32.2.方法与结果
33.2.1样品的制备
34.2.1.1麸煨肉豆蔻
35.取肉豆蔻100g、麦麸40g同置锅内，文火加热并适当翻动(150～170℃)，至麦麸呈焦黄色，肉豆蔻呈深棕色时取出，筛去麦麸，放凉，即得。
36.2.1.2面裹煨肉豆蔻
37.取面粉50g加适量水做成团块，压成薄片，将肉豆蔻100g逐个包裹，投入已炒热的滑石粉锅内，适当翻动，至面皮呈焦黄色时取出，筛去滑石粉，放凉，剥去面皮，即得。
38.2.1.3肉豆蔻曲
39.按实施例2所述方法制备肉豆蔻曲，即取过5号筛的肉豆蔻药粉80g、麦麸13g及面粉8g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为32℃，湿度为87％，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。
40.2.1.4肉豆蔻干燥品
41.取过5号筛的肉豆蔻药粉80g、麦麸13g、面粉8g，将面粉加蒸馏水加热制成稀糊状，趁热与上述药粉揉和均匀，以手捏成团，掷之即散为宜，捏制成方块，于50℃恒温干燥箱干燥24小时，即得。即按照2.1.3项下步骤发酵步骤制备不发酵直接干燥。
42.2.2色谱条件
43.色谱柱zorbax eclipse xdb-c18(4.6*250mm)；流动相甲醇-0.2％磷酸(70:30)，等度洗脱；体积流量0.8ml
·
min-1
；柱温35℃；检测波长280nm；进样量2ul，检测时间25min。
44.2.3供试品溶液制备
45.分别精密称取生品肉豆蔻、肉豆蔻曲、肉豆蔻干燥品、麸煨肉豆蔻、面裹肉豆蔻(过2号筛)各20g，不浸泡，加水300ml，按照《中国药典》(2020年版)2204挥发油测定法(甲法)提取5h，收集挥发油。取收集的挥发油，无水硫酸钠脱水处理，转移至25ml容量瓶中，甲醇定容至刻度线，过0.22μm滤膜，即得。
46.2.4对照品溶液制备
47.精密量取各对照品适量，分别用甲醇制成含甲基丁香酚2mg
·
ml-1
、异丁香酚甲醚2mg
·
ml-1
、丁香酚1.78mg
·
ml-1
、肉豆蔻醚10mg
·
ml-1
的标准品溶液。
48.2.5方法学考察
49.2.5.1线性关系试验
50.取2.4项下各对照品溶液，逐级稀释2、4、8、16、32倍，得到一系列不同质量浓度的单一对照品溶液，按照2.2项下色谱条件进样，以对照品溶液浓度(mg
·
ml-1
)为横坐标(x)，测得的峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线，得到各成分的线性回归方程，由结果可知，待测成分在测定的浓度范围内线性关系良好。结果见表1。
51.表1肉豆蔻挥发油中4种代表性成分线性关系
[0052][0053]
2.4.2精密度试验
[0054]
精密吸取混合对照品溶液2μl，按照2.2项下色谱条件，连续进样6次，测得甲基丁香酚、异丁香酚甲醚、肉豆蔻醚、丁香酚峰面积的rsd值分别为0.3292％，0.3024％，0.3268％，0.2144％，实验结果表明仪器精密度良好。实验数据见表2。
[0055]
表2精密度试验结果
[0056][0057]
2.4.3重复性试验
[0058]
精密称取同一样品6份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，精密吸取2μl，注入高效液相色谱仪，按照2.2项下色谱条件进样，测定甲基丁香酚、异丁香酚甲醚、肉豆蔻醚、丁香酚峰面积的rsd值分别为0.7466％，3.3685％，2.4497％，3.0166％，表明该方法重复性良好，试验数据见表3。
[0059]
表3重复性试验结果
[0060][0061]
2.4.4稳定性试验
[0062]
精密吸取同一供试品溶液2μl，分别在0、2、4、6、8、10、12h时进样，测定甲基丁香酚、异丁香酚甲醚、肉豆蔻醚、丁香酚峰面积的rsd值分别为1.2827％，0.3719％，0.3789％，0.9375％，表明供试品溶液在12h内稳定性良好，具体数据见表4。
[0063]
表4稳定性试验结果
[0064][0065][0066]
2.4.5加样回收率试验
[0067]
精密量取已知浓度的供试品溶液6份，分别加入单一对照品溶液适量，按照2.2项下色谱条件进样，计算得甲基丁香酚、异丁香酚甲醚、肉豆蔻醚的平均加样回收率分别为100.39％、100.56％、105.27％，rsd值分别为1.12％、2.45％、1.15％，结果见下表5。
[0068]
表5加样回收率实验结果
[0069][0070]
2.4.6样品含量测定
[0071]
分别精密称取生品肉豆蔻、发酵肉豆蔻、肉豆蔻干燥品、麸煨肉豆蔻、面裹肉豆蔻(过2号筛)各20g，平行3份，按照2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样分析，计算肉豆蔻挥发油中4种有效成分的质量百分含量，结果见下表6。
[0072]
表6不同样品中有效成分含量测定/％(n＝3)
[0073][0074]
3.结论
[0075]
由上述可知，肉豆蔻经炮制后，其止泻成分甲基丁香酚和异丁香酚甲醚含量升高，毒性成分肉豆蔻醚含量降低，本发明方法炮制的肉豆蔻曲中三种成分的变化最显著，本发明采用水蒸气蒸馏法提取肉豆蔻挥发油，肉豆蔻生品、麸煨肉豆蔻、面裹煨肉豆蔻、肉豆蔻干燥品、肉豆蔻曲挥发油得率分别为9.2％、6.5％、6.0％、2.6％、2.5％。《中国药典》(2020版)第一部肉豆蔻项下规定，肉豆蔻生品含挥发油不得少于6.0％，麸煨肉豆蔻含挥发油不得少于4.0％，肉豆蔻生品及炮制品麸煨肉豆蔻挥发油含量均符合标准。试验发现，不同炮制方法均能降低肉豆蔻中挥发油含量，肉豆蔻干燥品及肉豆蔻曲挥发油含量显著低于生品及其他炮制品。
[0076]
实验表明，肉豆蔻经炮制后，甲基丁香酚和异丁香酚甲醚的含量均出现不同程度的升高，甲基丁香酚含量依次为肉豆蔻曲》麸煨肉豆蔻》面裹肉豆蔻》肉豆蔻干燥品》肉豆蔻生品，异丁香酚甲醚含量依次为肉豆蔻曲》面裹肉豆蔻》麸煨肉豆蔻》肉豆蔻干燥品》肉豆蔻生品。肉豆蔻醚属于一种弱单胺氧化酶抑制剂，具有致幻、抑制中枢神经系统作用，是肉豆蔻挥发油中的主要毒性成分，由实验结果可知，肉豆蔻含量依次为肉豆蔻生品》麸煨肉豆蔻》面裹肉豆蔻》肉豆蔻干燥品》肉豆蔻曲，与传统炮制方法麸煨肉豆蔻、面裹肉豆蔻相比，肉豆蔻干燥品及肉豆蔻曲中肉豆蔻醚含量下降更明显，且与肉豆蔻干燥品相比，肉豆蔻曲中的肉豆蔻醚含量更低。
[0077]
二、二神丸药物药效学评价
[0078]
1.材料
[0079]
1.1仪器
[0080]
恒温恒湿培养箱(上海一恒)；fa2104b电子天平(上海越平科学仪器(苏州)制造有限公司)；znhw型智能恒温电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)；tgl-16m型高速冷冻离心机(常州金坛良友仪器有限公司)；epoch2nsc-sn酶标仪(美国agilent公司)。
[0081]
1.2药物与试剂
[0082]
肉豆蔻(批号：211201，安徽惠丰国药有限公司)；补骨脂(批号：211001，安徽惠丰国药有限公司)；番泻叶(批号：皖20210456，安徽康和中药科技有限公司)；氢化可的松注射液(2106203，国药集团容生制药有限公司)；通用型组织固定液(批号：cr2208024，武汉赛维尔科技有限公司)；动物睾丸组织固定液(批号：cr2205040，武汉赛维尔科技有限公司)；氯化钠注射液(批号：c2220516b2，河南科伦药业有限公司)；胃动素(批号：202302)、胃泌素(批号：202302)、肾上腺酮(批号：202302)、促甲状腺激素(批号：202302)、睾酮(批号：202302)、肿瘤坏死因子α(批号：202302)、白细胞介素1β(批号：202302)酶联免疫检测试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司。
[0083]
1.3动物
[0084]
昆明种小鼠，雄性，体质量18～22g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证号scxk(京)2019-0008，实验单位使用许可证编号syxk(豫)2021-0015，饲养于相对湿度40％～65％，室温20～25℃的清洁级动物房。
[0085]
2.方法
[0086]
2.1方法
[0087]
2.1.1样品的制备
[0088]
2.1.1.1麸煨肉豆蔻的制备：取净肉豆蔻饮片、加入麦麸(每100kg肉豆蔻用麦麸40kg)同置锅内，文火加热并适当翻动(150～160℃)，至麦麸呈焦黄色，肉豆蔻呈深棕褐色，表面有裂隙时取出，筛去麦麸，放凉，即得。
[0089]
2.1.1.2肉豆蔻曲的制备：按实施例2所述方法制备肉豆蔻曲，即取过5号筛的肉豆蔻药粉80g、麦麸13g及面粉8g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为32℃，湿度为87％，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。
[0090]
2.1.1.3盐补骨脂的制备：取净补骨脂饮片，加食盐水(100kg补骨脂用食盐2kg)拌
匀，闷润4h，置铁锅中。文火加热，炒至表面黑色或黑褐色，微鼓起，气微香，味微咸时取出，放凉。
[0091]
2.1.1.4药物混悬液的制备
[0092]
二神丸混悬液的制备：将上述制备的麸煨肉豆蔻、肉豆蔻曲和盐补骨脂每两种按《中药大辞典(方剂分册)》中的质量比为2:1配比，粉碎成细粉，加蒸馏水均匀混合配制成0.24g
·
ml-1
的混悬液，备用。其中，盐补骨脂、麸煨肉豆蔻为“二神丸ⅰ组”；盐补骨脂、肉豆蔻曲为“二神丸ⅱ组”；盐补骨脂、肉豆蔻生品为“二神丸ⅲ组”。
[0093]
盐补骨脂混悬液的制备：取盐补骨脂适量，粉碎成细粉，加蒸馏水均匀混合配制成0.24g
·
ml-1
的混悬液，备用。
[0094]
肉豆蔻曲混悬液的制备：取肉豆蔻曲适量，粉碎成细粉，加蒸馏水均匀混合配制成0.24g
·
ml-1
的混悬液，备用。
[0095]
番泻叶水煎液的制备：取适量番泻叶，浸泡1h，加水煮沸30min，用两层纱布过滤，滤液减压浓缩成0.5g
·
ml-1
的药液，备用。
[0096]
2.1.2分组、造模及给药
[0097]
取70只雄性健康昆明种小鼠，适应性喂养3天，随机分为7组(正常组、模型组，“二神丸ⅰ组”、“二神丸ⅱ组”、“二神丸ⅲ组”、盐补骨脂组、肉豆蔻曲组)。除正常组外，各组小鼠每天按0.1ml
·
10g-1
体质量颈部皮下注射氢化可的松注射液，连续7d，致肾阳虚，从第8d开始，停止给予氢化可的松注射液，上午用番泻叶水煎液(0.2ml
·
10g-1
)连续灌胃至第17d，致脾阳虚。除正常组和模型组外，其余各给药组从第8d开始，每天下午灌胃给药，连续给药10天，各给药组分别按0.2ml
·
10g-1
体质量灌胃给药，正常组和模型组给予同等体积的生理盐水。
[0098]
2.1.3一般行为学观察
[0099]
每天观察记录小鼠的一般状态，如精神状态、活动状态、毛发及爪甲颜色、大便稀软程度等情况；每两天记录各组小鼠体质量情况；每日记录各组小鼠摄食量、饮水量情况。
[0100]
2.1.4脏器指数检测
[0101]
迅速摘取小鼠脾、胸腺、肾、睾丸、肾上腺等脏器，去除多余结缔组织，称定重量，计算脏器指数(脏器指数＝器官质量/体质量
×
100％)。
[0102]
2.1.5病理组织学检查
[0103]
将脾、肾、睾丸、肾上腺等脏器，用生理盐水冲洗，组织固定液固定，酒精逐级脱水，常规石蜡包埋，切片，以苏木精-伊红染色并在显微镜下观察。
[0104]
2.1.6生化指标测定
[0105]
小鼠摘眼球取血，将所取血液静置30min后，3000r/min离心10min，取上层血清，-80℃冰箱中保存待测。使用前，在4℃冰箱中解冻，按试剂盒说明书操作，用酶联免疫吸附测定(elisa)方法检测小鼠血清中胃动素(mtl)、胃泌素(gas)、肾上腺酮(cort)、促甲状腺激素(tsh)、睾酮(t)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-1β(il-1β)水平。
[0106]
2.1.7小肠推进率、胃残留率
[0107]
末次给药前禁食12h，自由饮水。末次给药后1h，灌胃炭末糊(5％活性炭)2ml/只。20min后摘眼球取血，剖腹，分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管，不加牵引平铺于白纸上，测其全长并记录碳末在小肠中移行的距离(幽门至炭末前沿)，求得推进率
(小肠推进率＝(碳末在小肠推进距离/小肠全长)
×
100％)；另从距贲门和幽门处离断并取出全胃，沿胃大弯侧剖开，分离胃内容物并用滤纸吸干称其重量，计算胃残留率(胃残留率＝(胃全-胃净)/灌胃量
×
100％)。
[0108]
2.1.8肠道菌群检测
[0109]
各组小鼠取完血后迅速开腹，取出肠组织，收集肠内容物，放入无菌冻存管，置于-80℃超低温冰箱保存，以待后续进行16s r dna测序。
[0110]
3.结果与讨论
[0111]
3.1一般行为学观察
[0112]
造模前，所有组小鼠精神状态良好，毛发洁白有光泽，粪便呈颗粒状。造模3d后，除正常组外，小鼠活动量减少，喜扎堆，毛色变暗发黄，大便稀软，皮下注射伤口结痂；7d后模型组小鼠体型逐渐消瘦，毛发枯糙，出现拱背卷曲、排水样便、肛周污秽等情况；给药后，各给药组小鼠的状况出现不同程度的好转。
[0113]
3.2体质量变化状况
[0114]
实验开始后，每两天记录各组小鼠体质量，结果如表7所示。正常组小鼠体质量逐步上升，造模至第7d，各组小鼠整体质量呈下降趋势，给药后，各给药组小鼠体质量呈不同增长趋势。
[0115]
表7各组小鼠平均体质量变化
[0116][0117]
注：与正常组比较ap《0.05bp《0.01；与模型组比较cp《0.05dp《0.01；与二神丸ⅰ组比较ep《0.05fp《0.01下表同。
[0118]
3.3脏器指数
[0119]
脾、肾、肾上腺、胸腺、睾丸是与脾肾阳虚泄泻模型相关的脏器，各组小鼠脏器指数测定结果见表8，模型组各脏器指数显著低于正常组，且均具有统计学意义(p《0.05)，说明
造模后各脏器发生了不同程度的病变；各给药组小鼠脏器指数较模型组出现不同程度升高，由表8结果可知，“二神丸ⅱ组”对脾肾阳虚泄泻小鼠脏器指数的干预效果优于其它给药组。
[0120]
表8各组小鼠脾、肾、肾上腺、胸腺、睾丸的脏器指数
[0121][0122]
3.4病理组织学检查
[0123]
正常组小鼠睾丸组织切片中曲细精管中细胞饱满，模型组组织层次减少，与正常组小鼠相比，脾脏切片白髓萎缩，红髓减少，可见炎性细胞浸润；肾脏组织中肾小球萎缩，肾曲小管上皮细胞肿胀，细胞间隙变大；肾上腺皮质细胞轻度增生，细胞间空泡增多。给药后，各组小鼠情况出现不同程度好转。实验结果如图2所示，睾丸以及肾组织明显恢复，且“二神丸ⅱ组”对脾肾阳虚泄泻小鼠脏器的恢复效果优于其他给药组。
[0124]
3.5血清生化指标的检测
[0125]
小鼠血清生化指标检测结果如下表9所示，与正常组相比，模型组小鼠胃肠激素相关血清指标gas水平下降、mtl水平上升；下丘脑-肾上腺轴相关指标cort水平、下丘脑-甲状腺轴相关指标tsh水平、下丘脑-性腺轴相关指标t水平均下降；炎症因子相关指标tnf-α、il-β水平均上升，各给药组给药后，血清各指标水平均有不同程度改善，“二神丸ⅰ组、ⅱ组”对血清相关指标的干预效果优于“二神丸ⅲ组”、盐补骨脂组、肉豆蔻曲组，且“二神丸ⅱ组”整体优于“二神丸ⅰ组”。
[0126]
表9各组小鼠血清相关指标检测
[0127]
[0128][0129]
3.6对小肠推进及胃排空的影响
[0130]
与正常组小鼠相比，模型组小鼠小肠推进率显著升高(p《0.01)，各给药组小鼠小肠推进率水平低于模型组，且“二神丸ⅰ组”和“二神丸ⅱ组”接近正常组水平，“二神丸ⅲ组”与盐补骨脂组显著低于正常组水平，肉豆蔻曲组无统计学意义。与正常组小鼠相比，模型组小鼠胃残留率明显降低(p《0.01)，与模型组小鼠相比，“二神丸ⅰ、ⅱ组”以及肉豆蔻曲组胃残留率显著升高(p《0.01)。实验结果见表10，说明“二神丸ⅰ组”和“二神丸ⅱ组”对脾肾阳虚泄泻模型小鼠胃肠功能的干预效果优于其他组，且“二神丸ⅱ组”效果更佳，“二神丸ⅲ组”与盐补骨脂组对小肠功能的干预作用更强，但其显著低于正常水平，可能引发胃肠道副作用。
[0131]
表10各组小鼠小肠推进率和胃残留率
[0132][0133]
3.7肠道菌群结果
[0134]
3.7.1各组小鼠肠道菌群otu聚类分析结果
[0135]
以97％的一致性将序列聚类成为otus，otu表示一组来源于某一相同分类单元的序列，otu数量越大说明微生物群落的多样性越大。结果见图3所示，七组小鼠(a：正常组b：二神丸ⅰ组c：神丸ⅱ组d：二神丸ⅲ组e：盐补骨脂组f：肉豆蔻曲组g：模型组，下同)肠道菌群检测共检出3083个otu，组间共有otu为45个，与正常组相比，模型组otu明显降低，与模型组相比，各给药组otu出现不同程度升高，说明脾肾阳虚泄泻模型会降低小鼠肠道菌群多样性，给药后物种多样性得到改善，“二神丸ⅱ组”对肠道菌群的改善作用优于“二神丸ⅰ组”。
[0136]
3.7.2各组小鼠肠道菌群物种组成差异分析
[0137]
结果如图4所示，在科水平上，正常组优势物种普雷沃菌科(prevotellaceae)和毛螺菌科(lachnospiraceae)分别占比23.70％、18.59％，模型组占比显著降低，给药后，“二神丸ⅰ组”、“二神丸ⅱ组”、“二神丸ⅲ组”、盐补骨脂组、肉豆蔻曲组在prevotellaceae水平上占比分别为9.66％、12.90％、13.87％、4.89％、4.93％，在lachnospiraceae水平上占比分别为9.80％、11.82％、0.85％、7.70％、8.47％，其中“二神丸ⅱ组”与“二神丸ⅰ组”提高二者物种相对丰度的程度相当；模型组在肠杆菌科(enterobacteriaceae)占比10.70％，正常组占比0.07％，给药治疗后，各组水平较模型组显著降低，占比分别为2.88％、3.36％、
13.99％、0.89％、4.66％，神丸ⅱ组”与“二神丸ⅰ组”下调趋势相当，盐补骨脂组效果最显著。
[0138]
在属水平上，模型组在拟杆菌属(bacteroides)占比较高，为32.86％，正常组占比为12.10％，给药后，“二神丸ⅰ组”、“二神丸ⅱ组”、“二神丸ⅲ组”、盐补骨脂组、肉豆蔻曲组占比分别为18.69％、17.85％、19.20％、21.47％、20.76％，埃希氏-志贺菌属(escherichia-shigella)在模型组中的相对丰度(10.69％)显著高于正常组(0.03％)，治疗后，各给药组占比分别为2.77％、0.31％、13.19％、0.51％、0.13％，“二神丸ⅱ组”与肉豆蔻曲组能显著下调escherichia-shigella相对丰度。
[0139]
3.结论
[0140]
本发明实验采用“氢化可的松+番泻叶”的复合造模法模拟脾肾阳虚泄泻模型，造模后，模型组小鼠活动量明显减少，毛发暗淡无光泽，饮食量减少，出现水样稀便，皮下注射伤口结痂且无法愈合，体质量下降，各脏器指数明显降低，胃肠激素相关血清指标gas水平下降、mtl水平上升，肾功能血清相关指标cort、tsh、t水平均显著降低，炎症因子血清相关指标tnf-α、il-1β水平明显升高，肠道菌群物种多样性降低，各类指标与正常组存在显著差异，表明造模成功。
[0141]
对各组小鼠血清胃动素(mtl)、胃泌素(gas)、肾上腺酮(cort)、促甲状腺激素(tsh)、睾酮(t)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素1β(il-1β)水平进行检测，验证“二神丸ⅰ、ⅱ、ⅲ组”以及盐补骨脂、肉豆蔻曲在治疗脾肾阳虚泄泻中的作用效果，结果显示各给药组对脾肾阳虚泄泻小鼠模型具有不同程度的改善，且“二神丸ⅱ组”效果最显著。
[0142]
肠道菌群是寄生在胃肠道内的众多微生物的统称，微生态平衡与健康息息相关。随着对肠道菌群的深入研究，中药通过调节微生态治疗腹泻性疾病的作用机制越来越明确。本发明证明肉豆蔻曲及盐补骨脂组成的二神丸可有效改善脾肾阳虚泄泻模型导致的菌群失调，降低致病菌bacteroides、escherichia-shigella、enterobacteriaceae丰度，增加有益菌prevotellaceae、lachnospiraceae丰度，发挥治疗作用。
[0143]
同时，本发明在对实施例2做上述实验的同时，还对实施例1、3、4也做了同样的实验，均取得了与实施例2相同和相近似的结果，这里不再一一列举，表明本发明方法可靠稳定，效果好。
[0144]
综上所述，本发明创新性地以肉豆蔻为发酵原料，采用自然发酵的方法炮制肉豆蔻制备肉豆蔻曲，制备的肉豆蔻曲中止泻成分甲基丁香酚和异丁香酚甲醚含量升高，毒性成分肉豆蔻醚含量降低，且肉豆蔻曲与盐补骨脂配伍使用制得的二神丸对脾肾阳虚泄泻的作用效果显著，降低了中毒的风险，为临床治疗脾肾阳虚泄泻药物提供了技术支持，是肉豆蔻炮制方法上的一大创新，社会和经济效益显著。

技术特征：
1. 一种肉豆蔻曲的炮制方法，其特征在于，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉75-85 g、麦麸10-15 g及面粉5-10 g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为30~35℃，湿度为85%~90%，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。2. 根据权利要求1所述的肉豆蔻曲的炮制方法，其特征在于，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉75 g、麦麸10 g及面粉5 g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为30℃，湿度为85%，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。3. 根据权利要求1所述的肉豆蔻曲的炮制方法，其特征在于，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉80 g、麦麸13 g及面粉8 g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为32℃，湿度为87%，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。4. 根据权利要求1所述的肉豆蔻曲的炮制方法，其特征在于，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉85 g、麦麸15 g及面粉10 g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为35℃，湿度为90%，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。5. 根据权利要求1所述的肉豆蔻曲的炮制方法，其特征在于，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉82 g、麦麸13 g及面粉6 g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为31℃，湿度为86%，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。6.权利要求1-5任一项所述方法制备的肉豆蔻曲在制备治疗脾肾阳虚泄泻药物中的应用。7.权利要求1-5任一项所述方法制备的肉豆蔻曲在制备二神丸药物中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的二神丸药物包括肉豆蔻曲和盐补骨脂，其中将盐补骨脂和肉豆蔻曲按质量比2:1混匀，粉碎成细粉，加蒸馏水均匀混合配制成0.24 g
·
ml-1
的混悬液，即得。

技术总结
一种肉豆蔻曲的炮制方法，包括以下步骤：取过5号筛的肉豆蔻药粉75-85 g、麦麸10-15 g及面粉5-10 g，在面粉中加蒸馏水并加热制成稀糊状，趁热与肉豆蔻药粉和麦麸揉和均匀，并捏成团，掷之即散为宜，然后捏制成方块，放入培养箱内发酵，其中培养箱内温度为30~35℃，湿度为85%~90%，致药材表面长满黄白色霉衣，发酵完成后，于50℃恒温干燥箱干燥24h，即得肉豆蔻曲。本发明采用自然发酵的方法炮制肉豆蔻制备肉豆蔻曲，肉豆蔻曲中止泻成分甲基丁香酚和异丁香酚甲醚含量升高，毒性成分肉豆蔻醚含量降低，且肉豆蔻曲与盐补骨脂配伍使用制得的二神丸对脾肾阳虚泄泻的作用效果显著，社会和经济效益显著。效益显著。效益显著。


技术研发人员：李凯 范蒙蒙 张雨 李红伟
受保护的技术使用者：河南中医药大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/28