辣椒素-他克林杂化物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及辣椒素-他克林杂化物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(ad)是一种复杂的多因素神经退行性疾病，会随着时间的推移而恶化，其发病机制未知，主要病理表现为β淀粉样蛋白(aβ)沉积、神经原纤维缠结(nft)、淀粉样斑块形成和tau蛋白异常表达。关于ad有很多假说，包括胆碱能假说和淀粉样变性假说。
3.胆碱能假说认为，ad患者的胆碱能丧失与认知能力下降之间存在密切关系，减少乙酰胆碱(ach)代谢有利于改善记忆和认知功能障碍。研究证实，大脑中乙酰胆碱酯酶活性的降低是由于乙酰胆碱酯酶(ache)和丁酰胆碱酯酶(buche或bche)的水解。其中，ache是主要的胆碱酯酶(che)，主要来自突触连接区和表达强活性的成年大脑皮层，而buche主要来自大脑的神经胶质细胞，调节局部ach水平。随着ad的进展，海马和颞叶皮层的buche活性增加，可以补偿ache活性的降低，在疾病的维持和进展中发挥关键作用。因此，ache和buche都被视为ad的药物靶点。目前，ad的临床治疗也主要集中在ach的缺乏。
4.另一个重要的假设表明，大脑中的aβ斑块在ad的发病机制中起着至关重要的作用。淀粉样蛋白前体蛋白(app)水解产生的aβ肽聚集成单体、低聚物和大的aβ斑，引发致病级联，最终导致神经元损失和痴呆。因此，aβ的产生和清除在ad的发病机制中至关重要。bace-1是一种蛋白酶，在各种神经元细胞类型中广泛表达，可产生所需的所有单体形式aβ。bace-1在ad脑和体液中的浓度和活性增加也支持bace-1对ad病理生理学起关键作用的假设。除了淀粉样蛋白生成途径外，bace-1还有其他底物，这些底物可能对突触可塑性和突触稳态很重要。此前，bace-1抑制剂化合物已进入临床开发和试验阶段，可有效降低人体中的aβ浓度。
5.由于ad的复杂性，不适合通过抑制单一潜在原因来控制ad的进展，更适合考虑同时调节多个靶点。因此，设计和合成多靶点配体(mtdl)，可以同时抑制多个靶点，预防或减缓疾病进展，作为治疗ad的有效策略是可行的。与药物组合相比，mtdl具有许多优点，可以通过低剂量协同作用提高治疗效果并减少副作用，从而实现更宽的治疗窗口。
6.辣椒素是一种酚类成分，已显示出神经保护作用。他克林是一种被批准用于治疗ad的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其低分子量适合于mtdl设计中的修饰。通过保持胆碱酯酶的抑制特性和降低肝脏毒性，其mtdl可能被开发为治疗ad的一种有前途的候选药物。
7.目前尚未见有辣椒素或其衍生物与他克林合成得到具有多靶点抑制活性的治疗ad的杂环化合物的相关报道。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题是提供一系列结构新颖且具有显著多靶点ache、buche和bace-1抑制活性的辣椒素-他克林杂化物及其制备方法和应用。
9.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
10.本发明所述的辣椒素-他克林杂化物为具有下述式6、式7或式8所示结构的化合物或其药学上可接受的盐：
[0011][0012]
其中，m＝6～8，n＝3～8。
[0013]
上述式6所示结构的辣椒素-他克林杂化物中，优选m＝6～8，n＝3～6；式7所示结构的辣椒素-他克林杂化物中，优选n＝3～8；式8所示结构的辣椒素-他克林杂化物中，优选n＝3～8。
[0014]
本发明所述辣椒素-他克林杂化物进一步优选如下：
[0015]
[0016][0017]
本发明中涉及的辣椒素-他克林杂化物在药学上可接受的盐，具体可以是上述式6、式7或式8所示结构化合物的盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、富马酸盐、水杨酸盐、苯磺酸盐、丙酮酸盐、乙酸盐、杏仁酸盐、碱性金属阳离子盐或铵阳离子盐。优选是其碱性金属阳离子盐。
[0018]
本发明所述辣椒素-他克林杂化物的制备方法，包括以下步骤：
[0019]
1)取下述式1所示结构的化合物分别与式9所示结构的辣椒素衍生物、二氢辣椒素或天然辣椒素置于第一有机溶剂中，在缚酸剂存在的条件下进行反应，分别得到式3、式4或式5所示结构的化合物；
[0020]
2)取下述式2所示结构的化合物分别与式3、式4或式5所示结构的化合物置于第二有机溶剂中，加入碱性试剂进行反应，得到式6、式7或式8所示结构的化合物；
[0021][0022]
上述制备方法的步骤1)中，式1所示结构的化合物与式9所示结构的辣椒素衍生物、二氢辣椒素或天然辣椒素的摩尔比为化学计量比。其中二氢辣椒素和天然辣椒素的结构分别如下所示：
[0023][0024]
上述制备方法的步骤1)中，所述缚酸剂的选择及其用量均为现有技术中的常规选择。在本技术中，缚酸剂优选为选自三乙胺、n,n-二异丙基乙胺(diea)、吡啶、醋酸钠、碳酸钠和碳酸钾等中的一种或两种以上的组合。对于缚酸剂的用量，则优选为式9所示结构的辣椒素衍生物、二氢辣椒素或天然辣椒素摩尔量的1～2倍。
[0025]
上述制备方法的步骤1)中，反应可以在加热或不加热的条件下进行，通过薄层层析跟踪检测反应是否完全。在加热条件下更有利于反应的进行，进一步优选反应在大于或等于50℃条件下进行，更优选反应在65℃至溶剂沸点之间的温度下进行。
[0026]
上述制备方法的步骤2)中，式2所示结构的化合物与式3、式4或式5所示结构的化合物的摩尔比为化学计量比。该步骤中涉及的碱性试剂为现有技术中的常规选择，更优选为氢化钠或氢化钾，或者是它们的组合物。所述碱性试剂的用量优选为式3、式4或式5所示结构的化合物摩尔量的1～2倍。该步骤中，反应可以在加热或不加热的条件下进行，通过薄层层析跟踪检测反应是否完全。当选用的碱性试剂为氢化钠或氢化钾时，反应优选是在常温或冰浴条件下进行。
[0027]
本发明所述制备方法中，涉及的第一有机溶剂和第二有机溶剂均是指有机溶剂，“第一”和“第二”仅是为了区别在步骤1)和步骤2)中使用的不同有机溶剂而已。具体的，在步骤1)中，所述的第一有机溶剂优选为选自1,2-二氯乙烷(dce)、甲苯和乙腈中的一种或两种以上的组合；进一步优选为乙腈。在步骤2)中，所述的第二有机溶剂优选为n,n-二甲基甲酰胺(dmf)或二甲基亚砜(dmso)，或者是它们的组合物；进一步优选为n,n-二甲基甲酰胺。所述第一有机溶剂或第二有机溶剂的用量根据需要进行确定，以能够充分溶解相应步骤中参加反应的原料为宜。
[0028]
上述方法制备得到的是式6、式7或式8所示结构目标化合物的粗产物，因此，本发明所述方法还包括对制得的目标化合物粗品进行纯化的步骤。具体的，可以采用现有常规
的纯化方法对其进行纯化以提高各目标化合物的纯度，如采用硅胶柱层析的方式对粗产物进行纯化。更优选是将反应所得的物料先萃取后再进行硅胶柱层析，以减少硅胶柱的负担。其中，柱层析时用于洗脱的洗脱剂优选为由二氯甲烷与甲醇组成的混合溶剂。所述的混合溶剂中，二氯甲烷与甲醇的体积比优选为20：1～10：1。如果涉及萃取，萃取剂通常为二氯甲烷(dcm)或乙酸乙酯(ea)等常规萃取剂。
[0029]
为了提高目标化合物的产率，优选是对步骤1)制得的中间产物进行纯化后再进行下一步骤。纯化的操作通常是采用硅胶柱层析，更优选是将反应所得的物料先萃取后再进行硅胶柱层析。其中，柱层析时，用于洗脱的洗脱剂优选为石油醚与乙酸乙酯按1：1的体积比组成的混合溶剂。如果涉及萃取，萃取剂通常为二氯甲烷或乙酸乙酯等常规萃取剂。
[0030]
申请人通过实验发现，本发明所述辣椒素-他克林杂化物具有良好的抗胆碱酯酶活性、抗bace-1活性和神经保护作用，基于此，本发明还包括上述辣椒素-他克林杂化物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防阿尔茨海默病的药物中的应用；进一步的，本发明还包括上述辣椒素-他克林杂化物或其药学上可接受的盐在制备胆碱酯酶抑制剂，或者是在制备bace-1抑制剂，或者是在制备神经保护剂中的应用。
[0031]
更进一步的，本发明还包括一种药物组合物，其包括作为活性成分的治疗上有效剂量的权利要求1所述辣椒素-他克林杂化物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的载体。
[0032]
与现有技术相比，本发明提供了一系列结构新颖的辣椒素-他克林杂化物及它们的制备方法。申请人的试验结果表明，本发明提供的辣椒素-他克林杂化物具有良好的抗胆碱酯酶活性、抗bace-1活性和神经保护作用，有望用于治疗神经退行性疾病特别是阿尔茨海默病，具有很好的潜在药用价值。
附图说明
[0033]
图1为使用pampa-bbb测定的商业药物的实验渗透性和报告渗透性之间的线性相关性曲线。
[0034]
图2为通过cck-8方法用不同浓度的化合物7e或多奈哌齐测定pc12细胞(a)和bv2细胞(b)的活力结果柱状图，其中，(a)为pc12细胞，(b)为bv2细胞。
[0035]
图3为14天内口服不同剂量的化合物7e的小鼠的体重曲线。
[0036]
图4为暴露于0和2500mg/kg剂量化合物7e的小鼠的心脏、肝脏、肺、肾脏和大脑的he染色图像。比例尺：200μm。
[0037]
图5为化合物7e的降压被动回避实验中低血压测试中的潜伏期和错误次数，其中，(a)为潜伏期，(b)为错误次数。
具体实施方式
[0038]
为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0039]
实施例1
[0040]
步骤1：化合物3a，3b，3c，3d，3e，3f，3g，3h的制备
[0041][0042]
3a：m＝6，n＝3
[0043]
3b：m＝6，n＝4
[0044]
3c：m＝6，n＝5
[0045]
3d：m＝6，n＝6
[0046]
3e：m＝7，n＝3
[0047]
3f：m＝7，n＝4
[0048]
3g：m＝8，n＝4
[0049]
3h：m＝8，n＝6
[0050]
取式9所示结构的辣椒素衍生物(0.5mmol,1.0当量)溶于ch3cn(3ml)中，向其中加入式1所示结构的化合物(0.5mmol,1.0当量)，再加入k2co3(0.65mmol,1.3当量)升温至70℃回流反应6小时。反应完成后，混合物用dcm(3
×
30ml)萃取，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱纯化(展开剂：pe/ea，1/1，体积比)，分别得到相应的化合物3a，3b，3c，3d，3e，3f，3g，3h。
[0051]
步骤2：化合物6a，6b，6c，6d，6e，6f，6g，6h的制备
[0052][0053]
6a：m＝6，n＝3
[0054]
6b：m＝6，n＝4
[0055]
6c：m＝6，n＝5
[0056]
6d：m＝6，n＝6
[0057]
6e：m＝7，n＝3
[0058]
6f：m＝7，n＝4
[0059]
6g：m＝8，n＝4
[0060]
6h：m＝8，n＝6
[0061]
取化合物3a,3b,3c,3d，3e，3f，3g或3h(0.45mmol，1.0当量)溶于dmf(5ml)中，向其中加入式2所示结构的化合物，再加入氢化钠(0.9mmol，2.0当量)，室温下搅拌反应3小时，反应混合物用ea(3
×
30ml)萃取，再用h2o(3
×
30ml)洗涤，合并的有机相先用饱和食盐水洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱法纯化(展开剂：dcm/meoh，15/1，体积比)，得到相应的目标化合物6a,6b,6c,6d，6e，6f，6g，6h。具体表征如下：
[0062]
[0063]
化合物n-(3-甲氧基-4-(3-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)丙氧基)苄基)庚酰胺(6a)：收率37％；黄色固体；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.46(d,j＝8.5hz,1h),8.18(d,j＝8.6hz,1h),7.67(t,j＝7.7hz,1h),7.45
–
7.40(t,1h),6.76(s,1h),6.72(d,j＝8.2hz,1h),6.66(d,j＝8.1hz,1h),4.37(d,j＝6.0hz,2h),4.19(m,j＝5.5hz,2h),4.16(t,j＝5.4hz,2h),3.66(s,3h),3.23
–
3.19(t,2h),2.63(t,j＝6.1hz,2h),2.30(m,j＝9.4,6.0hz,4h),1.83(m,j＝12.8,7.0hz,4h),1.67(m,j＝7.6hz,2h),1.30
–
1.27(m,6h),0.87(m,j＝2.3hz,3h).
13
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+
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[0064][0065]
化合物n-(3-甲氧基-4-(4-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)丁氧基)苄基)庚酰胺(6b)：收率29％；黄色固体；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.38(m,j＝15.7,8.7hz,1h),8.25(m,j＝8.7,4.5hz,1h),7.63(m,j＝7.6,7.2hz,1h),7.37(t,j＝7.9hz,1h),6.82(s,1h),6.77(s,1h),6.69(d,j＝7.7hz,1h),6.62(t,j＝8.2hz,1h),4.34(t,j＝5.1hz,2h),4.06(t,j＝6.7hz,2h),4.01(m,j＝6.4,5.8hz,2h),3.67(s,3h),3.16(m,j＝11.6,5.7hz,2h),2.61(t,j＝6.0hz,2h),2.27(t,j＝7.6hz,2h),2.02(m,j＝6.7hz,2h),1.91(m,j＝6.2hz,2h),1.80(m,j＝12.9,7.2,6.6hz,4h),1.63(m,j＝7.7hz,2h),1.31
–
1.25(m,6h),0.85
–
0.83(m,3h).
13
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518.3377,found 514.3438.
[0066][0067]
化合物n-(3-甲氧基-4-((5-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)戊基)氧基)苄基)庚酰胺(6c)：收率36％；黄色固体；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.46(t,j＝9.1hz,1h),8.18(d,j＝8.8,2.9hz,1h),7.69
–
7.64(m,1h),7.41(m,1h),6.80(t,j＝2.6hz,1h),6.73(m,1h),6.62(m,j＝8.2,2.6hz,1h),6.46(d,j＝18.1hz,1h),6.00(d,j＝56.2hz,1h),4.36(m,j＝5.8,3.2hz,2h),3.98(t,2h),3.93(m,j＝5.7hz,2h),3.76(s,j＝3.1hz,3h),3.19(m,j＝6.6hz,2h),2.57(t,j＝6.2hz,2h),2.25(m,j＝7.6,1.9hz,2h),1.93(m,j＝7.4hz,2h),1.85(m,2h),1.81
–
1.78(m,2h),1.68
–
1.64(m,4h),1.30
–
1.26(m,8h),0.86(m,j＝3.4hz,3h).
13
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36.94,32.06,31.73,30.68,29.84,29.15,28.51,28.43,25.97,23.19,22.83,22.66,21.96,20.72,14.19.hrms:calcd for c
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[0068][0069]
化合物n-(3-甲氧基-4-((6-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)己基)氧基)苄基)庚酰胺(6d)：收率41％；黄色固体；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.36(m,j＝8.3,5.0hz,1h),8.23(d,j＝8.7hz,1h),7.63
–
7.58(m,1h),7.38(m,1h),6.77(d,j＝2.1hz,1h),6.72(m,j＝8.2,1.9hz,1h),6.70
–
6.66(s,1h),6.64(d,j＝8.2hz,1h),4.32(d,j＝5.9hz,2h),3.92(t,j＝7.3hz,2h),3.87(t,j＝6.5hz,2h),3.71(s,3h),3.13(t,j＝6.3hz,2h),2.61(t,j＝6.2hz,2h),2.23(t,j＝7.6hz,2h),1.88
–
1.81(m,4h),1.77(m,j＝12.1,6.0hz,4h),1.60(m,j＝7.6hz,2h),1.48(m,j＝7.4,6.9hz,4h),1.31
–
1.22(m,6h),0.82(t,j＝6.7hz,3h).
13
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[0070][0071]
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–
4.12(m,4h),3.66(s,3h),3.19(m,j＝6.7hz,2h),2.64(t,j＝6.1hz,2h),2.30(t,j＝7.5hz,4h),1.86
–
1.78(m,4h),1.67(m,j＝7.5hz,2h),1.35
–
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13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ173.70,156.59,149.29,146.70,138.89,133.27,132.34,125.15,120.92,119.79,116.23,113.50,111.70,111.32,55.67,43.04,36.86,32.05,31.85,30.38,29.83,29.78,29.46,29.23,28.39,26.06,23.91,22.82,22.75,22.11,20.83,14.22.hrms:calcd for c
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收率43％；黄色固体；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.45
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n3o3[m+h]
+
532.3534,found 532.3588.
[0074][0075]
n-(3-甲氧基-4-(4-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)丁氧基)苄基)壬酰胺(6g)：收率34％；黄色固体；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.40(d,j＝8.5hz,1h),8.24(d,j＝8.7hz,1h),7.63(t,j＝7.7hz,1h),7.38(t,j＝8.6,7.0hz,1h),6.78(s,j＝2.0hz,1h),6.71(d,j＝6.3hz,1h),6.64(d,j＝8.1hz,1h),4.35(d,j＝5.9hz,2h),4.07(t,j＝6.6hz,2h),4.02(t,j＝5.6hz,2h),3.67(s,3h),3.17(t,j＝6.2hz,2h),2.61(t,j＝6.1hz,2h),2.27(t,j＝7.6hz,2h),2.02(m,j＝6.7hz,2h),1.92(m,j＝6.1hz,2h),1.84
–
1.77(m,4h),1.66
–
1.62(m,2h),1.34
–
1.24(m,10h),0.85(t,j＝6.9hz,3h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ173.61,155.82,151.35,149.21,146.87,138.80,132.27,132.23,125.23,124.21,120.89,119.85,116.16,112.69,111.25,68.71,55.75,47.54,43.11,36.85,32.02,31.93,29.80,29.49 29.29,28.50,27.96,26.02,25.79,24.11,22.75,22.08,20.75,14.21.hrms:calcd for c
34h47
n3o3[m+h]
+
546.3690,found 546.3751.
[0076][0077]
n-(3-甲氧基-4-((6-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)己基)氧基)苄基)壬酰胺(6h)：收率42％；黄色固体；1h nmr(600mhz,chloroform-d)δ8.37(m,j＝8.5,3.6hz,1h),8.22(d,j＝8.7,2.6hz,1h),7.61(m,j＝8.2,4.7hz,1h),7.39(t,j＝8.4,4.3hz,1h),6.77(s,j＝2.0hz,1h),6.73(d,j＝7.9,2.8hz,1h),6.66(m,j＝8.6,3.5hz,1h),6.58(s,1h),4.33(t,j＝6.0,3.1hz,2h),3.90(m,j＝17.1,6.6hz,4h),3.72(s,j＝2.2hz,3h),3.13(m,j＝6.2hz,2h),2.63
–
2.58(t,2h),2.23(t,j＝7.7hz,2h),1.84(m,j＝13.4,5.9hz,4h),1.81
–
1.74(m,4h),1.64
–
1.59(m,2h),1.49(s,j＝6.2hz,4h),1.32
–
1.22(m,10h),0.84(m,j＝7.1,3.6hz,3h).
13
c nmr(150mhz,chloroform-d)δ173.39,155.59,151.53,149.54,147.65,139.09,132.37,131.84,125.22,124.39,121.16,120.03,115.94,113.10,111.64,110.87,68.77,55.98,48.41,43.26,36.91,31.93,30.92,29.81,29.48,29.29,28.96,
28.45,26.19,25.99,25.56,23.78,22.76,21.98,20.75,14.22.hrms:calcd for c
36h51
n3o3[m+h]
+
574.4003,found 574.4060.
[0078]
实施例2：化合物6a、6b的制备
[0079]
化合物6a：重复实施例1，不同的是，步骤2按下述操作进行：
[0080]
取化合物3a(0.45mmol，1.0当量)溶于dmso(5ml)中，向其中加入式2所示结构的化合物，再加入氢化钾(0.9mmol，2.0当量)，于室温下反应至完全，反应混合物用ea(3
×
30ml)萃取，再用h2o(3
×
30ml)洗涤，合并的有机相先用饱和食盐水洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱法纯化(展开剂：dcm/meoh，15/1，体积比)，得到黄色固体，收率为30％。经核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱表征，确定为化合物6a。
[0081]
化合物6b：重复实施例1，不同的是，步骤2按下述操作进行：
[0082]
取化合物3b(0.45mmol，1.0当量)溶于dmso(5ml)中，向其中加入式2所示结构的化合物，再加入氢化钾(0.9mmol，2.0当量)，于室温下反应至完全，反应混合物用ea(3
×
30ml)萃取，再用h2o(3
×
30ml)洗涤，合并的有机相先用饱和食盐水洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱法纯化(展开剂：dcm/meoh，15/1，体积比)，得到黄色固体，收率为39％。经核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱表征，确定为化合物6b。
[0083]
实施例3：化合物7a，7b，7c，7d，7e，7f的制备
[0084]
步骤1：取二氢辣椒素(0.5mmol,1.0当量)溶于ch3cn(3ml)中，向其中加入式1所示结构的化合物(0.5mmol,1.0当量)，再加入k2co3(0.65mmol,1.3当量)加热至70℃回流反应6小时。反应完成后，混合物用dcm(3
×
30ml)萃取，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱纯化(展开剂：pe/ea，1/1，体积比)，分别得到相应的化合物4a，4b，4c，4d，4e，4f。
[0085]
步骤2：取化合物4a，4b，4c，4d，4e或4f(0.45mmol，1.0当量)溶于dmf(5ml)中，向其中加入式2所示结构的化合物，再加入氢化钠(0.9mmol，2.0当量)，室温下搅拌反应3小时，反应混合物用ea(3
×
30ml)萃取，再用h2o(3
×
30ml)洗涤，合并的有机相先用饱和食盐水洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱法纯化(展开剂：dcm/meoh，15/1，体积比)，得到相应的目标化合物7a，7b，7c，7d，7e，7f。具体表征如下：
[0086][0087]
n-(3-甲氧基-4-(3-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)丙氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺(7a)：收率35％；黄色固体；1h nmr(600mhz,chloroform-d)δ8.48(d,j＝8.5hz,1h),8.16(d,j＝8.6hz,1h),7.69(t,j＝7.9hz,1h),7.43(t,j＝8.4hz,1h),6.77(d,j＝1.9hz,1h),6.74(d,j＝10.0hz,1h),6.68(d,j＝8.1hz,1h),6.62(t,j＝6.1hz,1h),6.50(s,1h),4.38(d,j＝6.0hz,2h),4.18(m,j＝10.7,5.5hz,4h),3.67(s,3h),3.23(t,j＝6.1hz,2h),2.62(t,j＝6.0hz,2h),2.49(m,j＝15.6,7.5hz,1h),2.29(m,j＝9.7,5.4hz,4h),1.86
–
1.82(m,4h),1.68(m,j＝7.5hz,2h),1.51
–
1.47(m,2h),1.34(m,j＝8.1hz,2h),1.14(m,j＝7.0hz,4h),0.85(d,j＝6.6hz,6h).
13
c nmr(150mhz,chloroform-d)δ173.63,156.50,151.70,149.32,146.71,138.99,133.30,132.39,125.17,124.36,121.15,119.83,116.24,113.57,
111.69,111.34,68.45,55.68,47.98,43.08,39.11,36.89,32.06,30.40,29.84,29.57,28.41,28.09,27.41,26.06,22.78,22.12,20.84,14.27.hrms:calcd for c
34h47
n3o3[m+h]
+
546.3690,found 546.3748.
[0088][0089]
n-(3-甲氧基-4-(4-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)丁氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺(7b)：收率42％；黄色固体；1h nmr(600mhz,chloroform-d))δ8.48(d,j＝8.6hz,1h),8.19(d,j＝8.7hz,1h),7.68(t,j＝7.7hz,1h),7.41(t,j＝7.8hz,1h),6.78(s,1h),6.75(d,j＝8.2hz,1h),6.69(d,j＝8.1hz,1h),6.41(s,1h),4.38(d,j＝5.9hz,2h),4.06(t,j＝5.6hz,4h),3.69(s,3h),3.25(t,j＝6.0hz,2h),2.59(t,j＝5.9hz,2h),2.27(t,j＝7.6hz,2h),2.01(m,j＝6.6hz,2h),1.96
–
1.93(m,2h),1.85(m,j＝6.3,5.4hz,6h),1.68
–
1.65(m,2h),1.51
–
1.48(m,1h),1.36
–
1.31(m,4h),1.14(t,j＝7.2hz,2h),0.84(d,j＝6.7hz,6h).
13
c nmr(150mhz,chloroform-d)δ173.56,155.82,151.45,149.21,146.86,138.80,132.30,125.30,124.13,121.01,119.87,116.14,112.66,111.24,111.04,68.75,55.75,47.58,43.12,39.08,36.88,32.04,29.82,29.54,28.49,28.06,27.38,26.03,25.71,24.04,22.76,22.07,20.74,14.25.hrms:calcd for c
35h49
n3o3[m+h]
+
560.3847,found 560.3903.
[0090][0091]
n-(3-甲氧基-4-((5-((1,22,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)戊基)氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺(7c)：收率39％；黄色固体；1h nmr(600mhz,chloroform-d)δ8.41(d,j＝8.5hz,1h),8.16(d,j＝8.8,1.1hz,1h),7.65(m,j＝8.3,6.9,1.2hz,1h),7.40(m,j＝8.4,6.9,1.2hz,1h),6.80(d,j＝2.0hz,1h),6.74(m,j＝8.2,2.0hz,1h),6.64(d,j＝8.2hz,1h),6.40(t,j＝4.8hz,1h),4.36(d,j＝5.8hz,2h),3.94(t,j＝6.4hz,4h),3.77(s,3h),3.18(t,j＝6.2hz,2h),2.58(t,j＝6.3hz,2h),2.25(t,j＝7.6hz,2h),1.93
–
1.89(m,2h),1.88
–
1.83(m,4h),1.82
–
1.78(m,2h),1.67
–
1.63(m,4h),1.50
–
1.46(m,1h),1.31(m,j＝7.4hz,2h),1.28
–
1.25(m,4h),1.13(m,j＝10.3,4.6hz,2h),0.84(d,j＝6.6hz,6h).
13
c nmr(150mhz,chloroform-d)δ173.40,149.53,147.51,132.31,132.11,125.25,124.11,121.72,120.11,116.14,113.12,111.69,111.19,68.78,56.02,48.57,43.27,39.09,36.95,32.06,30.74,29.84,29.81,29.54,28.67,28.54,28.08,27.40,26.01,23.69,23.22,22.77,22.01,20.84,14.26.hrms:calcd for c
36h51
n3o3[m+h]
+
574.4003,found 574.4063.
[0092][0093]
n-(3-甲氧基-4-((6-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)己基)氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺(7d)：收率34％；黄色固体；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.31(d,j＝8.7hz,1h),8.20(t,j＝6.0hz,1h),7.81
–
7.75(m,2h),7.50(m,j＝6.6hz,1h),6.79(m,j＝5.2,3.1hz,2h),6.67(d,j＝8.2,2.0hz,1h),4.12(d,j＝5.9hz,2h),3.83(m,j＝6.5hz,2h),3.75(m,j＝7.0hz,2h),3.65(s,3h),2.93(m,j＝5.6hz,2h),2.62(m,j＝5.8hz,2h),2.06(t,j＝7.4hz,2h),1.78(m,j＝3.3hz,4h),1.68(m,j＝7.2hz,2h),1.63(m,j＝6.9hz,2h),1.44(m,j＝13.2,6.4hz,7h),1.35(m,j＝13.7,6.9hz,6h),1.07(t,j＝6.9hz,2h),0.79(d,j＝6.7hz,6h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ173.39,155.37,151.85,149.53,147.66,139.46,132.20,131.78,125.15,124.32,121.49,120.04,116.13,113.07,111.63,111.09,68.76,55.98,48.46,43.28,39.07,36.92,30.97,29.79,29.51,28.96,28.69,28.05,27.37,26.22,26.00,25.57,23.82,22.75,22.03,20.84,14.24.hrms:calcd for c
37h53
n3o3[m+h]
+
588.4160,foun588.4202.
[0094][0095]
n-(3-甲氧基-4-((7-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)庚基)氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺(7e)：收率45％；黄色固体；1h nmr(600mhz,chloroform-d)δ8.04
–
7.97(m,2h),7.57(t,j＝8.3,6.8,1.3hz,1h),7.35(t,j＝8.3,6.7,1.3hz,1h),6.83
–
6.75(d,3h),5.84(s,1h),4.36(d,j＝5.7hz,2h),3.97(t,j＝6.7hz,2h),3.82(s,3h),3.58(t,j＝7.2hz,2h),3.12
–
3.07(t,2h),2.67(t,j＝5.5hz,2h),2.20(t,j＝7.6hz,2h),1.91(m,j＝4.9hz,4h),1.82(m,j＝7.4hz,2h),1.72
–
1.68(m,2h),1.66
–
1.62(m,2h),1.49(m,j＝13.6,6.8hz,3h),1.45
–
1.40(m,4h),1.33
–
1.29(m,4h),1.13(m,j＝8.8,5.6hz,2h),0.85(d,j＝6.6hz,6h).
13
c nmr(150mhz,chloroform-d)δ173.33,155.48,151.66,149.57,147.78,139.21,132.38,131.63,125.23,124.34,121.30,120.09,115.95,113.08,111.65,110.88,69.06,56.04,48.58,43.34,39.07,36.94,31.03,29.78,29.50,28.98,28.80,28.52,28.05,27.37,26.51,25.98,23.75,22.75,22.00,20.78,14.25.hrms:calcd for c
38h55
n3o3[m+h]
+
602.4316,found 602.4368.
[0096][0097]
n-(3-甲氧基-4-((8-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)辛基)氧基)苄基)-8-甲基壬酰胺(7f)：收率38％；黄色固体；1h nmr(600mhz,chloroform-d)δ8.51(t,j＝9.4hz,1h),8.20
–
8.16(d,1h),7.67(t,j＝7.9hz,1h),7.43(t,j＝8.4,6.9,1.2hz,1h),6.81
–
6.74(m,
3h),4.36(d,j＝5.8hz,2h),3.95(t,j＝6.7hz,2h),3.91(t,j＝7.2hz,2h),3.81(s,3h),3.27(t,j＝6.3hz,2h),2.59(t,j＝6.3hz,2h),2.21(t,j＝7.6hz,2h),1.91(m,j＝6.2,2.5hz,2h),1.82(m,j＝14.7,7.5hz,6h),1.64(m,j＝8.6,6.6hz,2h),1.49(m,j＝13.4,6.7hz,2h),1.47
–
1.43(m,4h),1.40
–
1.36(m,5h),1.33
–
1.29(m,4h),1.13(m,j＝7.2hz,2h),0.84(d,j＝6.6hz,6h).
13
c nmr(150mhz,chloroform-d)δ173.29,155.44,151.66,149.56,147.84,139.29,132.28,131.46,125.16,124.36,121.30,120.09,116.01,113.02,111.65,110.95,69.07,56.05,48.64,43.36,39.05,36.93,31.16,29.76,29.48,29.19,29.14,29.08,28.62,28.04,27.35,26.64,25.96,23.83,22.74,22.04,20.82,14.23.hrms:calcd for c
39h57
n3o3[m+h]
+
616.4473,found 616.4531.
[0098]
实施例4：化合物7a的制备
[0099]
步骤1：取二氢辣椒素(0.5mmol,1.0当量)溶于甲苯(3ml)中，向其中加入式1所示结构的化合物(0.5mmol,1.0当量)，再加入氢化钾(0.65mmol,1.3当量)在室温下反应直至反应完全。反应完成后，混合物用dcm(3
×
30ml)萃取，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱纯化(展开剂：pe/etoac，1/1，体积比)，得到化合物4a。
[0100]
步骤2：取化合物4a(0.45mmol，1.0当量)溶于dmf(5ml)中，向其中加入式2所示结构的化合物，再加入氢化钾(0.9mmol，2.0当量)，室温下反应直至反应完全，反应混合物用ea(3
×
30ml)萃取，再用h2o(3
×
30ml)洗涤，合并的有机相先用饱和食盐水洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱法纯化(展开剂：dcm/meoh，15/1，体积比)，得到黄色固体，收率为27％。经核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱表征，确定为目标化合物7a。
[0101]
实施例5：化合物8a，8b，8c，8d，8e，8f的制备
[0102]
步骤1：取天然辣椒素(0.5mmol,1.0当量)溶于ch3cn(3ml)中，向其中加入式1所示结构的化合物(0.5mmol,1.0当量)，再加入k2co3(0.65mmol,1.3当量)并加热至70℃回流反应6小时。反应完成后，混合物用dcm(3
×
30ml)萃取，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱纯化(展开剂：pe/ea，1/1，体积比)，分别得到相应的化合物5a，5b，5c，5d，5e，5f。
[0103]
步骤2：取化合物5a，5b，5c，5d，5e或5f(0.45mmol，1.0当量)溶于dmf(5ml)中，向其中加入式2所示结构的化合物，再加入氢化钠(0.9mmol，2.0当量)，室温下搅拌反应3小时，反应混合物用ea(3
×
30ml)萃取，再用h2o(3
×
30ml)洗涤，合并的有机相先用饱和食盐水洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱法纯化(展开剂：dcm/meoh，15/1，体积比)，得到相应的目标化合物8a，8b，8c，8d，8e，8f。具体表征如下：
[0104][0105]
(e)-n-(3-甲氧基-4-(3-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)丙氧基)苄基)-8-甲基壬-6-烯酰胺(8a)：收率32％；黄色固体；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.37(d,j＝8.5hz,1h),8.13(d,j＝8.7hz,1h),7.68(t,j＝7.7hz,1h),7.42(t,j＝7.9hz,1h),6.78(s,j＝1.9hz,
1h),6.75(d,j＝8.2,2.0hz,1h),6.71(d,j＝8.1hz,1h),5.38
–
5.31(m,2h),4.38(d,j＝5.9hz,2h),4.18(t,j＝5.4hz,2h),4.14(t,j＝5.7hz,2h),3.68(s,3h),3.41(t,j＝6.79hz,1h),3.20(t,j＝6.3hz,2h),2.63(t,j＝5.8hz,2h),2.34(m,j＝7.4hz,2h),2.29
–
2.25(m,3h),2.20(m,j＝6.6hz,2h),2.00(m,j＝7.2hz,2h),1.87(m,j＝14.57,7.19hz,4h),1.67(m,j＝2.6hz,2h),0.95(d,j＝6.7hz,6h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ173.46,149.40,146.78,138.17,133.28,132.34,129.89,126.70,125.16,124.29,119.90,116.38,113.69,111.88,111.38,68.63,55.70,48.11,43.14,36.74,32.45,32.06,31.11,30.41,29.84,29.48,28.54,25.51,23.81,22.80,22.13,20.91,14.26.hrms:calcd for c
34h45
n3o3[m+h]
+
544.3534,found544.3594.
[0106][0107]
(e)-n-(3-甲氧基-4-(4-(((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)丁氧基)苄基)-8-甲基壬-6-烯酰胺(8b)：收率40％；黄色固体；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.27(t,j＝6.0hz,1h),7.87(d,j＝8.4hz,1h),7.81(t,j＝7.7hz,1h),7.48(t,j＝7.8hz,1h),6.86
–
6.79(m,2h),6.70(d,j＝8.2,2.0hz,1h),5.33(m,j＝15.5,7.5hz,2h),4.16(d,j＝5.9hz,2h),3.93(t,j＝6.1hz,2h),3.88(m,j＝6.9hz,2h),3.64(s,3h),2.97(t,j＝5.4hz,2h),2.64(t,j＝5.4hz,2h),2.19(m,j＝12.8,6.5hz,1h),2.11(t,j＝7.3hz,2h),1.93(m,j＝7.0hz,2h),1.86(m,j＝7.2hz,2h),1.80(s,j＝3.7hz,4h),1.76(m,j＝13.8,7.0hz,2h),1.50(m,j＝7.6hz,2h),1.31
–
1.27(m,2h),0.90(d,6h).
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ172.02,148.81,146.72,137.36,132.43,126.62,124.84,119.15,112.93,111.26,79.23,79.01,78.78,70.02,67.86,55.34,47.03,42.04,40.06,35.24,31.70,31.31,30.39,29.04,28.70,26.75,25.94,24.93,24.05,22.55,22.12,21.59,20.55,13.93.hrms:calcd for c
35h47
n3o3[m+h]
+
558.3690,found 558.3749.
[0108][0109]
(e)-n-(3-甲氧基-4-((5-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)戊基)氧基)苄基)-8-甲基壬-6-烯酰胺(8c)：收率31％；黄色固体；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.22(t,j＝6.0hz,1h),7.82(d,j＝8.8hz,1h),7.78(t,j＝7.6hz,1h),7.50(t,j＝7.7hz,1h),6.80
–
6.75(m,2h),6.66(d,j＝8.3,2.0hz,1h),5.29(m,j＝20.4,13.9,6.2hz,2h),4.12(d,j＝5.9hz,2h),3.84(t,j＝6.3hz,2h),3.80(m,j＝6.9hz,2h),3.64(s,3h),2.93(t,j＝5.6hz,2h),2.62(t,j＝5.7hz,2h),2.17
–
2.13(m,1h),2.07(t,j＝7.3hz,2h),1.88(m,j＝7.0hz,2h),1.78(m,j＝3.6,3.1hz,4h),1.72(m,j＝7.5hz,2h),1.66(m,j＝6.7hz,2h),1.45(m,j＝12.4,6.6hz,4h),1.24(m,j＝7.5hz,2h),0.87(d,j＝6.7hz,6h).
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ209.72,186.55,184.58,175.04,170.06,164.29,162.58,156.88,150.71,149.06,
121.76,116.88,116.66,116.43,107.47,105.78,93.08,84.96,79.35,72.91,69.36,68.06,67.24,66.70,66.35,66.02,62.60,61.65,60.43,60.21,59.78,59.21,58.15,51.64,41.29.hrms:calcd for c
36h49
n3o3[m+h]
+
572.3847,found 572.3905.
[0110][0111]
(e)-n-(3-甲氧基-4-((6-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)己基)氧基)苄基)-8-甲基壬-6-烯酰胺(8d)：收率38％；黄色固体；1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.52(d,j＝8.5hz,1h),8.18(d,j＝8.7hz,1h),7.68(t,j＝7.7hz,1h),7.43(t,j＝7.7hz,1h),6.79(d,j＝1.9hz,1h),6.76(m,j＝8.3,2.0hz,1h),6.69(d,j＝8.2hz,1h),6.33(d,j＝5.7hz,1h),5.73(s,1h),5.34(m,j＝15.4,7.5hz,2h),4.37(d,j＝5.8hz,2h),3.95(m,j＝17.2,6.4hz,4h),3.73(s,3h),3.22(t,j＝6.4hz,2h),2.55(t,j＝6.4hz,2h),2.25(t,j＝7.6hz,2h),2.22
–
2.18(m,1h),1.98(m,j＝7.0hz,2h),1.88(m,j＝6.3hz,4h),1.82(m,j＝8.8,5.7,5.3hz,4h),1.67
–
1.64(m,2h),1.55(m,j＝7.3,3.7hz,4h),1.40
–
1.36(m,2h),0.94(d,j＝6.7hz,6h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ173.27,155.59,149.57,147.67,139.05,138.12,132.49,131.86,126.69,125.29,124.34,121.23,120.05,115.88,113.13,111.65,110.78,68.76,55.99,48.48,43.29,36.77,32.42,31.09,30.95,29.83,29.45,28.94,28.41,26.14,25.49,23.68,22.79,21.96,20.73,14.26.hrms:calcd for c
37h51
n3o3[m+h]
+
586.4003,found 586.4065.
[0112][0113]
(e)-n-(3-甲氧基-4-((7-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)庚基)氧基)苄基)-8-甲基壬-6-烯酰胺(8e)：收率43％；黄色固体；1h nmr(600mhz,chloroform-d)δ8.57
–
8.53(t,1h),8.18(d,j＝8.7hz,1h),7.69(t,j＝8.0,6.6,3.8,1.9hz,1h),7.44(t,j＝8.6,6.9,1.6hz,1h),6.79(s,j＝1.9hz,1h),6.76(d,j＝8.2,1.9hz,1h),6.72(d,j＝8.1hz,1h),6.15(s,1h),5.69(s,1h),5.33(m,j＝21.8,14.6,6.2hz,2h),4.36(d,j＝5.7hz,2h),3.94(t,j＝6.8,5.5hz,4h),3.79(s,3h),3.28
–
3.23(t,2h),2.57(t,j＝5.7hz,2h),2.24(t,j＝7.6hz,2h),1.98(m,j＝7.0hz,2h),1.91(m,j＝6.4,3.5hz,2h),1.87
–
1.79(m,6h),1.67
–
1.64(m,2h),1.49(m,j＝7.3hz,4h),1.46
–
1.42(m,2h),1.42
–
1.35(m,3h),0.94(d,j＝6.7hz,6h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ173.16,155.49,149.62,147.81,138.15,132.53,131.70,126.67,125.33,124.25,121.41,120.10,115.87,113.14,111.67,110.74,69.10,56.06,48.66,43.36,36.80,32.40,31.10,31.05,29.83,29.44,28.96,28.74,28.44,26.46,25.98,25.47,23.61,22.79,21.98,20.75,14.26.hrms:calcd for c
38h53
n3o3[m+h]
+
600.4160,found 600.4222.
[0114][0115]
(e)-n-(3-甲氧基-4-((8-((1,2,3,4-四氢吖啶-9-基)氨基)辛基)氧基)苄基)-8-甲基壬-6-烯酰胺(8f)：收率38％；黄色固体；1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.34(d,j＝8.7hz,1h),8.22(t,j＝6.0hz,1h),7.81(m,j＝2.0hz,2h),7.53(t,j＝8.6,6.2,2.2hz,1h),6.83
–
6.78(m,2h),6.69(d,j＝8.3,2.0hz,1h),5.30(m,j＝15.5,7.5hz,2h),4.14(d,j＝5.9hz,2h),3.84(t,j＝6.6hz,2h),3.79(m,j＝7.0hz,2h),3.67(s,3h),2.95(s,2h),2.62(s,2h),2.16(m,j＝13.9,6.8hz,1h),2.08(t,j＝7.4hz,2h),1.90(m,j＝7.0hz,2h),1.80(s,j＝4.0hz,4h),1.68(m,j＝7.5hz,2h),1.62(m,j＝6.7hz,2h),1.47(m,j＝7.7hz,2h),1.32(m,j＝17.0,6.8hz,4h),1.26(m,j＝7.7hz,6h),0.89(d,j＝6.8hz,6h).
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ172.04,148.90,148.56,146.99,137.39,132.34,126.66,124.96,119.26,113.01,111.39,79.25,79.03,78.81,68.29,55.43,47.36,41.71,40.06,35.26,31.74,31.35,30.44,29.87,29.08,28.78,28.71,28.66,28.59,26.05,25.48,24.97,22.59,22.16,21.56,20.52,16.95,14.02.hrms:calcd for c
39h55
n3o3[m+h]
+
614.4316,found 614.4364.
[0116]
实施例6：化合物8a的制备
[0117]
步骤1：取天然辣椒素(0.5mmol,1.0当量)溶于1,2-二氯乙烷(5ml)中，向其中加入式1所示结构的化合物(0.5mmol,1.0当量)，再加入氢化钠(0.65mmol,1.3当量)常温下反应至完全。反应完成后，混合物用dcm(3
×
30ml)萃取，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，再用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱纯化(展开剂：pe/ea，1/1，体积比)，得到化合物5a。
[0118]
步骤2：取化合物5a(0.45mmol，1.0当量)溶于dmso(5ml)中，向其中加入式2所示结构的化合物，再加入氢化钠(0.9mmol，2.0当量)，室温下搅拌反应3小时，反应混合物用ea(3
×
30ml)萃取，再用h2o(3
×
30ml)洗涤，合并的有机相先用饱和食盐水洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，所得残留物通过薄层色谱法纯化(展开剂：dcm/meoh，15/1，体积比)，得到黄色固体，收率为42％。经核磁氢谱、碳谱及高分辨质谱表征，确定为目标化合物8a。
[0119]
实验例1：本发明所述辣椒素-他克林类杂化物6a,6b,6c,6d，6e，6f，6g，6h，7a，7b，7c，7d，7e，7f，8a，8b，8c，8d，8e，8f的抗胆碱酯酶活性
[0120]
1.实验部分
[0121]
根据ellman的方法测定了设计的化合物6a～h，7a～f和8a～f对ches的抑制活性。电鳗(eeache)和人红细胞(hache)。将目标化合物先溶于二甲基亚砜中，然后用tris-hcl缓冲溶液(50mm，ph＝8.0，0.1m nacl，0.02m mgcl2·
h2o)稀释至不同浓度(二甲基亚砜；0.01％)。实验方案在96孔板上进行。对于每个测试孔，添加160μl dtnb(1.5mm)、50μl ache(0.22u/ml eeache或0.05u/ml hache)或50μl buche(0.12u/ml eqbuche或0.024u/ml hbuche)和10μl相应浓度的测试化合物，然后将混合物在37℃下孵育6分钟。之后，快速加入30μl atci(15mm)或btci(15mm)。用ic
50
值报告测试化合物的抑制活性，ic
50
值计算为产生50％酶活性抑制的化合物的浓度。结果用三个独立实验的平均值
±
标准差表示。使用graph pad prism9.0.0软件(美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行数据分析。数据已表示为平均值
±
平均值的标准误差(x
±
sd)。
[0122]
2.结果与讨论
[0123]
2.1.辣椒素-他克林杂化物的抗胆碱酯酶活性
[0124]
为了确定辣椒素-他克林杂交体是否对ches有活性，化合物6a～h、7a～f和8a～f对胆碱酯酶(che)的抑制活性，根据ellman等人所述的分光光度测定法，对电鳗乙酰胆碱酯酶(eeache)、丁酰胆碱酯酶(eqbuche)、人乙酰胆碱酯酶(hache)和人丁酰胆碱酯酶(hbuche)进行了测试。胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐被用作阳性化合物，以反映所有产生的化合物的抑制能力。实验结果以ic
50
(μm)表示，列于下述表1中。
[0125]
表1.化合物6a～h，7a～f以及8a～f的抗胆碱脂酶活性
[0126][0127]
注：aic
50
值表示为三个测定，平均值
±
sd。
[0128]
在一系列杂交化合物中，化合物7e是hache和hbuche最有效和最均衡的抑制剂(ic
50
分别为0.07μm和0.07μm)，其在胆碱酯酶方面比参考化合物多奈哌齐更平衡(ic
50
为0.022μm和2.31μm)，如表1所示。化合物6a～h、7a～f和8a～f对eeache的抑制活性均表明，当他克林和不同的辣椒素或辣椒素衍生物之间的碳原子数为4时，该化合物在同类型化合物中抑制活性最强。而化合物6a～h对eqbuche的抑制活性比较表明，随着他克林和辣椒素之间碳链的增长(从3个碳原子到5个碳原子)，化合物活性增强，但随着碳链的进一步增长(从5个碳原子到6个碳原子)，活性开始减弱，化合物8a～f也存在相似的现象。对于hache，化合物5a～5s的抑制活性随着他克林和辣椒素之间碳原子数的增加而增加。当碳链的碳原子数为4～7时，化合物5a～5h对hbuche的抑制活性优于碳原子数为3或8。
[0129]
在研究了链长的结构-活性关系(sar)后，申请人还探讨了sar与不同结构的辣椒素亲脂性成分之间的相关性。大多数具有链酰胺结构的化合物显示出对胆碱酯酶的有效抑
制活性。随着辣椒素及其衍生物链酰胺部分的碳原子数的增加，所获得的化合物的活性降低。此外，如表1所示，与具有烯酰胺结构的化合物(8a～8f)相比，含有烷酰胺结构(6a～6h和7a～7f)的化合物对hache表现出更强的抑制作用。
[0130]
实验例2：本发明所述辣椒素-他克林类杂化物6a，6b，6h，7b，7d，7e，7f，8e的抗bace-1活性实验
[0131]
1.实验部分
[0132]
使用app序列的多肽m-2420(bachem，德国)进行bace-1(西格玛)抑制研究。采用以下程序：将5μl测试化合物(或对照孔中的二甲基亚砜)与175μl酶(在20mm乙酸钠中，ph 4.5，含有0.1％w/v的chaps)在室温下预孵育1小时；然后加入底物(3μm，最终浓度)并静置反应15分钟。在λ
em
＝405nm(λ
exc
＝320nm)处读取荧光信号。最终混合物中的二甲基亚砜浓度保持在5％(v/v)以下，以防止酶活性的显著损失。在含有除bace-1以外的所有试剂的对照井中测量背景信号，并将其减去。比较有抑制剂和没有抑制剂的荧光强度，并通过以下表达式计算由于存在测试化合物而引起的抑制百分比：100-(ifi/ifo
×
100)，其中ifi和ifo分别是在有和没有抑制剂时bace-1获得的荧光强度。为了证明对bace-1活性的抑制作用，将拟肽抑制剂(β-分泌酶抑制剂iv，calbiochem)连续稀释到反应孔中。使用线性回归图(graphpad prism 9.0.0，graphpad-software inc.)计算ic
50
值。
[0133]
2.结果与讨论
[0134]
2.1.辣椒素-他克林杂化物的抗bace-1活性
[0135]
为了更合理地评估所设计的化合物对bace-1的抑制活性，选择了对ches具有较好抑制活性和选择性的8个化合物6a、6b、6h、7b、7d、7e、7f和8e，用于进一步测定bace-1，结果如下述表2所示。
[0136]
表2.化合物6a，6b，6h，7b，7d，7e，7f以及8e的抗bace-1活性
[0137][0138]
注：a所有化合物的值都是三个单独实验的平均值
±
sd。
[0139]
从表2可以看出，它们中的大多数仍然保持对bace-1的高抑制活性。特别是，对hches具有最佳抑制作用的化合物7e对bace-1也表现出优异的抑制活性，显示出3.6μm的ic
50
值。
[0140]
实验例3：本发明所述辣椒素-他克林类杂化物6a～h，7a～f，8a～f的血脑屏障通透性实验
[0141]
1.实验部分
[0142]
所有合成化合物的血脑屏障(bbb)通透性通过平行人工膜通透性试验(pampa)测定。实验材料包括猪脑脂质(pbl，avanti polar lipids)、商业药物(sigma和aladdin)、供体微孔板(pvdf膜，孔径0.45mm)、受体微孔板和96孔紫外线板(millipore)。将市售药物和
待测药物溶解在二甲基亚砜中，用缓冲溶液(300ml pbs/etoh(7:3))稀释，并将pbl(4ml)十二烷溶液(20mg/ml)涂覆在受体96孔板滤膜上。放置接收板，使滤膜的下侧与缓冲溶液接触。在25下放置18小时后，测量受体板和供体板中的药物吸光度，以计算药物浓度。每个样本至少进行三次独立分析，结果用平均值
±
标准差表示。
[0143]
2.结果与讨论
[0144]
2.1.辣椒素-他克林杂化物的血脑屏障通透性
[0145]
为了评估化合物对作用于中枢神经系统(cns)的血脑屏障(bbb)的渗透性，所有化合物都用于血脑屏障的平行人工膜渗透测定。10种商业药物的渗透性实验数据与其报告的数据(表3)具有良好的线性相关性，pe(exp.)＝1.065pe(bibl.)+0.1625(r2＝0.9967)(图1)。
[0146]
表3.化合物6a～h，7a～f和8a～f的血脑屏障通透性
[0147][0148]
注：a渗透率pe(
×
10-6
cm/s)值表示为三个独立实验的平均值
±
标准差。
[0149]bcns+被预测为高血脑屏障渗透，pe(
×
10-6
cm/s)》4.42。
[0150]ccns
±
被预测为不确定血脑屏障渗透，2.29《pe(
×
10-6
cm/s)《4.42。
[0151]
根据上述线性方程并考虑di等人为血脑屏障渗透建立的极限，申请人确定了具有血脑屏障渗透范围的化合物：(a)cns+(预测的血脑屏障高渗透)：pe(10-6
cm/s)》4.42；(b)cns-(预测的血脑屏障低渗透)：pe(10-6
cm/s)《2.29；(c)cns
±
(预测血脑屏障渗透不确定)：2.29《pe(10-6
cm/s)《4.42，除了化合物6b和8a表现出不确定的血脑屏障渗透外，所有化合物的pe(
×
10-6
cm/s)值都高于4.42，这表明这些化合物可以穿过血脑屏障并在中枢神经系统中发挥生物作用。在所有上述生物学评估、全面的血脑屏障通透性和对ches和bace-1的抑制之后，选择化合物7e进行进一步研究。
[0152]
实验例4：化合物7e的pc12细胞和bv2细胞细胞毒性实验
[0153]
1.实验部分
[0154]
为了评估化合物7e的安全性，测定pc12细胞和bv12细胞的细胞毒性试验，并使用多奈哌齐作为参考化合物。pc12细胞用不同浓度的化合物7e或多奈哌齐处理24小时，并通过细胞计数试剂盒(cck-8)测定细胞活力。pc12细胞和bv-2细胞在补充有10％胎牛血清的dmem高葡萄糖培养基中在37和5％co2的潮湿气氛中培养。细胞密度达到一定水平后，将其种植在96孔板中，每孔密度为1
×
104个细胞。当细胞生长符合要求时，将细胞置于1％胎牛血清dmem高葡萄糖培养基中，不同浓度的化合物7e和阳性对照药物多奈哌齐(0.625、1.25、2.5、5、10μm)在37℃下孵育24小时。根据说明书，使用cck-8方法测量细胞活力。每个实验重复三次，实验结果用平均值
±
标准差表示。
[0155]
2.结果与讨论
[0156]
2.1.辣椒素-他克林杂化物的pc12细胞和bv2细胞细胞毒性实验
[0157]
结果如图2所示。由图2可知，当浓度达到10μm时，化合物7e对pc12细胞没有明显的毒性损伤(化合物7e：80.28％；多奈哌齐：98.20％)。然而，当化合物7e在bv2细胞中的测试浓度超过5μm，细胞活力显著下降。这表明化合物7e具有中等的治疗安全性范围，需要在体内进一步评估。
[0158]
实验例5：化合物7e的急性毒性实验
[0159]
1.实验部分
[0160]
从湖南四甲实验动物有限公司购买40只昆明种小鼠(18～22克，雌雄各半)。所有小鼠均饲养在标准动物房内，恒温23
±
2℃，相对湿度55
±
5％，光暗循环12h。为小鼠提供蒸馏水和消毒食品。根据化合物7e的试验剂量，将小鼠随机分为四组(每组n＝10，雄性5只，雌性5只)：对照组(0.5％羧甲基纤维素钠盐溶液)、高剂量组(2500mg/kg)、中剂量组(1250mg/kg)和低剂量组(625mg/kg)。将化合物7e悬浮于0.5％羧甲基纤维素钠(cmc-na)盐溶液中，并通过口服给药将其递送至受试动物。所有组在实验前禁食过夜，并允许自由饮水。给药后，在最初的4小时内连续观察动物的任何异常行为变化或死亡，然后在接下来的24小时内间歇性观察，偶尔在之后的14天内观察任何延迟效应的发生。第14天，处死所有小鼠，检查心脏、肝脏、肺、大脑和肾脏的病理变化。
[0161]
2.结果与讨论
[0162]
通过小鼠急性毒性试验进一步评价了候选化合物7e的安全性。在给予不同剂量的625、1250和2500mg/kg 4小时后，没有观察到异常行为，也没有观察到小鼠死亡、饮食下降或其他情况。之后，对小鼠进行连续14天的观察。研究发现，三个剂量的体重变化与空白对照组相似，没有明显的急性毒性(图3)。此外，分析的小鼠组织分别显示了高剂量对照组和空白对照组的肺、肝、脑、肾和心脏(图4)。结果表明，在2500mg/kg化合物7e的剂量下，化合物7e对小鼠没有显著损伤，并且具有良好的耐受性。
[0163]
实验例6：化合物7e的降压被动回避实验
[0164]
1.实验部分
[0165]
将昆明小鼠放入潜水平台箱中适应5分钟，使小鼠熟悉潜水平台箱的内部环境，然后打开潜水平台的电源开关，将潜水平台箱底部的电流刺激强度设置为0.5ma(24v)，并对小鼠进行训练。将化合物均匀分散在0.5％cmc-na溶液中，制备三种浓度的药物溶液，分别为20mg/kg、10mg/kg和5mg/kg。试验动物被随机分为六组，每组六只。实验前1小时，灌胃给药复方cmc na溶液和多奈哌齐溶液(10mg/kg)。空白组给予相同剂量的cmc-na溶液。30分钟
后，大鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱注射液(3mg/kg)进行建模。经过训练的动物被放回平台箱中。熟悉5分钟后，再次进行电流刺激(0.5ma，24v)，记录5分钟内小鼠第一次跳台的时间(潜伏期)和5分钟内跳台的次数(错误次数)，并根据潜伏期和错误次数评估体内药效。单因素方差分析用于测量各组之间的差异。
[0166]
2.结果与讨论
[0167]
上述研究的优异治疗结果表明，化合物7e有必要确定其是否能改善体内记忆障碍。使用东莨菪碱诱导的认知缺陷小鼠模型测试化合物7e，多奈哌齐作为阳性参考，进行降压被动回避测试以评估认知改善的效果。如图5所示，与对照组相比，模型组表现出更短的潜伏期和更多的错误(
###
p《0.001)。除了化合物7e的低剂量组外，高剂量组和中剂量组的潜伏期和错误次数与模型组相比表现出显著差异(分别为***p《0.001和***p《0.001)。在用化合物7e处理后，潜伏期和错误次数被逆转。高剂量组(20mg/kg)比多奈哌齐组(10mg/kg)表现出更长的潜伏期(139.8s vs 120.7s)。高剂量组(20mg/kg)和中剂量组(10mg/kg)比多奈哌齐组(10mg/kg)显示出更少的误差(1.36，1.24，vs 3.4)。低剂量组(5mg/kg)与模型组相比没有显著差异，但潜伏期和错误次数有所改善(98.7s vs 66.2s，3.21 vs 4.2)。这项体内研究进一步证明，化合物7e可能是一种治疗ad的有前途的化合物。

技术特征：
1.具有下述式6、式7或式8所示结构的辣椒素-他克林杂化物或其药学上可接受的盐：其中，m＝6～8，n＝3～8。2.根据权利要求1所述的辣椒素-他克林杂化物，其特征是，式6中，m＝6～8，n＝3～6；式7中，n＝3～8；式8中，n＝3～8。3.权利要求1所述辣椒素-他克林杂化物的制备方法，包括以下步骤：1)取下述式1所示结构的化合物分别与式9所示结构的辣椒素衍生物、二氢辣椒素或天然辣椒素置于第一有机溶剂中，在缚酸剂存在的条件下进行反应，分别得到式3、式4或式5所示结构的化合物；2)取下述式2所示结构的化合物分别与式3、式4或式5所示结构的化合物置于第二有机溶剂中，加入碱性试剂进行反应，得到式6、式7或式8所示结构的化合物；4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，步骤1)中，所述的第一有机溶剂为选自1,2-二氯乙烷、甲苯和乙腈中的一种或两种以上的组合；步骤2)中，所述的第二有机溶剂为n,n-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，或者是它们的组合物。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，步骤1)中，反应在加热条件下进行。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是，步骤2)中，所述的碱性试剂为氢化钠或氢化钾，或者是它们的组合物。7.根据权利要求3～6中任一项所述的制备方法，其特征是，还包括对制得的式6、式7或
式8所示结构的化合物进行纯化的步骤。8.权利要求1所述的辣椒素-他克林杂化物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗或预防阿尔茨海默病的药物中的应用。9.权利要求1所述的辣椒素-他克林杂化物或其药学上可接受的盐在制备胆碱酯酶抑制剂，或者是在制备bace-1抑制剂，或者是在制备神经保护剂中的应用。10.一种药物组合物，其包括作为活性成分的治疗上有效剂量的权利要求1所述的辣椒素-他克林杂化物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。

技术总结
本发明公开了一系列辣椒素-他克林杂化物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。申请人的试验结果表明，本发明提供的辣椒素-他克林杂化物具有良好的抗胆碱酯酶活性、抗BACE-1活性和神经保护作用，有望用于治疗神经退行性疾病特别是阿尔茨海默病，具有很好的潜在药用价值。价值。价值。


技术研发人员：刘云 龙娟月 韦庆军 詹新立 蒋能 颜志明 廖世杰 谢天裕 唐海军 冯文宇 罗晓婷
受保护的技术使用者：权利要求书2页说明书21页附图3页
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/28