一种5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶及其制备方法和应用

1.本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.5-氟尿嘧啶是一种常用的抗代谢药物，对结肠癌、胃癌、乳腺癌、肺癌等多种实体瘤均有治疗作用。然而，5-氟尿嘧啶较差的理化性质导致其生物利用度低，在某种程度上阻碍了5-氟尿嘧啶的临床应用。
3.药物共结晶作为一种新兴的前沿技术，可以在不改变药物共价结构和药理作用的前提下，通过将药物分子和共晶形成物(ccf)结合到相同的晶格中，从而改善药物的理化性质，增强其药效。因此可以通过形成共晶来提高5-氟尿嘧啶的生物利用度，进而提高其抗肿瘤活性。
4.cn111440124a公开一种5-氟尿嘧啶与咖啡酸的共晶及其制备方法，该5-氟尿嘧啶-咖啡酸共晶的组成为[c4h3n2o2f
·
c9h8o4·
2h2o]，通过一个5-氟尿嘧啶分子、一个咖啡酸分子和两个水分子形成基本结构单元。该药物共晶属于三斜晶系，空间群为p-1，晶胞参数为：α＝99.55-99.95
°
、β＝96.18-96.58
°
、γ＝98.61-99.01
°
，该共晶pxrd特征衍射峰出现在11.36
±
0.2
°
、13.1
±
0.2
°
、15.64
±
0.2
°
、19.48
±
0.2
°
、26.08
±
0.2
°
、28.12
±
0.2
°
处，但是并没有开展跨膜渗透性以及抗肿瘤活性的研究。
[0005]
cn104557732a公开一种5-氟尿嘧啶药物共晶及其制备方法和应用，以5-氟尿嘧啶作为药物活性成分，以烟酰胺为药物前驱体；5-氟尿嘧啶药物共晶为三斜晶系，其轴长轴角α＝86.296-86.596
°
，β＝76.709-76.909
°
，γ＝69.343-69.743
°
。该专利同样是采用传统溶剂挥发法，但是没有进行相关生物学实验，性能好坏有待商榷。
[0006]
cn104356072a公开一种5-氟尿嘧啶药物共晶及其制备方法，选用5-氟尿嘧啶原料药作为活性药物成分，选用的药物前驱体为对氨基苯甲酸，制备的5-氟尿嘧啶药物共晶为三斜晶系，其轴长pxrd谱特征峰值出现在6.75-7.25
°
，13.49-13.99
°
，16.36-16.86
°
，17.43-17.93
°
，24.26-24.76
°
，27.74-28.24
°
。该专利采用传统溶剂挥发法制备共晶，也未展开相关生物学实验的验证。
[0007]
cn115417826a公开了一种5-氟尿嘧啶-2-吡啶甲酰胺药物共晶及其制备方法和应用，通过两个5-氟尿嘧啶和一个2-吡啶甲酰胺形成结构单元，该共晶属于单斜晶系，p21/c空间群，晶胞参数：轴长轴角α＝90.000
°
，β＝105.846
°
，γ＝90.000
°
。采用溶剂挥发方法制备，但是并未开展溶出度和跨膜渗透性的研究。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的在于提供一种5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶，具有良好的溶解性能和渗透性能，并同时提供其制备方法与应用。
[0009]
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
[0010]
本发明一方面提供了一种5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶，其x-射线粉末衍射图在衍射角2θ为9.24
±
0.2
°
、9.77
±
0.2
°
、14.19
±
0.2
°
、15.65
±
0.2
°
、17.65
±
0.2
°
、18.52
±
0.2
°
、19.52
±
0.2
°
、23.51
±
0.2
°
、23.82
±
0.2
°
、26.56
±
0.2
°
、28.91
±
0.2
°
、30.13
±
0.2
°
、37.5
±
0.2
°
。
[0011]
作为本发明进一步的改进，x-射线粉末衍射图如图1所示。
[0012]
作为本发明进一步的改进，其分子式为[2c4h3n2o2f
·
c3h7no2],由一个肌氨酸两性离子和两个5-氟尿嘧啶分子组成不对称单元，该共晶属于三斜晶系，空间群为p-1，晶胞参数为：α＝67.64～68.04
°
，β＝77.97～78.37
°
，γ＝76.86～77.26
°
。
[0013]
作为本发明进一步的改进，所述共晶的单晶中，肌氨酸采用扭转构象，扭角c9-c10-n5-c11为71.91～72.31
°
，质子从羧基转移到氨基，生成内盐，两个5-氟尿嘧啶的环近平行方式排列，二面角为2.09～2.49
°
。
[0014]
本发明另一方面提供了上述5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的制备方法，将5-氟尿嘧啶和肌氨酸进行混匀，加入溶剂辅助研磨，干燥即得，所述5-氟尿嘧啶和肌氨酸的摩尔比为2:1。
[0015]
作为本发明进一步的改进，所述溶剂选自甲醇、乙醇或水，所述溶剂和所述物料的比例为1～3ml:3490mg。
[0016]
本发明还提供了上述5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的另一种制备方法，将5-氟尿嘧啶与肌氨酸按摩尔比1.6～2.2:1加入溶剂中，溶液固液比为8～10mg/ml，混合，室温下静置挥发10～20天，得到共晶。
[0017]
作为本发明进一步的改进，所述溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇或乙醇与水的混合物，所述甲醇或乙醇与水的混合物的浓度不低于50％。
[0018]
本发明再一方面提供了上述5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0019]
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
[0020]
本发明以5-氟尿嘧啶和肌氨酸作为原料，通过研磨法和溶剂挥发法获得共晶，经过试验验证，该共晶具有良好的溶出度、跨膜渗透性、生物利用度。
[0021]
本发明所提供的共晶经体外抗肿瘤活性试验验证，明显优于5-氟尿嘧啶的活性，由此可见本技术共晶能够增强5-氟尿嘧啶的抗肿瘤活性。
附图说明
[0022]
图1是本发明实施例1得到的共晶的pxrd图谱，其中(a)为5-fu,(b)为sar，(c)为共晶，(d)为sc-xrd单晶模拟；
[0023]
图2是本发明实施例1得到的共晶原子标记的不对称单元图；
[0024]
图3是本发明实施例1得到的共晶的二维氢键结构图；
[0025]
图4是本发明实施例1得到的共晶sar和f2-5-fu通过氢键相互作用组成的1-d双链；
[0026]
图5是本发明实施例1得到的共晶的的dsc曲线，其中(a)为5-fu,(b)为sar，(c)为共晶；
[0027]
图6是本发明实施例1得到的共晶的ft-ir光谱，其中(a)为5-fu,(b)为sar，(c)为共晶；
[0028]
图7是本发明实施例1得到的共晶的拉曼光谱，其中(a)为5-fu,(b)为sar,(c)为共晶；
[0029]
图8本发明实施例1得到的共晶的溶出曲线(25℃,n＝3)，其中(a)为水，(b)为ph为1.2的hcl溶液；
[0030]
图9本发明实施例1得到的共晶的跨膜渗透曲线；
[0031]
图10本发明实施例1得到的共晶的药时曲线。
具体实施方式
[0032]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
[0033]
实施例1 5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶制备
[0034]
精密称定5-氟尿嘧啶(5-fu)2600mg和肌氨酸(sar)890mg(摩尔比5-fu/sar 2:1)，置于带有聚四氟乙烯内衬的不锈钢罐中，加入两个1.5cm氧化锆研磨球，均匀混合，加入50％乙醇(v/v)2ml，1200rpm研磨30min，每5min暂停以冷却物料。研磨后置于60℃真空干燥箱中干燥过夜，即得5-fu-sar共晶粉末。
[0035]
实施例2 5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶制备
[0036]
将15ml含有0.130g 5-氟尿嘧啶的水溶液与溶有0.045g肌氨酸(摩尔比5-fu/sar 2:1)的5ml甲醇溶液混合后，磁力搅拌20min后过滤到烧杯中，烧杯口封装上封口膜并扎孔，在室温下静置挥发10天后，得到适合单晶衍射测试的无色块状晶体。
[0037]
实验例1共晶的结构表征
[0038]
(1)x-射线粉末衍射检测
[0039]
分别称取5-fu、sar和共研磨产物适量于置物台上，测定各自样品的x-射线衍射图谱。扫描范围为5至40
°
(2θ)，步长为0.01
°
，扫描速度为10
°
/min。
[0040]
5-fu、sar、二者共研磨后的粉末和使用单晶结构数据模拟的pxrd图谱如图1所示。从图中得出，9.24
°
、9.77
°
、14.19
°
、15.65
°
、17.65
°
、18.52
°
、19.52
°
、23.51
°
、23.82
°
、26.56
°
、28.91
°
、30.13
°
、37.5
°
(2θ)时出现不同于原有5-fu和sar的新的衍射峰，这与使用单晶结构数据模拟的pxrd图谱一致，说明通过溶剂辅助研磨法生成了目标共晶。
[0041]
(2)sc-xrd检测
[0042]
将实施例1制备的共晶粉末20mg溶解在甲醇8ml中，置于10ml聚丙烯离心管中，缓慢挥发10天，得到可用于单晶衍射的晶体。
[0043]
rigaku mm007衍射仪上采集了sc-xrd数据。室温下，用经石墨单色化的mo kα射线以ω扫描方式收集衍射点，收集的数据通过saint程序还原并用sadabs方法进行半经验吸收校正。结构解析和精修分别采用shelxtl程序的shelxs和shelxl完成。
[0044]
单晶x-射线衍射分析表明，2(5-fu)-sar共晶结晶于三斜晶系p-1空间群，每个不对称单元包含一个两性离子sar和两个5-fu分子，如图2所示。sar采用扭转构象，扭角c9-c10-n5-c11为72.11
°
。在每个sar中，质子从羧基转移到氨基，生成内盐，这可由c＝o(1.243和)的键长证实。两个5-fu环以近平行方式排列，二面角为2.293
°
。晶体堆积分析表明，一对中心对称的f1-5-fu通过n1-h1
····
o2键连接，形成同质二聚体。类似地，中心对称的sar二聚体由n5-h5a
····
o6相互作用，显示椅式构象。每个二聚体连接四个相邻的二聚体单元，形成二维网格状层(见图3)。f2-5-fu，同样以中心对称的方式形成同质二聚体，它们通过n4-h4
····
o5、n4-h4
···
o6和n5-h5b
···
o3氢键由sar二聚体连接，形成一维双链(见图4)。由此，2-d层通过1-d结构连接，构成最终3-d超分子氢键框架，具体数据见表1和表2。
[0045]
表1 2(5-fu)-sar共晶的晶体学数据
[0046][0047]
表2.2(5-fu)-sar共晶的氢键(
°
)
[0048][0049][0050]
(3)dsc检测
[0051]
分别精密称取5-fu、sar和5-fu-sar共晶粉末约8mg于铝坩埚中，以空坩埚为参比，测定各个样品的dsc谱图。范围30～400℃，升温速率20℃/min，吹扫气40ml/min，保护气60ml/min。
[0052]
5-fu、sar和共晶的dsc谱图如图5所示。5-fu和sar分别在290℃和222.5℃出现了尖锐的吸热峰，对应各自的熔点。而共晶的熔点吸热峰出现在了234.5℃，位于二组分各自的熔点之间，单一熔点吸热峰的出现证明了共晶新物相的生成。
[0053]
(4)ft-ir和拉曼检测
[0054]
在spectrum two ft-ir(perkinelmer company,usa)上使用kbr压片法测量5-fu、sar和5-fu-sar共晶的ft-ir光谱。分别称取5-fu、sar、和共晶粉末约1mg，另称取kbr约160mg，分别以等量递增法混合并充分研磨，压片。以空白kbr片为参比，分辨率为4cm-1
，扫描范围4000至400cm-1
，扫描总数为40，并对信号累加平均。
[0055]
使用xplora plus拉曼成像光谱仪(horiba france sas,france)测量5-fu、sar和共晶在4000至400cm-1
范围内的拉曼光谱。激发波长为638nm；rtd时间为1s，扫描15次并累加平均。
[0056]
5-fu、sar和共晶的ft-ir和拉曼光谱如图6和7所示。由图可知，在5-fu的ft-ir光谱中，3068cm-1
处有一个吸收峰，与之对应，在其拉曼光谱中，3072cm-1
处的吸收峰，均对应5-fu分子中的n-h键的振动吸收。在5-fu的ft-ir光谱中，1778/1723cm-1
处的吸收峰，和拉曼光谱中1673/1652cm-1
处的吸收峰对应c＝o的振动吸收。在sar的ft-ir光谱中，1649/1610cm-1
处的吸收峰归属于c＝o的振动，而此振动体现在拉曼光谱中的3072cm-1
处的吸收峰。
[0057]
当5-fu与sar以2:1的比例形成共晶后，在红外光谱中，5-fu的3068cm-1
处的吸收峰移动到3060cm-1
；拉曼光谱中，3072cm-1
移动到3063cm-1
处，表明5-fu结构中的n-h参与了氢键的生成。同时，5-fu中1778/1723cm-1
处的吸收峰移动到1765/1712cm-1
；拉曼光谱中的1673/1652cm-1
处的峰移动到1696/1669cm-1
处，证明5-fu中的c＝o也参与了共晶的生成。对sar而言，在共晶的拉曼光谱中，sar中的3027cm-1
处的峰移动到2980cm-1
处，表明sar中n-h也参与了氢键形成。同时，1649/1610cm-1
处的吸收峰移动到了1652/1573cm-1
处，表明了sar中的c＝o产生了氢键。以上结果与单晶结构分析的一致。
[0058]
试验例2 5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的溶出度测定
[0059]
采用药典第四部第二方法(桨法)于rc-806d溶出仪(天津天大天发有限公司)上测定5-fu、pm、共晶的溶出速率。分别精密称定5-fu 0.5mmol、pm(包含5-fu 0.5mmol和
sar0.25mmol)，共晶0.5mmol(相当于5-fu 0.5mmol)，置于25
±
0.5℃预热的溶出介质500ml中，50
±
2rpm搅拌。于不同时间点取样5ml，立即补充同温度的溶出介质。样品经0.22μm微孔滤膜过滤后，适当稀释后使用uv-vis测定265nm处吸光度。
[0060]
5-fu、pm和共晶在水和hcl中的累积溶出度如图8所示。由图可知，共晶在水或ph＝1.2hcl中的溶出度高于5-fu和pm，其在30min时溶出度达到最大值，而5-fu和pm均在50min后才能达到最大值。共晶的形成，优化了5-fu在动力学上的溶解性能。
[0061]
试验例3 5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的跨膜渗透性测定
[0062]
精密称定5-fu、sar和共晶粉末约100mg，置于100ml容量瓶中，使用水或ph＝1.2的hcl溶液溶解、定容后，配制成含有相当于5-fu浓度约为1mm的5-fu、pm和共晶溶液。经0.22μm微孔滤膜过滤后，弃去体积不等的初滤液，取100μl续滤液于离心管中，分别加入水或ph＝1.2的hcl溶液900μl，摇匀，作为样品溶液；使用uv-vis检测。
[0063]
5-fu、pm和共晶的跨膜渗透性如图9所示。5-fu、pm和共晶在供给侧的投入量均为相当于5-fu 40mg，共晶的渗透速度高于pm和5-fu。
[0064]
试验例4 5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的药物动力学测定
[0065]
选取体重约250
±
25g的雄性sd大鼠36只做受试动物(河北省实验动物中心，spf，许可证号：scxk(冀)2022-001)。试验前12h至试验结束期间禁食，自由饮水。所有动物设施均遵循了国际实验动物管理评鉴及认证协会的要求。实验动物喂养环境：温度22～24℃，相对湿度50
±
5％。光照12h后黑暗12h。
[0066]
取sd大鼠36只随机分为6组，每组6只，分别为口服5-fu、口服pm、口服共晶组，饲养于温度为22～24℃、相对湿度为50
±
5％的环境中。实验前称量大鼠体重并计算给药剂量(相当于5-fu 50mg/kg)，给药前禁食12h，自由饮水，单次灌胃给药，于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6和8h时，眼眶取血0.3ml于含有干燥肝素的抗凝管中，4℃环境3500rpm离心10min，取血浆上清于-20℃中保存。血浆样本经处理后，精密量取上清液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以取血时间为横坐标，血浆样本中5-fu的浓度为纵坐标，绘制药-时曲线，并使用das 2.0软件计算auc
0-t
、c
max
等药动学参数，药物动力学参数使用spss做统计学分析。最终结果以0.05为检验水准，当p《0.05时认为有统计学差异。
[0067]
测得的大鼠血浆中的5-fu的浓度-时间曲线见图10所示。使用excel计算得到auc
0-t
、c
max
、t
1/2
和t
max
见表3。从表中可以看出，口服给药后，5-fu的血药浓度在1h时达到峰值215.01
±
58.7μm；加入sar制成pm后，尽管auc
0-t
变化很小，但是在0.25h时血药浓度就达到了最大值294.64
±
40.21μm，pm中的sar可以加快5-fu的吸收，但是对auc
0-t
影响很小。当5-fu与sar形成共晶后，血浆药物浓度快速达到峰值，且在代谢和消除阶段的血药浓度与5-fu没有明显差异，auc
0-t
是5-fu的1.38倍(p《0.05)。由此可见，共晶可明显提高5-fu的auc
0-t
。共晶通过优化5-fu的溶出速率和渗透性等理化性质最终导致体内auc
0-t
的改善。
[0068]
表3.口服5-fu，pm和共晶在大鼠中的药物动力学参数(n＝6)
[0069][0070]
p《0.05,
***
p《0.001vs 5-fu,
##
p《0.01vs pm.
[0071]
试验例5体外抗肿瘤活性
[0072]
采用mtt法检测5-fu、sar、pm和共晶对bel-7402细胞系的抑制率。
[0073]
取对数生长期的细胞，以4000个/孔的密度接种于96孔板中，于37℃、5％ co2条件下孵育。孵育24h后，加入不同浓度的样品溶液与细胞共孵育。样品溶液的配制方法为：精密称定5-fu，sar和共晶，用pbs溶解并稀释至10mm，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，分别用pbs稀释至不同的配制浓度。样品对细胞的作用浓度为20、50、100、200、300、400μm。将含有不同量的样品pbs溶液取10μl加入细胞的培养基中，对照组加入等体积的pbs以确保体积一致。随后，将细胞与药物共同孵育48h，然后向每个孔中加入20μl mtt溶液，并在37℃下再孵育4h。加入dmso 200μl以溶解甲瓒，然后在微孔板读取器上以630nm作为参考，测定570nm处的吸光度值。细胞存活率计算公式如下：
[0074][0075]
结果如表4所示，在bel-7402细胞中，共晶表现出优于5-fu的细胞毒性，共晶在bel-7402细胞的ic
50
为51.8
±
5.37μm，显著低于5-fu的ic
50 97.51
±
5.43μm(p《0.001)。
[0076]
表4. 5-fu、pm和共晶在bel-7402细胞系中的ic
50
(μm)
[0077][0078]
***
p《0.001vs 5-fu
[0079]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域技术人员依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶，其特征在于，其x-射线粉末衍射图在衍射角2θ为9.24
±
0.2
°
、9.77
±
0.2
°
、14.19
±
0.2
°
、15.65
±
0.2
°
、17.65
±
0.2
°
、18.52
±
0.2
°
、19.52
±
0.2
°
、23.51
±
0.2
°
、23.82
±
0.2
°
、26.56
±
0.2
°
、28.91
±
0.2
°
、30.13
±
0.2
°
、37.5
±
0.2
°
。2.根据权利要求1所述的一种5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶，其特征在于，x-射线粉末衍射图如图1所示。3.根据权利要求1所述的一种5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶，其特征在于，其分子式为[2c4h3n2o2f
·
c3h7no2]，由一个肌氨酸两性离子和两个5-氟尿嘧啶分子组成不对称单元，该共晶属于三斜晶系，空间群为p-1，晶胞参数为：a=7.36~7.76
å
，b=9.68~10.08
å
，c=10.20~10.60
å
，α=67.64~68.04
°
，β=77.97~78.37
°
，γ=76.86~77.26
°
。4.根据权利要求3所述的一种5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶，其特征在于，所述共晶的单晶中，肌氨酸采用扭转构象，扭角c9-c10-n5-c11为71.91~72.31
°
，质子从羧基转移到氨基，生成内盐，两个5-氟尿嘧啶的环近平行方式排列，二面角为2.09~2.49
°
。5.一种如权利要求1-4任一项所述的5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的制备方法，其特征在于，将5-氟尿嘧啶和肌氨酸进行混匀，加入溶剂辅助研磨，干燥即得，所述5-氟尿嘧啶和肌氨酸的摩尔比为2:1。6.根据权利要求5所述的5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自甲醇、乙醇或水，所述溶剂和所述物料的比例为1~3ml:3490mg。7.一种如权利要求1-4任一项所述的5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的制备方法，其特征在于，将5-氟尿嘧啶与肌氨酸按摩尔比1.6~2.2:1加入溶剂中，溶液固液比为8~10mg/ml，混合，室温下静置挥发10~20天，得到共晶。8.根据权利要求7所述的5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自甲醇、乙醇、甲醇或乙醇与水的混合物，所述甲醇或乙醇与水的混合物的浓度不低于50%。9.一种如权利要求1-4任一项所述的5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术总结
本发明涉及一种5-氟尿嘧啶-肌氨酸共晶及其制备方法和应用，其X-射线粉末衍射图在衍射角2θ为9.24


技术研发人员：王静 郭伟 郝汉 杨彩琴 任甜甜
受保护的技术使用者：河北医科大学
技术研发日：2023.05.29
技术公布日：2023/8/28