一种银杏叶提取物的制备方法

1.本发明属于植物药用成分提取技术领域，具体涉及一种银杏叶提取物的制备方法。


背景技术：

2.银杏叶是一种具有很高药用价值的植物，银杏树为古老的树种，它是神奇的医疗之树，2亿5千多年前侏罗纪恐龙掌控地球时，银杏已经是最繁盛的植物之一。银杏叶含黄酮类成分银杏双黄酮、异银杏双黄酮、去甲基银杏双黄酮、芸香甙、山柰素-3-鼠李糖葡萄糖甙、山柰素、槲皮素、异鼠李素等；另含苦味成分银杏三内酯a、b、c及银杏新内酯a；酸类成分毒八角酸、d-糖质酸、白果酸、白果酮、廿九烷、廿八醇、α-已烯醛、β-谷甾醇、豆甾醇及维生素等，并含儿茶素和表儿茶素。
3.银杏叶具有敛肺，平喘，活血化瘀，止痛的功效。用于肺虚咳喘；冠心病，心绞痛，高血脂，抗凝固，有一定概率提高记忆力。银杏叶虽能促进血液循环，预防心血管病，但不能同时服用其它治心血管药物，银杏提取物为浓缩颗粒状，具有很强的清除自由基和抗氧化作用，银杏叶中的黄甙、氨基酸和氨基酸合成胶原蛋白成份对人体美容，抑制黑色素生长，保持皮肤光泽与弹性起着不小的作用。
4.银杏活性成分的提取也有较多的报道。专利201210353451.4公开了一种银杏叶提取物的制备方法。包括如下步骤：步骤1)将银杏叶投于提取罐中，用乙醇水溶液热回流提取，合并提取液，浓缩得到密度为0.7-1.2g/ml的浓缩物a；步骤2)浓缩物a用水溶解后投入到dm130、ab-8、dm131或d318大孔吸附树脂柱中充分吸附，依次用体积分数为0％、10-30％、40-80％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集40-80％乙醇水洗脱液并浓缩得到浓缩物b；浓缩物b用乙醇水溶液溶解后投入到d101、hpd100、lky134或dm2大孔吸附树脂柱中充分吸附，用体积分数为40-80％的乙醇水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至密度为0.7-1.2g/ml，得到浓缩物c；步骤3)浓缩物c中加入乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，干燥后到银杏叶提取物成品。该方法制备的银杏活性成分总黄酮醇苷含量，总萜类内酯含量以及银杏内酯a含量，银杏内酯b含量，银杏内酯c含量均较低，药效作用不明显。


技术实现要素：

5.本发明是为了克服上述现有技术中缺陷，提出一种银杏叶提取物的制备方法。
6.一种银杏叶提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
7.(1)将银杏叶和北豆根晒干，磨成粉末，按照重量份数，取300-650份银杏叶粉末与10-30份北豆根粉末混合均匀，加入3-5份发酵菌剂，然后加入200-500份水，搅拌均匀，于25-30℃条件下发酵3-10天，得到发酵物；
8.(2)将发酵物投于提取罐中，用乙醇水溶液热回流提取，合并提取液，浓缩得到密度为0.8-1.2g/ml的浓缩液；
9.(3)步骤(2)制备的浓缩液用水溶解后投入到大孔吸附树脂柱中吸附，依次用体积
分数为0％，10-30％，40-60％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集40-60％乙醇水洗脱液并浓缩得到浓缩液；
10.(4)向步骤(3)制备的浓缩液中加入乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，干燥后到银杏叶提取物成品。
11.所述发酵菌剂为植物乳杆菌lp4菌剂和黑曲霉t2菌剂按照质量比1：1混合的混合菌剂；所述植物乳杆菌lp4的保藏编号为cgmcc no.14533，所述黑曲霉t2的保藏编号为cgmcc no.2715；所述发酵菌剂中活菌的含量为1-9x108cfu/g。
12.步骤(2)所述乙醇水溶液的体积分数为60-80％，用量为发酵物质量的5-15倍。
13.步骤(2)中热回流提取的次数为1-3次，每次提取2-5小时，提取温度为60-80℃。
14.步骤(3)中浓缩液采用3-8倍体积的水进行溶解；40-60％乙醇水洗脱液浓缩至原体积的1/3-1/8。
15.所述大孔吸附树脂柱为d101，hpd100，lky134或dm2大孔吸附树脂柱。
16.步骤(4)浓缩液中加入10-30倍体积的乙醇水溶液回流溶解。
17.步骤(4)所述滤液浓缩至原体积的1/8-1/15。
18.所述干燥为喷雾干燥、冷冻干燥或真空干燥。
19.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明制备的银杏叶提取物，具有较高的总黄酮醇苷，总萜类内酯，银杏内酯含量，可以作为保健品的添加剂使用，也可以直接作为治疗高血脂及高血压的药物使用。
具体实施方式
20.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
21.下述实施例采用的植物乳杆菌lp4的保藏编号为cgmcc no.14533，黑曲霉t2的保藏编号为cgmcc no.2715，均购买自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。
22.实施例1
23.一种银杏叶提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
24.(1)将银杏叶和北豆根晒干，磨成粉末，按照重量份数，取500份银杏叶粉末与20份北豆根粉末混合均匀，加入2份植物乳杆菌lp4菌剂、2份黑曲霉t2菌剂，然后加入300份水，搅拌均匀，于28℃条件下发酵6天，得到发酵物；所述植物乳杆菌lp4菌剂中活菌的含量为3x108cfu/g；所述黑曲霉t2菌剂中活菌的含量为3x108cfu/g；
25.(2)将发酵物投于提取罐中，加入8倍重量的体积分数为70％的乙醇水溶液热回流提取，热回流提取的次数为2次，每次提取3小时，提取温度为70℃，合并提取液，浓缩得到密度为0.9g/ml的浓缩液；
26.(3)步骤(2)制备的浓缩液用6倍体积的水溶解后投入到d101大孔吸附树脂柱中吸附，依次用体积分数为0％，20％，50％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集50％乙醇水洗脱液并浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液；
27.(4)向步骤(3)制备的浓缩液中加入20倍体积的乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，浓缩至原体积的1/12，喷雾干燥后到银杏叶提取物成品。
28.成品中总黄酮醇苷含量为34.9％，总萜类内酯含量为18.2％，其中银杏内酯a含量为6.8％，银杏内酯b含量为3.8％，银杏内酯c含量为6.2％。
29.实施例2
30.一种银杏叶提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
31.(1)将银杏叶和北豆根晒干，磨成粉末，按照重量份数，取300份银杏叶粉末与10份北豆根粉末混合均匀，加入1.5份植物乳杆菌lp4菌剂、1.5份黑曲霉t2菌剂，然后加入200份水，搅拌均匀，于25℃条件下发酵3天，得到发酵物；所述植物乳杆菌lp4菌剂中活菌的含量为6x108cfu/g；所述黑曲霉t2菌剂中活菌的含量为6x108cfu/g；
32.(2)将发酵物投于提取罐中，加入5倍重量的体积分数为60％的乙醇水溶液热回流提取，热回流提取的次数为1次，每次提取2小时，提取温度为60℃，合并提取液，浓缩得到密度为0.8g/ml的浓缩液；
33.(3)步骤(2)制备的浓缩液用3倍体积的水溶解后投入到hpd100大孔吸附树脂柱中吸附，依次用体积分数为0％，10％，40％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集40％乙醇水洗脱液并浓缩至原体积的1/3，得到浓缩液；
34.(4)向步骤(3)制备的浓缩液中加入10倍体积的乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，浓缩至原体积的1/8，冷冻干燥后到银杏叶提取物成品。
35.成品中总黄酮醇苷含量为33.9％，总萜类内酯含量为17.6％，其中银杏内酯a含量为6.4％，银杏内酯b含量为3.7％，银杏内酯c含量为6.3％。
36.实施例3
37.一种银杏叶提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
38.(1)将银杏叶和北豆根晒干，磨成粉末，按照重量份数，取650份银杏叶粉末与30份北豆根粉末混合均匀，加入2.5份植物乳杆菌lp4菌剂、2.5份黑曲霉t2菌剂，然后加入500份水，搅拌均匀，于30℃条件下发酵10天，得到发酵物；所述植物乳杆菌lp4菌剂中活菌的含量为1x108cfu/g；所述黑曲霉t2菌剂中活菌的含量为1x108cfu/g；
39.(2)将发酵物投于提取罐中，加入15倍重量的体积分数为80％的乙醇水溶液热回流提取，热回流提取的次数为3次，每次提取5小时，提取温度为80℃，合并提取液，浓缩得到密度为1.2g/ml的浓缩液；
40.(3)步骤(2)制备的浓缩液用8倍体积的水溶解后投入到lky134大孔吸附树脂柱中吸附，依次用体积分数为0％，30％，60％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集60％乙醇水洗脱液并浓缩至原体积的1/8，得到浓缩液；
41.(4)向步骤(3)制备的浓缩液中加入30倍体积的乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，浓缩至原体积的1/15，真空干燥后到银杏叶提取物成品。
42.成品中总黄酮醇苷含量为36.5％，总萜类内酯含量为17.8％，其中银杏内酯a含量为6.1％，银杏内酯b含量为3.1％，银杏内酯c含量为6.1％。
43.对比例1
44.一种银杏叶提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
45.(1)将银杏叶和北豆根晒干，磨成粉末，按照重量份数，取500份银杏叶粉末与20份北豆根粉末混合均匀，加入4份植物乳杆菌lp4菌剂，然后加入300份水，搅拌均匀，于28℃条件下发酵6天，得到发酵物；所述植物乳杆菌lp4菌剂中活菌的含量为3x108cfu/g；
46.(2)将发酵物投于提取罐中，加入8倍重量的体积分数为70％的乙醇水溶液热回流提取，热回流提取的次数为2次，每次提取3小时，提取温度为70℃，合并提取液，浓缩得到密度为0.9g/ml的浓缩液；
47.(3)步骤(2)制备的浓缩液用6倍体积的水溶解后投入到d101大孔吸附树脂柱中吸附，依次用体积分数为0％，20％，50％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集50％乙醇水洗脱液并浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液；
48.(4)向步骤(3)制备的浓缩液中加入20倍体积的乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，浓缩至原体积的1/12，喷雾干燥后到银杏叶提取物成品。
49.成品中总黄酮醇苷含量为28.4％，总萜类内酯含量为15.2％，其中银杏内酯a含量为5.1％，银杏内酯b含量为3.1％，银杏内酯c含量为5.5％。
50.对比例2
51.一种银杏叶提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
52.(1)将银杏叶和北豆根晒干，磨成粉末，按照重量份数，取500份银杏叶粉末与20份北豆根粉末混合均匀，加入4份黑曲霉t2菌剂，然后加入300份水，搅拌均匀，于28℃条件下发酵6天，得到发酵物；所述黑曲霉t2菌剂中活菌的含量为3x108cfu/g；
53.(2)将发酵物投于提取罐中，加入8倍重量的体积分数为70％的乙醇水溶液热回流提取，热回流提取的次数为2次，每次提取3小时，提取温度为70℃，合并提取液，浓缩得到密度为0.9g/ml的浓缩液；
54.(3)步骤(2)制备的浓缩液用6倍体积的水溶解后投入到d101大孔吸附树脂柱中吸附，依次用体积分数为0％，20％，50％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集50％乙醇水洗脱液并浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液；
55.(4)向步骤(3)制备的浓缩液中加入20倍体积的乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，浓缩至原体积的1/12，喷雾干燥后到银杏叶提取物成品。
56.成品中总黄酮醇苷含量为23.6％，总萜类内酯含量为11.2％，其中银杏内酯a含量为4.9％，银杏内酯b含量为2.3％，银杏内酯c含量为4.8％。
57.对比例3
58.一种银杏叶提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
59.(1)将银杏叶晒干，磨成粉末，按照重量份数，取520份银杏叶粉末，加入2份植物乳杆菌lp4菌剂、2份黑曲霉t2菌剂，然后加入300份水，搅拌均匀，于28℃条件下发酵6天，得到发酵物；所述植物乳杆菌lp4菌剂中活菌的含量为3x108cfu/g；所述黑曲霉t2菌剂中活菌的含量为3x108cfu/g；
60.(2)将发酵物投于提取罐中，加入8倍重量的体积分数为70％的乙醇水溶液热回流提取，热回流提取的次数为2次，每次提取3小时，提取温度为70℃，合并提取液，浓缩得到密度为0.9g/ml的浓缩液；
61.(3)步骤(2)制备的浓缩液用6倍体积的水溶解后投入到d101大孔吸附树脂柱中吸附，依次用体积分数为0％，20％，50％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集50％乙醇水洗脱液并浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液；
62.(4)向步骤(3)制备的浓缩液中加入20倍体积的乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，浓缩至原体积的1/12，喷雾干燥后到银杏叶提取物成品。
63.对比例4
64.一种北豆根提取物的制备方法，按照如下步骤进行：
65.(1)将北豆根晒干，磨成粉末，按照重量份数，取520份北豆根粉末，加入2份植物乳杆菌lp4菌剂、2份黑曲霉t2菌剂，然后加入300份水，搅拌均匀，于28℃条件下发酵6天，得到发酵物；所述植物乳杆菌lp4菌剂中活菌的含量为3x108cfu/g；所述黑曲霉t2菌剂中活菌的含量为3x108cfu/g；
66.(2)将发酵物投于提取罐中，加入8倍重量的体积分数为70％的乙醇水溶液热回流提取，热回流提取的次数为2次，每次提取3小时，提取温度为70℃，合并提取液，浓缩得到密度为0.9g/ml的浓缩液；
67.(3)步骤(2)制备的浓缩液用6倍体积的水溶解后投入到d101大孔吸附树脂柱中吸附，依次用体积分数为0％，20％，50％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集50％乙醇水洗脱液并浓缩至原体积的1/5，得到浓缩液；
68.(4)向步骤(3)制备的浓缩液中加入20倍体积的乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，浓缩至原体积的1/12，喷雾干燥后到北豆根提取物成品。
69.实验例：
70.实验动物采用wistar大鼠，雄性，体重约200g，spf级，购自成都达硕实验动物有限公司；实验动物饲料采用高脂饲料(73.8％基础饲料+15％猪油+10％蛋黄粉+1％胆固醇+0.2％胆酸钠)、大鼠生长维持料，购自小黍有泰(北京)生物科技有限公司；益心酮，海南天煌制药有限公司生产，批号1608211。
71.造模与分组给药：取大鼠适应环境7d，随机分组，每组10只，益心酮组喂药90mg/kg,实施例1-3及对比例1-4制备的银杏叶提取物喂药50mg/kg。除对照组外，其余各组均给予高脂饲料，对照组给予正常饲料。每日灌胃给药1次，连续给药60d，对照组和模型组灌服10ml/kg纯净水。每10天称量体重1次，于第60天给药后1h称重，取每组前10只大鼠以300mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，分离血清，取心脏，液氮冷冻后移至-80℃冰箱中保存备用。
72.指标检测：测血清中tc、tg、hdl-c、ldl-c含量(mmol/l)；测心肌组织中sod活性、mda含量(u/mgprot)。
73.采用spss 24.0软件进行统计学分析，计量资料结果用(均数士标准差)表示，采用kolmogorov-smirnov检验法进行数据正态性检验，对于符合正态分布数据，两组间均值差异比较采用t检验，以p《0.05为差异具有统计学意义。
74.测定结果见表1-2：
75.表1
[0076][0077]
注：*代表与对照组相比，p《0.05；#代表与实施例1组相比p《0.05。
[0078]
表2
[0079][0080]
注：*代表与对照组相比，p《0.05；#代表与实施例1组相比p《0.05。
[0081]
以上配方配比以及工艺的实施例只是阐述了本发明的基本原理和特性，本发明不受上述工艺和配比的实施限制，在不脱离本发明的精神和范围下，本发明还可以做出各种修改和变换。因此这些变化和改变都属于本发明范围内。

技术特征：
1.一种银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：(1)将银杏叶和北豆根晒干，磨成粉末，按照重量份数，取300-650份银杏叶粉末与10-30份北豆根粉末混合均匀，加入3-5份发酵菌剂，然后加入200-500份水，搅拌均匀，于25-30℃条件下发酵3-10天，得到发酵物；(2)将发酵物投于提取罐中，用乙醇水溶液热回流提取，合并提取液，浓缩得到密度为0.8-1.2g/ml的浓缩液；(3)步骤(2)制备的浓缩液用水溶解后投入到大孔吸附树脂柱中吸附，依次用体积分数为0％，10-30％，40-60％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集40-60％乙醇水洗脱液并浓缩得到浓缩液；(4)向步骤(3)制备的浓缩液中加入乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，干燥后到银杏叶提取物成品。2.根据权利要求1所述银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述发酵菌剂为植物乳杆菌lp4菌剂和黑曲霉t2菌剂按照质量比1：1混合的混合菌剂；所述植物乳杆菌lp4的保藏编号为cgmcc no.14533，所述黑曲霉t2的保藏编号为cgmcc no.2715；所述发酵菌剂中活菌的含量为1-9x108cfu/g。3.根据权利要求1所述银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述乙醇水溶液的体积分数为60-80％，用量为发酵物质量的5-15倍。4.根据权利要求1所述银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中热回流提取的次数为1-3次，每次提取2-5小时，提取温度为60-80℃。5.根据权利要求1所述银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中浓缩液采用3-8倍体积的水进行溶解；40-60％乙醇水洗脱液浓缩至原体积的1/3-1/8。6.根据权利要求1所述银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂柱为d101，hpd100，lky134或dm2大孔吸附树脂柱。7.根据权利要求1所述银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤(4)浓缩液中加入10-30倍体积的乙醇水溶液回流溶解。8.根据权利要求1所述银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述滤液浓缩至原体积的1/8-1/15。9.根据权利要求1所述银杏叶提取物的制备方法，其特征在于，所述干燥为喷雾干燥、冷冻干燥或真空干燥。

技术总结
本发明公开了一种银杏叶提取物的制备方法。按照如下步骤进行：1)将银杏叶晒干，磨成粉末，与北豆根混合后加入发酵菌剂，发酵3-10天，得到发酵物；2)将发酵物投于提取罐中，用乙醇水溶液热回流提取；3)浓缩液用水溶解后投入到大孔吸附树脂柱中吸附，进行梯度洗脱，收集40-60％乙醇水洗脱液并浓缩得到浓缩液；4)向浓缩液中加入乙醇水溶液回流溶解，并常温过滤除去不溶杂质，将滤液浓缩，干燥后到银杏叶提取物成品。本发明制备的银杏叶提取物，具有较高的总黄酮醇苷，总萜类内酯，银杏内酯含量，可以作为保健品的添加剂使用，也可以直接作为治疗高血脂及高血压的药物使用。血脂及高血压的药物使用。


技术研发人员：陈小明 罗丽媛 吕敬崑 陈思伽 魏允武 吕宏再
受保护的技术使用者：湖南科技学院
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/28