基于铁镍泡沫的模拟酶及其制备方法和应用

1.本发明属于模拟酶材料领域，具体涉及一种基于铁镍泡沫的模拟酶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.天然生物酶作为一种高选择性高活性的生物传感酶，在现在的生物传感中广泛应用。相较于天然酶，模拟酶是一类利用化学方法合成的具有天然酶类似的催化活性的非蛋白分子，具有性质稳定，环境耐受，成本低，易于量产与修饰的优点。其中，一些纳米无机材料被发现拥有类似于生物传感酶的某些特性，比如对某种特定分子具有高的反应活性和选择性，因此成为新兴的类酶生物传感材料。
3.铁基模拟酶具有良好的过氧化物酶活性，在过氧化氢和葡萄糖的比色传感中应用广泛。但在比色检测过程中，四氧化三铁纳米粒子、铁基金属有机骨架和其他铁基纳米材料与反应溶液分离时需要磁吸分离或离心操作，操作步骤较为复杂，纳米粒子之间的团聚也会导致类酶活性降低，并且依赖于大型检测仪器的检测过程使得整体检测时间较长。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种模拟酶材料，该模拟酶具有良好的过氧化物酶活性，将其用于检测过氧化氢和葡萄糖，模拟酶呈块状便于与反应溶液分离，因煅烧产生的褶皱形貌提高了模拟酶的比表面积，有助于传质和电子转移，采用智能手机及配套的下光源装置进行检测，整体检测时间短。
5.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
6.本发明提供了一种基于铁镍泡沫的模拟酶的制备方法，对铁镍泡沫进行煅烧，得到模拟酶。
7.优选的，所述煅烧的温度为600～1200℃，煅烧的时间为1～5h。
8.本发明还提供了一种复合材料，包括上述制备方法制备的模拟酶，和负载在所述模拟酶上的聚多巴胺纳米粒子。
9.优选的，所述模拟酶和聚多巴胺纳米粒子的质量比为500：1～13.5：1，所述聚多巴胺纳米粒子的粒径为100～300nm。
10.本发明还提供了一种集成酶，包括天然酶和上述的复合材料。
11.优选的，所述复合材料和天然酶的质量比为112.5：1～15：1。
12.优选的，所述天然酶选自葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、胆碱氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶和肌氨酸氧化酶中的一种或多种。
13.本发明提供了一种过氧化氢的检测方法，包括以下步骤：
14.(a)将上述的复合材料与过氧化氢和显色物质在缓冲溶液中混合后反应，得到反应液；
15.(b)对所述反应液进行检测。
16.本发明还提供了一种葡萄糖的检测方法，包括以下步骤：
17.(a)将上述的集成酶与葡萄糖和显色物质在缓冲溶液中混合后反应，得到反应液；
18.(b)对所述反应液进行检测。
19.在一些可能的实现方式中，在上述的过氧化氢的检测方法或葡萄糖的检测方法中，所述检测为将反应液转移至下光源装置进行检测；
20.所述下光源装置包括避光盒子，设置在所述避光盒子内部的样品架；
21.设置在所述样品架底部的光源；
22.所述光源包括白光led光珠和位于白光led光珠上方的柔光板。
23.本技术提供了一种基于铁镍泡沫的模拟酶及其制备方法，对铁镍泡沫进行煅烧，得到模拟酶，该模拟酶呈块状便于与反应液分离，并且因煅烧产生的褶皱形貌提升了其类过氧化物酶活性。将所述模拟酶与聚多巴胺纳米粒子复合得到复合材料，可用于检测过氧化氢，将复合材料进一步与天然酶缩合得到集成酶，可用于检测葡萄糖，在过氧化氢或葡萄糖的比色检测过程中，采用智能手机及配套的下光源装置进行检测，整体检测时间小于10min。
附图说明
24.图1为下光源装置示意图；
25.图2为下光源装置中避光盒子的示意图；
26.图3为下光源装置中样品架的示意图；
27.图4为下光源装置中光源的示意图；
28.图5为采用自然光、上光源和下光源拍摄时，拍摄图像的灰度值数据；
29.图6为用下光源装置搭配的手机应用程序，对颜色数据进行识别、提取与定量分析的示意图；
30.图7为过氧化氢或葡萄糖的检测过程示意图；
31.图8为原始铁镍泡沫和铁镍泡沫模拟酶的扫描电镜图像；
32.图9为原始铁镍泡沫和铁镍泡沫模拟酶的原子力显微镜图像；
33.图10为原始铁镍泡沫和铁镍泡沫模拟酶的x射线衍射图；
34.图11为为原始铁镍泡沫和铁镍泡沫模拟酶在结合能为840～890ev时的xps光谱；
35.图12为原始铁镍泡沫和铁镍泡沫模拟酶在结合能为700～750ev时的xps光谱；
36.图13为不同温度下合成的模拟酶的吸光度数据的柱状图；
37.图14为不同气氛下合成的模拟酶的吸光度数据的柱状图；
38.图15为采用不同元素成分的泡沫合成的模拟酶的吸光度数据的柱状图；
39.图16为复合材料的扫描电镜图像；
40.图17分别为模拟酶和不同浓度的多巴胺反应得到的复合材料的吸光度数据的柱状图(a)、聚多巴胺纳米粒子增强模拟酶酶活性的原理图(b)、荧光光谱图(c)和过氧化物酶活性和氧化物酶活性的测试数据图(d)；
41.图18分别为采用酶标仪检测过氧化氢的吸收光谱图(a)和线性曲线图(b)；
42.图19为采用手机搭配手机应用程序检测过氧化氢的拍照图像和线性曲线；
43.图20为对检测过氧化氢过程中的缓冲溶液的ph值进行优化，得到的吸光度数据；
44.图21为对检测过氧化氢过程中的反应温度进行优化，得到的吸光度数据；
45.图22为对检测过氧化氢过程中的复合材料的用量进行优化，得到的吸光度数据；
46.图23为对检测过氧化氢过程中的反应时间进行优化，得到的吸光度数据；
47.图24为分别以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)和以h2o2为底物，对复合材料进行动力学测试的michaelis
–
menten曲线及其双倒数图；
48.图25为检测过氧化氢的选择性测试；
49.图26为复合材料的可重复利用性测试；
50.图27为集成酶材料的扫描电镜图像；
51.图28为不同葡萄糖氧化酶浓度的集成酶的吸光度数据的柱状图；
52.图29为采用酶标仪检测葡萄糖的吸收光谱图(a)和线性曲线(b)；
53.图30为采用手机拍照检测葡萄糖的拍照图像和线性曲线；
54.图31为对检测葡萄糖过程中的缓冲溶液的ph值进行优化，得到的吸光度数据图；
55.图32为对检测葡萄糖过程中的反应温度进行优化，得到的吸光度数据图；
56.图33为对检测葡萄糖过程中的集成酶的用量进行优化，得到的吸光度数据；
57.图34为对检测葡萄糖过程中的tmb浓度和反应时间进行优化，得到的吸光度数据；
58.图35为检测葡萄糖的选择性测试。
具体实施方式
59.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
60.本技术提供了一种基于铁镍泡沫的模拟酶，所述模拟酶的制备方法如下：
61.对铁镍泡沫进行煅烧，在铁镍泡沫表面形成褶皱形貌，物相发生转变，得到模拟酶。
62.具体而言，所述铁镍泡沫中铁和镍的质量比为1～5：1；优选为3：1，将铁镍泡沫在600～1200℃温度下进行煅烧，温度优选为850～1100℃，更优选为900℃、950℃、1000℃、1050℃或1100℃，在气体气氛中进行煅烧，优选在氮气气氛、氧气气氛或氢气气氛中煅烧，更优选为在氮气气氛中煅烧，煅烧1～5h，优选为煅烧2h，煅烧后在铁镍泡沫表面形成褶皱形貌，物相发生转变，得到模拟酶。
63.本技术提供了一种复合材料，包括上述制备方法制备的模拟酶和负载在所述模拟酶上的聚多巴胺纳米粒子。所述模拟酶和聚多巴胺的质量比为500：1～13.5：1，优选为300～100：1，聚多巴胺纳米粒子的粒径为100～300nm，优选为250nm。
64.本发明提供了一种上述复合材料的制备方法，包括以下步骤：将上述的模拟酶和多巴胺的缓冲溶液反应，得到复合材料。
65.具体而言，将模拟酶浸入到多巴胺的缓冲溶液中反应，模拟酶的尺寸为2～8mm
×
2～8mm
×
1mm，优选为2mm
×
2mm
×
1mm、5mm
×
2mm
×
1mm、5mm
×
5mm
×
1mm、5mm
×
8mm
×
1mm，更优选为5mm
×
2mm
×
1mm；多巴胺的浓度为0.5～4mg/ml，优选为0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml或4mg/ml，更优选为2mg/ml；缓冲溶液为碱性缓冲溶液，优选为ph值为8～9的缓冲溶液，
更优选为ph值为8.5的缓冲溶液，例如可以为tris-hcl溶液，tris-hcl溶液的浓度为8～12mmol/l，优选为10mmol/l；反应优选在室温下进行，反应时间为12～20h，优选为14～18h，更优选为16h。反应完成后，将复合材料与溶液进行分离，在一些可能的实现方式中，采用镊子将复合材料夹出进行分离，分离后用去离子水对复合材料进行洗涤，洗涤2～6次，优选洗涤3～4次。洗涤后进行干燥，优选在真空干燥箱进行干燥，真空干燥的温度为40～60℃，优选为50℃，干燥时间为6～12h，优选为8～10h，干燥后得到复合材料。
66.本发明提供了一种过氧化氢的检测方法，包括以下步骤：
67.将上述的复合材料与含有显色物质和过氧化氢的缓冲溶液混合反应，得到反应液，对反应液进行检测。
68.复合材料中的铁镍泡沫模拟酶和过氧化氢发生氧化还原反应，反应产生的羟基自由基能够与显色物质发生氧化还原反应，显色物质颜色发生变化，根据颜色的变化，可以对过氧化氢进行检测。
69.将复合材料与含有显色物质和过氧化氢的缓冲溶液混合反应，所述复合材料的尺寸为2～8mm
×
2～8mm
×
1mm，优选为2mm
×
5mm
×
1mm、5mm
×
5mm
×
1mm或8mm
×
5mm
×
1mm，所述显色物质优选为tmb，tmb在缓冲溶液中的浓度为0.5～2.0mmol/l，优选为1.0mmol/l；所述缓冲溶液为酸性缓冲溶液，优选为naac-hac缓冲溶液，缓冲溶液的ph值为3～5.5，优选为3.5；所述反应的温度为25～55℃，优选为37℃，反应的时间为1～6min，优选为2min。反应完成后，将反应溶液与反应后的复合材料进行分离，优选用镊子将反应后的复合材料夹出进行分离，对反应液进行检测。
70.本发明还提供了一种集成酶，包括上述复合材料和天然酶，所述天然酶选自葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、胆碱氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶和肌氨酸氧化酶中的一种或多种，优选为葡萄糖氧化酶。所述复合材料和天然酶的质量比为112.5：1～15：1，优选为30～100:1。
71.本发明提供了一种上述集成酶的制备方法，将上述复合材料和天然酶通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)进行缩合反应，得到集成酶。
72.具体而言，将复合材料与edc溶液、nhs溶液和葡萄糖氧化酶的缓冲溶液混合反应，所述复合材料的尺寸为2～8mm
×
2～8mm
×
1mm，优选为2mm
×
5mm
×
1mm、5mm
×
5mm
×
1mm或8mm
×
5mm
×
1mm；edc溶液的浓度为70～90mg/ml，优选为80mg/ml，nhs溶液的浓度为70～90mg/ml，优选为80mg/ml；在葡萄糖氧化酶的缓冲溶液中，葡萄糖氧化酶的浓度为12～25mg/ml，优选为18～22mg/ml，更优选为20mg/ml，所用的缓冲溶液优选为磷酸盐缓冲溶液，例如可以为磷酸钠缓冲溶液，缓冲溶液的浓度为8～12mmol/l，优选为10mmol/l，缓冲溶液的ph值为6～8，优选为7；edc溶液、nhs溶液和葡萄糖氧化酶的缓冲溶液的体积比为0.8～1.2：0.8～1.2：0.4～3.0，优选为1:1:2。反应优选在室温下进行，在一些可能的实现方式中，反应在旋转器上进行，反应时间为3～5h，优选为4h。反应完毕后，优选用镊子将集成酶与溶液进行分离，分离后用去离子水进行洗涤，洗涤2～5次，优选为洗涤3～4次，洗涤后得到集成酶。
73.本发明提供了一种葡萄糖的检测方法，包括以下步骤：将上述集成酶与显色物质和葡萄糖的缓冲溶液混合后反应，得到反应液，对所述反应液进行检测。
74.集成酶中的葡萄糖氧化酶与葡萄糖反应产生过氧化氢，过氧化氢进一步发生氧化还原反应产生羟基自由基，反应产生的羟基自由基能够与显色物质发生氧化还原反应，显色物质颜色发生变化，根据颜色的变化，可以对葡萄糖进行检测。
75.将集成酶与含有显色物质和葡萄糖的缓冲溶液混合反应，所述集成酶的尺寸为2～8mm
×
2～8mm
×
1mm，优选为2mm
×
5mm
×
1mm、5mm
×
5mm
×
1mm或8mm
×
5mm
×
1mm，所述显色物质优选为tmb，tmb在缓冲溶液中的浓度为0.8～1.2mmol/l，优选为1.0mmol/l；所述缓冲溶液为酸性缓冲溶液，ph值为3.5～5.5，优选为ph值为4，例如可以为naac-hac缓冲溶液，缓冲溶液的浓度为8～12mmol/l，优选为10mmol/l；所述反应的温度为25～60℃，优选为37℃，反应的时间为2～10min，优选为4min。反应完成后，将反应溶液与反应后的集成酶进行分离，优选用镊子将反应后的集成酶夹出进行分离，对反应液进行检测。
76.在检测过氧化氢的反应或葡萄糖的反应过程中，优选将过氧化氢的反应液或葡萄糖的反应液转移到下光源装置中进行检测，下光源装置示意图如图1所示，其中1为避光盒子，2为样品架，3为光源。所述样品架设置在所述避光盒子的内部，所述光源设置在所述样品架的底部。
77.避光盒子的示意图如图2所示，避光盒子包括盒体1，位于盒体1顶部的上方开口和凸起，其中，11为上方开口，用于安置智能手机的摄像头，12为上方开口旁的凸起，用于手机的定位和固定。在一些具体的实现方式中，避光盒子的尺寸可以为160～180mm
×
120～140mm
×
160～180mm，优选为170mm
×
130mm
×
170mm；在一些实施例中，上方开口的尺寸为35～45mm
×
35～45mm，优选为40mm
×
40mm。避光盒子还可以包括位于盒体的下方开口，13为下方开口(见图2)，用于穿过电源线。通过调研市面上10款不同品牌和型号的手机，得到了如表1所示的市面上手机的摄像头大小和焦距参数，根据两名志愿者的测量数据，发现焦距在110～140mm(表1)。因此，160～180mm的高度可以满足市面上大部分手机的对焦距离，35～45mm
×
35～45mm的上方开口可以放置大部分手机的摄像头，具有良好的普适性。
78.表1市面上手机的摄像头大小和焦距参数
[0079][0080]
样品架的示意图如图3所示，其中21为样品板，22为位于样品板上的样品孔。所述样品架优选为酶标板，更优选为可拆卸酶标板，在一些实施例中，所述酶标板为96孔可拆卸酶标板，96孔的可拆卸酶标板的规格优选为12
×
8，可以同时检测96个样品。
[0081]
所述光源包括白光led光珠和位于白光led光珠上方的柔光板，光源的装置示意图如图4所示，31为白光led光珠，32为位于白光led光珠上方的柔光板。在一些实施例中，白光led光珠的数量为96个，白光led光珠的位置与96孔板一一对应，每个白光led光珠的功率优
选为10～14w，更优选为12w，亮度10级可调。在一些实施例中，柔光板的材质为聚碳酸酯，柔光板用于阻隔减弱光线，将点光源变成面光源，使光源增大、光线更加均匀柔和。
[0082]
在下光源装置的上方开口放置手机时为一个暗室，打开电源根据实验要求调节亮度，手机自动对焦，摆正位置拍摄即可。分别在自然光、上光源和下光源条件下进行拍摄，对拍摄图像进行灰度值数据分析，结果如图5a所示，采用该下光源手机拍照装置拍摄获得的照片颜色均匀，孔与孔之间误差小，并且与位置呈现一定的周期规律性。而采用上光源装置拍摄获得的照片同样与位置呈现周期性规律，但因存在反光点导致个别孔出现较大误差。采用自然光为光源时，与孔位置无明显规律，但会随着拍摄位置的变化导致光线不同，从而使得同一个孔数据不重现(图5b)。
[0083]
在一些可能的实现方式中，采用酶标仪进行检测或采用搭配手机应用程序的智能手机拍摄反应液的图像进行检测，优选采用搭配手机应用程序智能手机拍摄图像进行检测。所述下光源装置搭配手机应用程序可实现对颜色数据的准确识别、提取与定量分析。手机应用程序界面清晰简单，有6个按钮，点击“select”按钮可调取图库中的图片，点击“model”按钮可进行h2o2，glucose和absorbance三种模式的选择，点击“fit”按钮可对每一行数据进行拟合，点击“rgb”按钮可查看每个样品孔的rgb值(如图6a所示)。手机应用程序在“absorbance”模式下检测的数据与台式酶标仪中absorbance数据保持一致(如图6b所示)。
[0084]
本技术提供了一种基于铁镍泡沫的模拟酶及其制备方法和应用，对铁镍泡沫进行煅烧，在铁镍泡沫表面形成褶皱形貌，得到具有过氧化物酶活性的模拟酶，该模拟酶呈块状便于与反应液分离。将所述模拟酶与聚多巴胺纳米粒子复合得到复合材料，聚多巴胺纳米粒子能够提高模拟酶的酶活性，得到的复合材料可用于检测过氧化氢，反应时间为2min。将复合材料通过edc/nhs方法与天然酶缩合可以得到集成酶，得到的集成酶可用于检测葡萄糖，反应时间为4min，过氧化氢或葡萄糖的检测过程示意图如图7所示，在所述过氧化氢或葡萄糖的检测过程中，采用智能手机及配套的下光源装置进行检测，整体检测时间小于10min。
[0085]
实施例1
[0086]
组装下光源装置，下光源装置包括避光盒子、样品架和光源。
[0087]
避光盒子的尺寸为170mm
×
130mm
×
170mm，避光盒子的顶部有一个尺寸为40mm
×
40mm的上方开口，用于安置智能手机的摄像头；上方开口旁有一个凸起，用于手机的定位和固定；避光盒子的下部有一个下方开口，用于穿过电源线。样品架为96孔的可拆卸酶标板，规格为12
×
8。光源包括96个白光led光珠和位于白光led光珠上方的柔光板，白光led光珠的位置与96孔可拆卸酶标板一一对应，每个白光led光珠的功率为12w,亮度10级可调。
[0088]
在下光源装置的上方开口放置手机时为一个暗室，打开电源根据实验要求调节亮度，手机自动对焦，摆正位置拍摄即可。上述下光源装置搭配手机应用程序可实现对颜色数据的准确识别、提取与定量分析。手机应用程序界面清晰简单，有6个按钮，点击“select”按钮可调取图库中的图片，点击“model”按钮可进行h2o2，glucose或absorbance三种模式的选择，点击“fit”按钮可对每一行数据进行拟合，点击“rgb”按钮可查看每个样品孔的rgb值。
[0089]
实施例2
[0090]
将尺寸为(50mm
×
5mm
×
1mm)铁镍泡沫放置在石英舟中，在氮气气氛下，以10℃/
min的加热速度升温至850℃并保持2h，自然冷却至室温，得到表面为褶皱形貌的铁镍泡沫模拟酶材料。
[0091]
实施例3
[0092]
与实施例2的区别在于升温至900℃。
[0093]
实施例4
[0094]
与实施例2的区别在于升温至950℃。
[0095]
实施例5
[0096]
与实施例2的区别在于升温至1000℃。
[0097]
采用扫描电镜对原始铁镍泡沫和实施例5得到的模拟酶材料进行表征，扫描电镜图片如图8所示，由图8可知，表面为褶皱形貌的铁镍泡沫模拟酶材料成功合成。
[0098]
采用原子力显微镜对原始铁镍泡沫和实施例5得到的模拟酶材料进行表征，原子力显微镜图片如图9所示，由图9可知，煅烧之后，模拟酶材料表面产生褶皱，粗糙度为8.94nm。
[0099]
采用x射线衍射对原始铁镍泡沫和实施例5得到的模拟酶材料进行表征，x射线衍射结果如图10所示，由图10可知，原始铁镍泡沫有铁纹石(jcpds no.37-0474)和镍纹石(jcpds no.47-1417)两种物相，煅烧后，镍纹石发生相变衍射峰消失，只有铁纹石一种物相。采用x射线光电子能谱仪对原始铁镍泡沫和实施例5得到的模拟酶材料分别进行表征，xps光谱如图11～12所示，其中图11为结合能840～890ev时的xps光谱，图12为结合能700～750ev时的xps光谱。由图11可知，原始铁镍泡沫在1000℃煅烧后得到的feni-1000模拟酶，feni-1000材料因镍纹石发生相变，ni 2p的xps光谱消失，相应的，fe 2p的xps光谱得到增强(见图12)。通过多重峰分析，模拟酶中fe
2+
和fe
3+
同时存在。
[0100]
实施例6
[0101]
与实施例2的区别在于升温至1050℃。
[0102]
实施例7
[0103]
与实施例2的区别在于升温至1100℃。
[0104]
通过对实施例2～7得到的模拟酶材料进行吸光度测试，考察模拟酶材料的过氧化物酶活性，吸光度越大，表明过氧化物酶活性越好。将实施例2～7得到的模拟酶材料分别加入到含有1.0mmol/l h2o2、1.0mmol/l tmb的1.0ml naac-hac缓冲溶液(10mm，ph 3.5)中，在37℃温度下孵育2min，将得到的溶液在652nm处进行吸光度测试，测试结果见图13，由图13可知，在温度为1000℃时，吸光度大于1.6。
[0105]
实施例8
[0106]
与实施例5的区别在于在氢气气氛下通气。
[0107]
实施例9
[0108]
与实施例5的区别在于在氧气气氛下通气。
[0109]
对实施例5、8、9得到的模拟酶材料进行过氧化物酶活性测试，将实施例5、8、9得到的模拟酶材料分别加入到含有1.0mmol/l h2o2、1.0mmol/l tmb的1.0ml naac-hac缓冲溶液(10mm，ph 3.5)，在37℃温度下孵育2min，将得到的溶液在652nm处进行吸光度测试，测试结果见图14，由图14可知，在氮气气氛下，吸光度大于1.6。
[0110]
实施例10
[0111]
与实施例5的区别在于采用的泡沫材料不含镍。
[0112]
实施例11
[0113]
与实施例5的区别在于采用的泡沫材料不含铁。
[0114]
实施例12
[0115]
与实施例5的区别在于采用的泡沫材料含铜、不含铁和不含镍。
[0116]
对实施例5、10～12得到的模拟酶材料进行过氧化物酶活性测试，将实施例5、10～12得到的模拟酶材料分别加入到含有1.0mmol/l h2o2、1.0mmol/l tmb的1.0ml naac-hac缓冲溶液(10mmol/l，ph 3.5)中，在37℃温度下孵育2min，将得到的溶液在652nm处进行吸光度测试，测试结果见图15，由图15可知，不加泡沫材料的空白组吸光度值小于0.25，铁镍泡沫实验组的吸光度值大于2.0。
[0117]
实施例13
[0118]
在室温条件下，将实施例5制备的模拟酶材料浸入含有0.5mg/ml多巴胺的7ml tris-hcl缓冲溶液(10mmol/l，ph 8.5)中，反应16h，得到负载有聚多巴胺纳米粒子的模拟酶材料，用镊子将其与溶液分离，用水洗涤3次，在50℃温度下真空干燥过夜，得到聚多巴胺纳米粒子-模拟酶复合材料。
[0119]
实施例14
[0120]
与实施例13的区别在于多巴胺的浓度为1.0mg/ml。
[0121]
实施例15
[0122]
与实施例13的区别在于多巴胺的浓度为2.0mg/ml。
[0123]
采用扫描电镜对实施例15得到的复合材料进行表征，扫描电镜图片如图16所示，由图16可知，大量粒径约为250nm的纳米粒子分布在模拟酶的表面，表明复合材料成功合成。
[0124]
实施例16
[0125]
与实施例13的区别在于多巴胺的浓度为3.0mg/ml。
[0126]
实施例17
[0127]
与实施例13的区别在于多巴胺的浓度为4.0mg/ml。
[0128]
将实施例5、实施例13～17的产物进行过氧化物酶活性测试，将实施例5、实施例13～17得到的产物分别加入到含有1.0mmol/l h2o2、1.0mmol/l tmb的1.0ml naac-hac缓冲溶液(10mm，ph 3.5)中，在37℃温度下孵育2min，将得到的溶液在652nm处进行吸光度测试，测试结果见图17(a)，由图17(a)可知，将聚多巴胺纳米粒子与模拟酶复合，能够显著提高模拟酶材料的过氧化物酶活性。图17(b)为聚多巴胺纳米粒子增强模拟酶材料的过氧化物酶活性的原理图，由图17(b)可知聚多巴胺纳米粒子表面的儿茶酚基团可以加速fe
3+
还原为fe
2+
，提高反应体系中过氧化氢转化为羟基自由基的速率，本身转化为醌式结构，而醌式结构可以在酸性条件下转化为儿茶酚基团，继续参与fe
3+
还原为fe
2+
的反应。因此，聚多巴胺纳米粒子表面儿茶酚基团与醌式结构之间的转换可以加速电子和质子的转移，从而提升模拟酶的催化活性。
[0129]
图17(c)是对苯二甲酸(ta)作为荧光探针验证反应体系生成羟基自由基，对ta、ta+h2o2、ta+h2o2+复合材料采集荧光光谱，所述复合材料选自dfeni-1000，ta和ta+h2o2的反应体系在435nm处没有发射峰，ta+h2o2+复合材料的体系在435nm处有发射峰，并且h2o2浓度越
高，435nm处发射峰的峰值越大，说明产生的羟基自由基越多。实验结果表明，复合材料与h2o2发生催化反应时生成了羟基自由基。
[0130]
对实施例15得到的聚多巴胺纳米粒子-模拟酶复合材料进行过氧化物酶活性和氧化物酶活性的测试，氧化酶活性的测试为复合材料直接氧化tmb显色，过氧化物酶活性的测试为在过氧化氢存在的条件下复合材料氧化tmb显色。测试结果如图17(d)所示，由图17(d)可知，在不存在h2o2的反应体系中聚多巴胺纳米粒子-模拟酶复合材料不能直接氧化tmb显色，说明复合材料的氧化酶活性较弱，相应的，复合材料的过氧化物酶活性较强。
[0131]
实施例18
[0132]
将实施例15得到的聚多巴胺纳米粒子-模拟酶复合材料(dfeni-1000)用于检测h2o2，将dfeni-1000(尺寸为5mm
×
2mm
×
1mm)与1ml含有1.0mmol/l的tmb和h2o2的naac-hac缓冲溶液(10mmol/l，ph 3.5)混合，h2o2的浓度分别为0mmol/l、0.05mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l和0.4mmol/l，在37℃下反应2min，分别取100μl溶液转移到实施例1所述的下光源装置中的96孔板中，通过酶标仪进行检测，同时使用智能手机拍摄图像，通过实施例1所述的手机应用程序进行检测。
[0133]
采用酶标仪测试的结果见图18，由图18(a)可知，在h2o2浓度为0～0.4mmol/l时，随着h2o2浓度变大，底物氧化物tmb
ox
在652nm处的吸收值逐渐增大。在h2o2浓度为0～0.3mmol/l时，吸收值与h2o2浓度呈现线性关系(如图18(b)所示)，线性方程为y＝5.99x+0.16(r2＝0.997)，检出限为14.1μm。
[0134]
采用智能手机拍照获得样品照片(如图19所示)，通过实施例1中的手机应用程序进行样品孔颜色提取与分析，建立g值与h2o2浓度之间的关系，在h2o2浓度为0～0.3mmol/l时，g值与h2o2浓度呈现线性相关(如图19所示)，符合方程y＝-207x+226(r2＝0.993)，检出限为10.2μm，整体检测时间小于10min，检测结果与酶标仪结果一致。
[0135]
实施例19
[0136]
对检测h2o2过程中的缓冲溶液的ph值进行优化，将dfeni-1000(尺寸为5mm
×
2mm
×
1mm)与1ml含有1.0mmol/l的tmb和2.5mmol/l h2o2的naac-hac缓冲溶液(10mmol/l)混合，缓冲溶液的ph值分别为3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，在37℃下反应2min，分别取100μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，测试结果如图20所示，由图20可知，在ph值为3.5时，吸收值最大。
[0137]
实施例20
[0138]
对检测h2o2过程中的反应温度进行优化，将dfeni-1000(尺寸为5mm
×
2mm
×
1mm)与1ml含有1.0mmol/l的tmb和2.5mmol/l h2o2的naac-hac缓冲溶液(10mmol/l，ph 3.5)混合，分别在25℃、30℃、37℃、42℃、50℃、55℃温度下反应，反应时间为2min，分别取100μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，测试结果如图21所示，由图21可知，在反应温度为37℃时，吸收值最大。
[0139]
实施例21
[0140]
对检测h2o2过程中dfeni-1000的用量进行优化，将dfeni-1000与1ml含有1.0mmol/l的tmb和2.5mmol/lh2o2的naac-hac缓冲溶液(10mmol/l，ph 3.5)混合，dfeni-1000的尺寸分别为0mm
×
0mm
×
0mm、2mm
×
2mm
×
1mm、5mm
×
2mm
×
1mm、5mm
×
5mm
×
1mm、5mm
×
8mm
×
1mm，在37℃下反应2min，分别取100μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，测试结果如
图22所示，由图22可知，在dfeni-1000的尺寸为5mm
×
2mm
×
1mm时，吸收值最大。
[0141]
实施例22
[0142]
对检测h2o2过程中的反应时间进行优化，将dfeni-1000(尺寸为5mm
×
2mm
×
1mm)与1ml含有1.0mmol/l的tmb和2.5mmol/lh2o2的naac-hac缓冲溶液(10mmol/l，ph 3.5)混合，在37℃温度下反应，反应时间分别为0min、1min、2min、3min、4min、5min、6min，分别取100μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，测试结果如图23所示，由图23可知，在反应时间为2min后，吸收值变化趋于平稳。
[0143]
实施例23
[0144]
分别以tmb和以h2o2为底物，对dfeni-1000复合材料进行了动力学测试。
[0145]
在含有1.0mmol/l h2o2、tmb和dfeni-1000(5mm
×
2mm
×
1mm)的1.0ml naac-hac缓冲溶液(10mmol/l，ph 3.5)的反应体系中进行dfeni-1000的过氧化物酶活性的动力学测试，tmb的浓度分别为0、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.4mmol/l、0.6mmol/l、0.8mmol/l、1.0mmol/l、1.2mmol/l和1.4mmol/l，测试获得michaelis
–
menten曲线(图24(a))及其双倒数图(图24(c))，分析计算可得，以tmb为底物时，km和v
max
分别为34.1mmol/l和6.49
×
10-6
m/s。
[0146]
在含有h2o2、1.0mmol/l tmb和dfeni-1000(5mm
×
2mm
×
1mm)的1.0ml naac-hac缓冲溶液(10mmol/l，ph 3.5)的反应体系中进行dfeni-1000的过氧化物酶活性的动力学测试，h2o2的浓度分别为0、0.05mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.3mmol/l、0.4mmol/l、0.5mmol/l、0.6mmol/l，测试获得michaelis
–
menten曲线(图24(b))及其双倒数图(图24(d))，分析计算可得，以h2o2为底物时，km值和v
max
值分别为4.71mmol/l和3.52
×
10-6
m/s，该结果表明，dfeni-1000与hrp对h2o2具有相当的底物亲和力，反应速率比hrp和其他模拟酶材料高两个数量级，dfeni-1000优异的催化活性归因于fe
3+
/fe
2+
和邻苯二酚/醌之间的循环，铁和镍之间的协同作用，以及dfeni-1000表面存在丰富的含氧基团。
[0147]
实施例24
[0148]
将dfeni-1000(5mm
×
2mm
×
1mm)与1ml含有1.0mm tmb的naac-hac缓冲溶液(10mmol/l，ph 3.5)混合，分别加入1.0mmol/l的h2o2、多巴胺、抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖、mn
2+
、zn
2+
、ca
2+
，混合均匀，在37℃下反应2min。分别取100μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，平行取100μl溶液转移到96孔可拆卸酶标板中，使用智能手机拍摄图像，通过实施例1中的手机应用程序进行测试，检测结果如图25所示，多巴胺、抗坏血酸、柠檬酸、葡萄糖、mn
2+
、zn
2+
、ca
2+
在反应体系中的响应信号很低，对h2o2的检测影响小，说明该方法具有良好的选择性。
[0149]
实施例25
[0150]
将dfeni-1000材料重复使用10次后进行过氧化物酶活性的测试，测试过程与实施例17相同，测试结果见图26，由图26可知，重复使用10次，dfeni-1000材料的过氧化酶活性保持在初始活性的83.0％，表明该材料具有优异的可重复利用性。
[0151]
实施例26
[0152]
选择约含3.5％h2o2的隐形眼镜护理液作为实际样品，隐形眼镜护理液中h2o2的浓度约为1.16mol/l，分别稀释至0.05、0.1和0.3mmol/l。采用实施例18中的方法检测稀释的镜片护理液中的h2o2，通过酶标仪进行检测，同时使用智能手机拍摄图像，通过实施例1中的
手机应用程序进行测试，计算回收率，回收率结果如表2所示，由表2可知，两种检测方法均获得了良好的回收率。
[0153]
表2手机与酶标仪检测镜片护理液中h2o2含量结果对比
[0154][0155]
实施例27
[0156]
将dfeni-1000(5mm
×
5mm
×
1mm)与含有20mg/ml的edc、20mg/ml的nhs和2mg/ml葡萄糖氧化酶(gox)的200μl磷酸盐缓冲液(10mm，ph 7.0)在室温下混合，得到混合溶液，将混合溶液在旋转器上反应4h，获得缩合gox的集成酶材料(gdfeni-1000)，通过镊子与溶液分离，用水彻底洗涤以供进一步使用。
[0157]
实施例28
[0158]
与实施例27的区别在于，gox的浓度为4mg/ml。
[0159]
实施例29
[0160]
与实施例27的区别在于，gox的浓度为6mg/ml。
[0161]
实施例30
[0162]
与实施例27的区别在于，gox的浓度为8mg/ml。
[0163]
实施例31
[0164]
与实施例27的区别在于，gox的浓度为10mg/ml。
[0165]
采用扫描电镜对实施例31得到的集成酶材料进行表征，扫描电镜图片如图27所示，由图27可知缩合gox之后纳米粒子的尺寸增大了42nm，表明集成酶材料成功合成。
[0166]
实施例32
[0167]
与实施例27的区别在于，gox的浓度为15mg/ml。
[0168]
对实施例27～32的集成酶材料进行过氧化物酶活性测试，将27～32制备的集成酶材料分别加入到含有1.0mmol/l h2o2、1.0mmol/l tmb的1.0ml naac-hac缓冲溶液(10mm，ph 4)，在37℃温度下孵育4min，将得到的溶液在652nm处进行吸收值测试，测试结果见图28，由图28可知，在gox的浓度大于10mg/ml时，吸收值大于1.2。
[0169]
实施例33
[0170]
将实施例31得到的集成酶材料gdfeni-1000用于检测葡萄糖，将gdfeni-1000(5mm
×
5mm
×
1mm)与1ml含有1.0mm tmb和葡萄糖的naac-hac缓冲溶液(10mm，ph 4)混合，葡萄糖的浓度分别为0mmol/l、0.1mmol/l、0.2mmol/l、0.6mmol/l、1mmol/l、2mmol/l和3mmol/l，在37℃下反应4min，分别取200μl溶液转移到96孔板中，通过酶标仪进行检测，同时使用智能手机拍摄图像，通过实施例1中的手机应用程序进行测试。
[0171]
采用酶标仪测试的结果见图29，由图29(a)可知，在葡萄糖浓度为0～3mmol/l时，随着葡萄糖浓度变大，底物氧化物tmb
ox
在652nm处的吸收值逐渐增大。在葡萄糖浓度为0.1～2.0mmol/l时，吸收值与h2o2浓度呈现线性关系(如图29(b)所示)，线性方程为y＝0.81x+0.27(r2＝0.998)，检出限为37.0μm。
[0172]
采用智能手机拍照获得样品照片(如图30所示)，通过实施例1中的手机应用程序进行样品孔颜色提取与分析，建立g值与葡萄糖浓度之间的关系，在葡萄糖浓度为0.1～2.0mmol/l时，g值与葡萄糖浓度呈现线性相关(如图30所示)，符合方程y＝-24.6x+215(r2＝0.985)，检出限为40.6μm，整体检测时间小于10min，检测结果与酶标仪结果基本一致。
[0173]
实施例34
[0174]
对检测葡萄糖过程中的缓冲溶液的ph值进行优化，将gdfeni-1000(5mm
×
5mm
×
1mm)与1ml含有1.0mm tmb和5mmol/l葡萄糖的naac-hac缓冲溶液(10mm)混合，缓冲溶液的ph值分别为3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7，在37℃下反应4min，分别取200μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，测试结果如图31所示，由图31可知，在ph值为4时，吸收值最大。
[0175]
实施例35
[0176]
对检测葡萄糖过程中的反应温度进行优化，将gdfeni-1000(5mm
×
5mm
×
1mm)与1ml含有1.0mm tmb和5mmol/l葡萄糖的naac-hac缓冲溶液(10mm，ph 4)混合，分别在25℃、30℃、37℃、42℃、50℃、55℃、60℃温度下反应，反应时间为4min，分别取200μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，测试结果如图32所示，由图32可知，在反应温度为37℃时，吸收值变化趋于稳定。
[0177]
实施例36
[0178]
对检测葡萄糖过程中的gdfeni-1000的用量进行优化，将gdfeni-1000与1ml含有1.0mm tmb和5mmol/l葡萄糖的naac-hac缓冲溶液(10mm，ph 4)混合，gdfeni-1000的尺寸分别为2mm
×
5mm
×
1mm、5mm
×
5mm
×
1mm、8mm
×
5mm
×
1mm，在37℃温度下反应，反应时间为4min，分别取200μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，测试结果如图33所示。
[0179]
实施例37
[0180]
对检测葡萄糖过程中的tmb浓度和反应时间进行优化，将gdfeni-1000(尺寸为5mm
×
5mm
×
1mm)与1ml含有tmb和1mmol/l葡萄糖的naac-hac缓冲溶液(10mm，ph 4)混合，tmb的浓度分别为0.1mmol/l、0.5mmol/l、1.0mmol/l，在37℃温度下反应，反应时间分别为0min、2min、4min、6min、8min、10min，分别取200μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，测试结果如图34所示。
[0181]
实施例38
[0182]
将gdfeni-1000(5mm
×
5mm
×
1mm)与1ml含有1.0mm tmb的的naac-hac缓冲溶液(10mm，ph 4)混合，分别加入5.0mmol/l的葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖和麦芽糖，混合均匀，在37℃下反应4min，分别取200μl溶液转移到96孔板中，采用酶标仪进行检测，分别取200μl溶液转移到96孔板中，使用智能手机拍摄图像，通过实施例1中的手机应用程序进行检测，检测结果如图35所示，乳糖、蔗糖、果糖和麦芽糖在反应体系中的响应信号很低，对葡萄糖的检测影响小，说明该方法具有良好的选择性。
[0183]
实施例39
[0184]
以人尿液为实际样品，将人尿液以10000rpm的速度离心10min，在50℃下保持
30min，用0.22μm过滤器过滤两次，消除坏死的上皮细胞和蛋白质等杂质，将尿液稀释至原尿液的1.5％，并且分别加入0.2mmol/l、0.6mmol/l和1.0mmol/l葡萄糖标准品，再加入含有1.0mm tmb和gdfeni-1000(5mm
×
5mm
×
1mm)的naac-hac缓冲溶液(10mmol/l，ph 4)混合，在37℃下反应4min。通过酶标仪进行检测，同时使用智能手机拍摄图像，通过实施例1中的手机应用程序进行检测，计算回收率，其中，尿液中的实际葡萄糖含量由碧云天品牌葡萄糖检测试剂盒测定，利用1.5％尿液中的葡萄糖含量为1.74μmol/l对回收率数据进行校正。回收率结果如表3所示，由表3可知，两种检测方法均获得了良好的回收率。
[0185]
表3手机与酶标仪检测尿液中葡萄糖含量结果对比
[0186][0187]
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种基于铁镍泡沫的模拟酶的制备方法，其特征在于，对铁镍泡沫进行煅烧，得到模拟酶。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述煅烧的温度为600～1200℃，煅烧的时间为1～5h。3.一种复合材料，其特征在于，包括权利要求1～2任意一项所述的制备方法制备的模拟酶，和负载在所述模拟酶上的聚多巴胺纳米粒子。4.根据权利要求3所述的复合材料，其特征在于，所述模拟酶和聚多巴胺纳米粒子的质量比为500：1～13.5：1，所述聚多巴胺纳米粒子的粒径为100～300nm。5.一种集成酶，其特征在于，包括天然酶和权利要求3～4任意一项所述的复合材料。6.根据权利要求5所述的集成酶，其特征在于，所述复合材料和天然酶的质量比为112.5：1～15：1。7.根据权利要求5所述的集成酶，其特征在于，所述天然酶选自葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、胆碱氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶和肌氨酸氧化酶中的一种或多种。8.一种过氧化氢的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将权利要求3或4所述的复合材料与过氧化氢和显色物质在缓冲溶液中混合后反应，得到反应液；(b)对所述反应液进行检测。9.一种葡萄糖的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)将权利要求5～7任意一项所述的集成酶与葡萄糖和显色物质在缓冲溶液中混合后反应，得到反应液；(b)对所述反应液进行检测。10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述检测为将反应液转移至下光源装置进行检测；所述下光源装置包括避光盒子，设置在所述避光盒子内部的样品架；设置在所述样品架底部的光源；所述光源包括白光led光珠和位于白光led光珠上方的柔光板。

技术总结
本申请提供了一种基于铁镍泡沫的模拟酶及其制备方法，对铁镍泡沫进行煅烧，得到模拟酶，该模拟酶因煅烧形成褶皱形貌且便于与反应液分离。将所述模拟酶与聚多巴胺纳米粒子复合得到复合材料，可用于检测过氧化氢，将复合材料进一步与天然酶缩合得到集成酶，可用于检测葡萄糖，在过氧化氢或葡萄糖的比色检测过程中，采用智能手机及配套的下光源装置进行检测，整体检测时间小于10min。整体检测时间小于10min。整体检测时间小于10min。


技术研发人员：张玉 杜衍 逯乐慧 栾天
受保护的技术使用者：中国科学院长春应用化学研究所
技术研发日：2023.05.30
技术公布日：2023/8/28