一种结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体及其应用的制作方法

1.本说明书涉及生物医药技术领域，特别涉及一种结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体及其应用。


背景技术：

2.幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种革兰氏阴性微需氧杆菌，能在强酸环境(例如，胃酸)下生存的。幽门螺旋杆菌感染与多种消化道疾病密切相关，例如，幽门螺旋杆菌感染是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要致病因素。又例如，幽门螺旋杆菌感染与胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关。
3.幽门螺旋杆菌对临床微生物实验中常用于鉴定肠道细菌的大多数经典生化实验不起反应。尿素酶是幽门螺旋杆菌生化鉴定的主要依据之一，临床上可以通过基于尿素酶的侵入性检测(例如，快速尿素酶实验等)和非侵入性检测(例如，尿素呼气实验、血清免疫学检测等)来诊断幽门螺旋杆菌感染。以针对尿素酶的血清免疫学检测为例，其通过测定血清中的幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶来检测幽门螺旋杆菌感染。与作为幽门螺旋杆菌检测金标准的组织学切片和组织化学染色镜检相比，针对尿素酶的血清免疫学检测方法在特异性和灵敏度方面还有提升空间。此外，针对尿素酶的血清学检测方法可能对已有症状的感染者无检测反应。因此，有必要提供一种能够特异性结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体。


技术实现要素：

4.根据本说明书的第一方面，提供一种结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段。所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区。其中，重链可变区包括氨基酸序列如seq id no:2所示的cdrh1、氨基酸序列如seq id no:3所示的cdrh 2和氨基酸序列如seq id no:4所示的cdrh3。轻链可变区包括氨基酸序列如seq id n o:6所示的cdrl1、氨基酸序列为dts的cdrl2和氨基酸序列如seq id no:7所示的cdrl3。
5.在一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示。
6.在一些实施例中，所述抗体为鼠源抗体、兔源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
7.在一些实施例中，所述抗体为单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
8.在一些实施例中，所述抗原结合片段选自下组：fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、d sfv、dab。
9.根据本说明书的第二方面，提供一种核酸分子。所述核酸分子包含编码如前文所述的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。
10.在一些实施例中，所述核酸分子包括编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列。其中，编码重链可变区的核苷酸序列包括如seq id no:9所示的cdrh1的编码序列、如seq id no:10所示的cdrh2的编码序列和如seq id no:11所示的c drh3的
编码序列。编码轻链可变区的核苷酸序列包括如seq id no:13所示的cdrl1的编码序列、序列为gacacatcc的cdrl2的编码序列和如seq id no:14所示的cdrl 3的编码序列。
11.在一些实施例中，所述编码vh的核苷酸序列如seq id no:8所示；所述编码轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:12所示。
12.根据本说明书的第三方面，提供一种重组载体。所述重组载体包括如前文所述所述的核酸分子。
13.根据本说明书的第四方面，提供一种宿主细胞。所述宿主细胞包括如前文所述的核酸分子或者重组载体。
14.根据本说明书的第五方面，提供一种药物组合物。所述药物组合物包括如前文所述的抗体或抗原结合片段。
15.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段偶联药物化合物或肽。
16.根据本说明书的第六方面，提供如前文所述的抗体或抗原结合片段、核酸分子、重组载体、宿主细胞或者药物组合物在制备用于治疗幽门螺旋杆菌感染的药物中的应用。
17.根据本说明书的第七方面，提供一种检测幽门螺旋杆菌的试剂盒。所述试剂盒包含如前文所述的抗体或抗原结合片段。
18.根据本说明书的第八方面，提供如前文所述的抗体或抗原结合片段、核酸分子、重组载体或者宿主细胞在制备用于检测幽门螺旋杆菌的试剂盒中的应用。
具体实施方式
19.应当理解，尽管术语“第一”、“第二”、“第三”等可以在本文中用于描述各种元素，但这些元素不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个元素与另一个元素区分开来。例如，第一产物可以被称为第二产物，并且类似地，在不脱离本说明书的示例性实施例的范围的情况下，第二产物可以被称为第一产物。
20.如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
21.除另有定义外，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
22.本说明书提供一种结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段。具体的，可以使用幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶免疫balb/c小鼠，通过特异性的高通量筛选得到具有高度特异性的杂交瘤细胞，通过培养和再免疫获得大量小鼠腹水，再经多步分离及纯化获得高纯度、高灵敏度和高特异性的抗幽门螺旋杆菌尿素酶的单克隆抗体。一方面，本说明书提供的抗体或抗原结合片段与幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶具有良好的特异性结合能力，将其应用在各类免疫学检测方法中，可提高对应检测方法的灵敏度和特异性。本说明书提供的抗体或抗原结合片段可以为开发检测幽门螺旋杆菌尿素酶的免疫学检测方法或产品提供所需的原料。另一方面，本说明书提供的抗体或抗原结合片段可以为开发治疗幽门螺旋杆菌感染的新药提供支持。例如，本说明书提供的抗体或抗原结合片段可用于研发、制备抗体药物偶联物(adc)，为降低、延缓药物治疗的耐药性提供可能性。
23.本说明书一些实施例提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶。所述抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区。其中，重链可变区包括三个互补决定区，即cdrh1、cdrh2和cdrh3；轻链可变区包括包括三个互补决定区，即cdrl1、cdrl2和cdrl3。
24.如本文所用，术语“抗体”或“ab”是指包含至少一条免疫球蛋白重链(hc)和至少一条免疫球蛋白轻链(lc)的分子。每个重链可包括重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)，重链可变区具有3个互补决定区(cdr)和4个框架区(fr)。每个轻链可包括轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)，轻链可变区具有3个互补决定区和4个框架区。根据vh抗原性的不同，抗体可分为igm、igg、iga、igd和ige。在一些实施例中，抗体包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、二聚抗体、三聚抗体和多聚抗体等。
25.术语“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。抗原结合片段的非限制性实例包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、cdr片段、单链抗体(例如，scfv或dsfv)、双抗体片段(dab)、单域抗体(sdab)和纳米抗体(nb)等。
26.术语“cdr”或称“互补决定区”是指抗体特异性识别抗原的区域。
27.在一些实施例中，cdrh1的氨基酸序列为dytftnsw(seq id no:2)。cdrh 2的氨基酸序列为inpstgst(seq id no:3)。cdrh3的氨基酸序列为aseeydgfdy(seq id no:4)。
28.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列为pgasvk mscrasdytftnswmhwvkqrpgqglewvgyinpstgstdynqkfrdkatltadkssst aymqlssltsedsavyycaseeydgfdywgqgttltvss(seq id no:1)。
29.在一些实施例中，所述重链可变区中可以含有不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。如本文所用，术语“保守取代”是指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质的氨基酸取代。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和pcr介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如，具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。
30.在一些实施例中，所述重链可变区具有与如seq id no:1所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。在一些实施例中，所述重链可变区具有与如seq id no:1所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或
多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
31.在一些实施例中，cdrl1的氨基酸序列为ssiiym(seq id no:6)。cdrl2的氨基酸序列为dts。cdrl3的氨基酸序列为qqwssspyt(seq id no:7)。
32.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列为divitqsp aimsaspgekvtmtcsanssiiymhwyqqksgtspkrwiydtsklasgvparfsgsgsgts ysltissmeaedaatyycqqwssspytfgggtkleik(seq id no:5)。
33.在一些实施例中，所述轻链可变区中可以含有不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。在一些实施例中，所述轻链可变区具有与如seq id no:5所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述轻链可变区具有与如seq id no:5所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
34.本说明书实施例提供的抗体可以来源于同一物种。在一些实施例中，所述抗体可以为鼠源抗体或者兔源抗体。本说明书实施例提供的抗体也可以来源于不同物种。在一些实施例中，所述抗体可以为嵌合抗体或人源化抗体。
35.如本文所用，“嵌合抗体”是指由某一物种抗体的可变区与另一物种抗体的恒定区融合而成的抗体。嵌合抗体具有降低异源抗体免疫原性的特点。在一些实施例中，嵌合抗体的可变区可为兔源或鼠源，嵌合抗体的恒定区可为人源。术语“人源化抗体”是指经基因工程改造的包含人源抗体序列和非人源抗体序列的抗体形式。在一些实施例中，人源化抗体的全部或部分cdr区来自于非人源(例如，鼠源或兔源)抗体，人源化抗体的全部或部分的非cdr区(例如，恒定区和可变区框架)来自于人源抗体。
36.在一些实施例中，所述抗体可以是单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。本领域技术人员可根据应用需要来确定抗体可识别的抗原表位的数量和类别。
37.在一些实施例中，所述抗原结合片段选自下组：fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、d sfv和dab。
38.如本文所用，术语“fab”是指由vl、vh、cl和ch1区组成的抗体片段。术语“f(a b’)2”是指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段。术语“fab
’”
是指还原连接f(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获的片段，由一条完整的轻链和重链的fd片段(由vh和ch1区组成)组成。术语“fv”是指由抗体的单臂的vl和vh区组成的抗体片段。fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个cdr赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如fd片段，其仅含有三个对抗原特异的cdr)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。术语“scfv”是指由抗体vh和vl区通过短接头连接而成的抗体片段，其不含fc片段。术语“dsf v”是指通过链间二硫键连接fv的抗体片段，又称二硫键稳定性抗体。术语“dab”是指由vh区组成的抗体片段。
39.制备抗体的方法对于本领域技术人员而言应该是已知的。例如，杂交瘤技术，或者以编码抗体的基因作为起始材料，利用重组dna技术在体外生产抗体。制备抗原结合片段的方法对于本领域技术人员而言应该是已知的。例如，可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。
40.本说明书一些实施例还提供了一种分离的核酸分子。所述核酸分子可包括编码前
文所述结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。在一些实施例中，所述核酸分子可以包括编码所述抗体或抗原结合片段的重链可变区的核苷酸序列，以及编码所述抗体或抗原结合片段的轻链可变区的核苷酸序列。
41.在一些实施例中，编码重链可变区的核苷酸序列可包括重链可变区cdrh1、cdrh2和cdrh3的编码序列。其中，cdrh1的编码序列为gactacacctttactaactcctgg(seq id no:9)。cdrh2的编码序列为attaatcctagcactggttctact(seq id no:10)。cdrh3的编码序列为gcaagcgaggagtacgacggctttgactac(seq id no:11)。
42.在一些实施例中，编码重链可变区的核苷酸序列为cctggggcctcagtgaagatg tcctgcagggcttctgactacacctttactaactcctggatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatgggttggatacattaatcctagcactggttctactgactacaatcagaagttcagggacaaggccactttgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagcgaggagtacgacggctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(seq id no:8)。在另一些实施例中，与如seq id no:8所示的序列相比，编码重链可变区的核苷酸序列具有在框架区编码序列中具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
43.在一些实施例中，编码轻链可变区的核苷酸序列可包括轻链可变区cdrl1、cdrl2和cdrl3的编码序列。其中，cdrl1的编码序列为tcaagtataatttac(seq id no:13)。cdrl2的编码序列为gacacatcc。cdrl1的编码序列为cagcagtggagtagt agcccgtacacg(seq id no:14)。
44.在一些实施例中，编码轻链可变区的核苷酸序列为gatattgtgataacccagtct ccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccaactcaagtataatttacatgcattggtaccagcagaagtcaggcacgtcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcgtttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtagcccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa(seq id no:12)。在另一些实施例中，与seq id no:12所示的序列相比，编码轻链可变区的核苷酸序列具有在框架区编码序列中具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
45.实现核酸分子分离的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以通过重组dna技术制备获得，也可以从适合的其他来源中分离。
46.本说明书一些实施例还提供了一种重组载体，所述重组载体包括前述的核酸分子。在一些实施例中，重组载体为表达载体。
47.制备重组载体的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以使用重组d na技术和基因转染方法，将前述核酸分子插入一个或多个表达载体中，使得核酸分子可操作地连接于转录和翻译调节序列。
48.本说明书一些实施例还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包括前文所述的核酸分子或重组载体，以使所述宿主细胞能够产生本说明书提供的抗体或抗原结合片段。
49.如本文所用，术语“宿主细胞”是指能够引入外源基因并使其稳定维持的细胞。在一些实施例中，宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
50.在一些实施例中，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。在一些实施例中，可作为
宿主细胞的真核细胞包括但不限于啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞、植物细胞、昆虫细胞和酵母细胞等。在一些实施例中，可作为宿主细胞的原核细胞包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌和沙门氏菌等。
51.制备宿主细胞的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如可以通过将前述重组载体引入宿主细胞，使前述核酸分子整合到宿主细胞的基因组中，通过宿主细胞的表达系统可以实现前述抗体或抗原结合片段的编码基因的转录和翻译，从而产生本说明书提供的抗体或抗原结合片段。
52.本说明书一些实施例还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括前述抗体或抗原结合片段。
53.在一些实施例中，所述药物组合物包括免疫偶联物，所述免疫偶联物由前述抗体或抗原结合片段偶联药物化合物或肽而制成。制备免疫偶联物的方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，例如，可以将前述抗体或抗原结合片段与功能性分子直接或通过合适长度的间隔物进行连接，连接方式可以是化学交联或基因工程融合表达，从而获得所述免疫偶联物。
54.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段偶联的药物化合物可以包括但不限于质子泵抑制剂(例如，奥美拉唑、泮托拉唑、雷贝拉唑、沃诺拉赞等)、抗生素(例如，四环素、阿莫西林、克拉霉素、喹诺酮类等)和其他小分子化合物(例如，鼠李糖脂、大蒜素等)等。
55.在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段偶联的肽可以包括但不限于培西加南(p exiganan)、epinecdin-1(epi-1)和tilapia piscidin 4(tp4)等。
56.在一些实施例中，所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载体，例如缓冲剂、抗氧化剂、表面活性剂、渗透压调节剂、ph调节剂、稳定剂、赋形剂、矫味剂、防腐剂等。所述药物组合物的剂型可以根据应用需要进行选择，包括但不限于注射剂、片剂、胶囊剂、口服液体剂型、颗粒剂等。
57.本说明书一些实施例还提供了前述抗体或抗原结合片段、核酸分子、重组载体、宿主细胞或药物组合物在制备用于治疗幽门螺旋杆菌感染的药物中的应用。
58.本说明书一些实施例还提供了一种试剂盒，用于检测幽门螺旋杆菌。所述试剂盒可以包含前述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶。
59.在一些实施例中，所述试剂盒为免疫层析试剂盒，例如胶体金免疫层析试剂盒和/或乳胶微球法免疫层析试剂盒)。所述抗体或抗原结合片段可作为带可检测标记的抗体用于包被层析试纸的标记垫。在另一些实施例中，所述试剂盒可以是用于实现幽门螺旋杆菌免疫检测方法的其他试剂盒，例如免疫荧光试剂盒、免疫组化试剂盒等，在此不作限制。
60.本说明书一些实施例还提供了前述的抗体或抗原结合片段、核酸分子、重组载体或宿主细胞在制备用于检测幽门螺旋杆菌的试剂盒中的应用。
61.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例方法动物免疫的方法
62.利用幽门螺旋杆菌全菌蛋白抗原(霍尔姆斯(北京)生物科技有限公司，ha025dc)进行动物免疫实验。以下为具体步骤。
63.1、将体重、周龄均值一致的balb/c小鼠随机分为2组，加铝佐剂(氢氧化铝佐剂)组和不加铝佐剂组。
64.2、实验开始前，小鼠各收集免疫前血清(第五天收集免疫前血清，通过眼球取血，适量取血，保证小鼠正常状态)，收集好的血清存于-80℃。
65.3、加铝佐剂(氢氧化铝佐剂)组配制方式：免疫前，每一抗原在75μl pbs中分别稀释至对应剂量(75μg/只小鼠)，并与明矾佐剂(1mg/只小鼠)混合，按照体积抗原:佐剂＝3:1(即75μl免疫原稀释液中加入25μl佐剂)混合；佐剂使用前摇匀，将注射佐剂(25μl)缓慢滴加至免疫原溶液中；佐剂与免疫原稀释液充分混合后，两者充分混合30分钟。使佐剂有效吸附抗原；后续根据免疫动物实验操作进行。
66.4、不加铝佐剂组配制方式：抗原在100μl pbs中分别稀释至表1中的对应剂量(175μg/只小鼠)，100μl的免疫原，后续根据免疫动物实验操作进行。
67.5、以2周的间隔皮下注射：实验设计为3次免疫方式，但分别在每一次免疫注射7天后眼球取血，离心法获得部分小鼠上清，先进行血清滴度检测，最后一次免疫结束7天后，心脏取血取最大血量，离心获得上清，存于-80℃。抗体的抗原结合能力(抗体效价)检测的方法
68.采用酶联免疫吸附实验elisa对抗体的抗原结合活性进行检测，以下为具体步骤。
69.1、底板包被：将幽门螺旋杆菌尿素酶抗原hp urease antigen(菲鹏生物股份有限公司，hp-ag1)用包被稀释液稀释到3μg/ml，每孔各加入配好的包被液100μl，置4℃冰箱，放置24h。
70.2、24h后，从冰箱取出后置于37℃平衡30min，之后弃去孔中液体；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
71.3、封闭酶标反应孔：每孔加入200μl 5％小牛血清后置37℃封闭90min，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
72.4、加入待检测样品：将待检测样品按照需要的比例进行稀释，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100μl，置于37℃，90min；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
73.5、加入酶标抗体：按照说明书加入适宜浓度的二抗；37℃，90min，每孔加100μl洗涤同前。
74.6、加入底物液：底物加入量每孔100μl，37℃避光放置15～30min。
75.7、终止反应：每孔加入终止液50μl终止反应，于20min内测定吸光度od450值。细胞融合及融合细胞的筛选与克隆的方法
76.提取免疫成功的小鼠的免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系sp2/0进行细胞融合，通过h at选择培养基(hat选择培养基含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)筛选融合细胞，并对融合细胞进行两轮elisa阳性筛选及亚克隆，获得稳定分泌抗幽门螺旋杆菌尿素酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
77.细胞融合及融合细胞的筛选与克隆的具体方法对于本领域技术人员来说应该是已知的，可参见例如：汪世华等编著.抗体技术第2版[m].北京：科学出版社,2018.11。抗幽门螺旋杆菌尿素酶单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
细胞融合备用小鼠的准备
[0078]
选用6-8周龄balb/c健康雌性小鼠，按照前述动物免疫方法进行动物免疫。编号依次为a0、a1和a2的小鼠(a0和a1属于加铝佐剂组，a2属于不加铝佐剂组)在3次免疫结束后的血清抗体效价检测数据如表1所示。表1.血清抗体效价检测数据
[0079]
由表1可以看出，3只小鼠的三免后眼眶血效价均》62500，在1:12500时均能达到50％以上，可用于进一步的细胞融合。细胞融合与杂交瘤细胞株的筛选
[0080]
取a0、a1和a2这3只小鼠的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞系sp2/0进行细胞融合及融合细胞的筛选与克隆。具体的：a0小鼠融合筛选共挑出15个阳性孔进行亚克隆，经融合筛选，共挑选出61个od450值》2.2以上的阳性孔，将上述阳性孔进行倍比稀释检测抗体效价，再进行第二次亚克隆筛选。得到3个杂交瘤细胞株，分别编号为a0-1、a0-2和a0-3；a1小鼠融合筛选共挑出11个阳性孔进行亚克隆，经融合筛选，共挑选出3个od450值》2.1以上的阳性孔，将上述阳性孔进行倍比稀释检测抗体效价，再进行第二次和第三次亚克隆筛选。得到4个杂交瘤细胞株，分别编号为a1-1、a1-2、a1-3和a1-4；a2小鼠融合筛选共挑出18个阳性孔进行亚克隆，再进行第二次和第三次亚克隆筛选。得到3个杂交瘤细胞株，分别编号为a2-1、a2-2和a2-3。单克隆抗体的免疫学特性鉴定
[0081]
(1)单抗隆抗体腹水效价检测：将每个杂交瘤细胞株分别注入f1代小鼠腹腔，共收集到10份腹水，所有腹水检测效价数据如下表2所示。表2.腹水抗体效价检测数据
[0082]
(2)纯化后的抗体效价检测：以上腹水经3.3％正辛酸-硫胺沉淀法纯化，共得到10个杂交瘤细胞株对应的候选单克隆抗体，所有候选单克隆抗体的效价检测数据见表3。表3.候选单克隆抗体效价检测数据表3.候选单克隆抗体效价检测数据
[0083]
以上数据显示10个候选单克隆抗体对尿素酶抗原具有良好的特异性结合能力。
[0084]
以上腹水经protein a/g抗体纯化柱纯化，纯化后的抗体elisa效价》1:128,000，纯度》90％。候选单克隆抗体在幽门螺旋杆菌抗体检测试剂盒中的验证
[0085]
通过免疫胶体金平台对候选抗幽门螺旋杆菌尿素酶单克隆抗体进行验证。
[0086]
实验组：编号为a2-1和a2-3的候选单克隆抗体。
[0087]
阴性对照组：全血的裂解缓冲液。
[0088]
采用胃幽门螺旋杆菌抗体检测试剂盒(杭州安旭生物科技有限公司)对上述实验组和阴性对照组进行检测。试剂加样后使用poct检测仪器acg1000(杭州安旭生物科技有限公司，id-a003)对结果进行检测，检测结果见表4。表4.检测结果注：g1-g10表示试纸条的条带颜色深浅的级别。数值越高，表示颜色越深；+/-表示比该级别的颜色稍深或稍浅。
[0089]
通过表4可以看出，候选单克隆抗体a2-1和a2-3可以用胃幽门螺旋杆菌抗体检测
试剂盒检测到条带，说明候选单克隆抗体a2-1和a2-3可以特异识别幽门螺旋杆菌。候选单克隆抗体可以应用在检测幽门螺旋杆菌的试剂盒中。例如，可以作为幽门螺旋杆菌抗原检测试剂盒的检测试剂，也可以作为幽门螺旋杆菌抗体检测试剂盒中的质控品。单克隆抗体anti-hp-urease-mab1的测序分析
[0090]
将单克隆抗体a2-3命名为anti-hp-urease-mab1，并对其进行测序分析。以下为具体步骤。
[0091]
(1)设计扩增重链可变区(vh)及轻链可变区(vl)基因的引物。扩增vh及vl基因的引物如下：重链可变区正向引物(vh-for):gggaattcgaggtgcagctgcaggagtctgg(seq id no:15)；重链可变区反向引物(vh-back):ggaaggtgtgcacaccgctggac(seq id no:16)；轻链可变区正向引物(vl-for):gatggtgggaagatggatacagtt(seq id no:17)；轻链可变区反向引物(vl-back):tcttgttgctctggttyccag(seq id no:18)。
[0092]
(2)取分泌anti-hp-urease-mab1的对数生长期的杂交瘤细胞株(约107个细胞)，按照trizol rna提取试剂盒(takara，9767)的说明书抽提细胞的总rna，以总rna为模板反转录合成cdna第一链，以上述扩增产物为模板pcr扩增抗体的vh/vl基因。
[0093]
(3)回收anti-hp-urease-mab1的vh片段、vl片段，进行测序。
[0094]
所得序列如下：重链可变区编码序列/anti-hp-urease-mab1-vh:312bpcctggggcctcagtgaagatgtcctgcagggcttctgactacacctttactaactcctggatgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatgggttggatacattaatcctagcactggttctactgactacaatcagaagttcagggacaaggccactttgactgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagcgaggagtacgacggctttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(seq id no:8)；重链可变区氨基酸序列/anti-hp-urease-mab1-vh-protein：104aapgasvkmscrasdytftnswmhwvkqrpgqglewvgyinpstgstdynqkfrdka tltadkssstaymqlssltsedsavyycaseeydgfdywgqgttltvss(seq id no:1)；轻链可变区编码序列/anti-hp-urease-mab1 lvκ：318bpgatattgtgataacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccaactcaagtataatttacatgcattggtaccagcagaagtcaggcacgtcccccaaaagatggatttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcgtttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagtagtagcccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa(seq id no:12)；轻链可变区氨基酸序列/anti-hp-urease-mab1 lvκprotein:106aadivitqspaimsaspgekvtmtcsanssiiymhwyqqksgtspkrwiydtsklasgvpa rfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssspytfgggtkleik(seq id no:5)。
[0095]
本说明书实施例所披露的一种结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段及相关应用，带来的有益效果包括但不限于：(1)本说明书实施例提供的结合幽门
螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段具有高纯度、高特异性和灵敏度的特点，作为免疫学检测方法或产品中的原料可提高检测结果的可靠性；(2)本说明书实施例提供的结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，例如可用于胶体金检测平台，作为检测试剂检测样本中是否存在幽门螺旋杆菌感染；(3)本说明书实施例提供的结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段对抗原蛋白的良好特异性结合能力，使其能够为治疗幽门螺杆菌感染的药物开发提供有力支持。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。
[0096]
本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0097]
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
[0098]
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有
±
20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
[0099]
针对本说明书引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本说明书作为参考。与本说明书内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外，对本说明书权利要求最广范围有限制的文件(当前或之后附加于本说明书中的)也除外。需要说明的是，如果本说明书附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本说明书所述内容有不一致或冲突的地方，以本说明书的描述、定义和/或术语的使用为准。
[0100]
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。

技术特征：
1.一种结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括：重链可变区，其包括氨基酸序列如seq id no:2所示的cdrh1、氨基酸序列如seq id no:3所示的cdrh2和氨基酸序列如seq id no:4所示的cdrh3；轻链可变区，其包括氨基酸序列如seq id no:6所示的cdrl1、氨基酸序列为dts的cdrl2和氨基酸序列如seq id no:7所示的cdrl3。2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:1所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:5所示。3.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为鼠源抗体、兔源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。4.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。5.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段选自下组：fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、dsfv、dab。6.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。7.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括：编码重链可变区的核苷酸序列，其包括如seq id no:9所示的cdrh1的编码序列、如seq id no:10所示的cdrh2的编码序列和如seq id no:11所示的cdrh3的编码序列；编码轻链可变区的核苷酸序列，其包括如seq id no:13所示的cdrl1的编码序列、序列为gacacatcc的cdrl2的编码序列和如seq id no:14所示的cdrl3的编码序列。8.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述编码vh的核苷酸序列如seq id no:8所示；所述编码轻链可变区的核苷酸序列如seq id no:12所示。9.一种重组载体，其包括如权利要求6-8中任一项所述的核酸分子。10.一种宿主细胞，其包括如权利要求6-8中任一项所述的核酸分子或者如权利要求9所述的重组载体。11.一种药物组合物，其包括如权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段。12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段偶联药物化合物或肽。13.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求6-8中任一项所述的核酸分子、如权利要求9所述的重组载体、如权利要求10所述的宿主细胞或者如权利要求11或12所述的药物组合物在制备用于治疗幽门螺旋杆菌感染的药物中的应用。14.一种检测幽门螺旋杆菌的试剂盒，其包含如权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段。15.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段、如权利要求6-8中任一项所述的核酸分子、如权利要求9所述的重组载体或者如权利要求10所述的宿主细胞在制备用于检测幽门螺旋杆菌的试剂盒中的应用。

技术总结
本说明书实施例提供了一种结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区。其中，重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDRH1、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDRH2和氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的CDRH。轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的CDRL1、氨基酸序列为DTS的CDRL2和氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的CDRL3。该抗体或抗原结合片段具有高纯度、高特异性和灵敏度的特点。本说明书实施例还提供了结合幽门螺旋杆菌抗原蛋白尿素酶的抗体或抗原结合片段的相关应用。相关应用。


技术研发人员：魏文涛 请求不公布姓名 请求不公布姓名
受保护的技术使用者：杭州旭科生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/28