一种用于胃肠癌类器官培养的组合物、培养基及其应用的制作方法

1.本技术涉及类器官培养技术领域，尤其涉及一种用于胃肠癌类器官培养的组合物、培养基及其应用。


背景技术：

2.癌症是世界性的医疗健康挑战。在中国，癌症的五年生存率仅有40.5％,严重威胁人民健康，并造成社会发展的沉重负担。我国结直肠癌发病率也在持续显著上升。目前，结直肠癌的临床治疗多以手术为主，辅以放化疗等。但患者耐药性的出现导致化疗敏感性呈逐渐降低趋势，且部分患者在确诊时已属中晚期，错过手术时机或术后复发转移，只能予以姑息治疗。因此，传统的研究模型已无法满足目前日益增长的临床诊疗需求。
3.近年来最有希望的突破之一是类器官技术。类器官已被证明保留了它们来源的癌症组织的异质性和遗传特性。类器官可广泛应用于发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验等多方面。但类器官模型研究仍存在培养成功率、细胞活率及类器官活性偏低、类器官与体内器官情况差异较大的多种问题。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明的目的是提供一种用于胃肠癌类器官培养的组合物、培养基及其应用。
5.一方面，本技术提供了一种用于胃肠癌类器官培养的组合物，所述组合物包括质量比为(1-5):(1-5):(10-15)的乳酸菌素、肉桂醛、抗生素。
6.进一步的，所述组合物包括质量比为1:2:10的乳酸菌素、肉桂醛、抗生素。
7.进一步的，所述抗生素选自青霉素/链霉素、青霉素、链霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、卡那霉素中的一种或多种；优选的，所述抗生素为青霉素/链霉素。
8.在一种优选的实施方式中，组合物为质量比为1:2:10的乳酸菌素、肉桂醛、青霉素/链霉素。
9.另一方面，本技术还提供了一种胃肠癌类器官培养基，所述培养基包括如上述的组合物；优选的，以质量百分比计，所述培养基中组合物的含量为1％-5％；更优选的，1％。
10.进一步的，所述培养基还包括：生长因子、胰岛素、转铁蛋白、rock抑制剂、gsk3抑制剂、n2培养基、dmem/f12、l-wrn细胞条件培养基；优选的，所述培养基还包括：n2培养基、表皮细胞生长因子、小鼠成纤维细胞生长因子、人胰岛素、人转铁蛋白、y27632、chir99021、dmem/f12、l-wrn细胞条件培养基。
11.在一种优选的实施方式中，以质量百分比计，胃肠癌类器官培养基包括：1％-5％组合物、10％-20％n2培养基、1％-5％表皮细胞生长因子、1％-5％小鼠成纤维细胞生长因子、1％-5％人胰岛素、1％-5％人转铁蛋白、1％-5％y27632、1％-5％chir99021、10％-20％dmem/f12、60％-70％l-wrn细胞条件培养基。
12.鉴于体外培养与体内真实环境往往差异较大，且胃肠癌又涉及复杂的肠道菌群结
构，因此，目前的胃肠癌类器官培养常存在无法还原体内环境的问题。本技术中首次采用乳酸菌素和肉桂醛替代部分抗生素，通过调整抗生素组合物成分，起到了调整培养过程中的菌群结构的作用，以使得培养环境最大程度还原体内环境，提高了胃肠癌类器官的细胞活率。
13.另一方面，本技术还提供了一种胃肠癌类器官的培养方法，所述培养方法包括如下步骤：
14.步骤一、取胃肠癌单细胞样品与基质胶以体积比1:(1-3)混合，25℃-40℃固化5-15min；
15.步骤二、加入包含上述组合物的培养基或如上述的培养基进行培养，培养2-3天，获得胃肠癌类器官。
16.进一步的，所述培养条件为co2含量为4％-6％，o2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃；优选的，所述培养条件为co2含量为5％，o2含量为2％，温度为37℃。
17.在一种优选的实施方式中，胃肠癌类器官的培养方法包括如下步骤：
18.步骤一、取胃肠癌单细胞样品与基质胶以体积比1:(1-3)混合，25℃-40℃固化5-15min；
19.步骤二、加入培养基进行培养，培养条件为co2含量为4％-6％，o2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养2-3天，获得胃肠癌类器官。
20.组合物配方为：1-5份乳酸菌素、1-5份肉桂醛、5-20份青霉素/链霉素。
21.培养基配方为：1％-5％组合物、10％-20％n2培养基、1％-5％表皮细胞生长因子、1％-5％小鼠成纤维细胞生长因子、1％-5％人胰岛素、1％-5％人转铁蛋白、1％-5％y27632、1％-5％chir99021、10％-20％dmem/f12、60％-70％l-wrn细胞条件培养基。
22.另一方面，本技术还提供了如上述的培养方法获得的胃肠癌类器官；优选的，所述胃肠癌类器官选自食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌中的一种；更优选的，所述胃肠癌类器官为直肠癌。
23.另一方面，本技术还提供了如上述的组合物或如上述的培养基或如上述的培养方法在胃肠癌类器官培养中的应用；优选的，所述胃肠癌类器官选自食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌中的一种；更优选的，所述胃肠癌类器官为直肠癌。
24.另一方面，本技术还提供了如上述的组合物或如上述的培养基或如上述的培养方法或如上述的胃肠癌类器官在非疾病诊断治疗目的的胃肠癌致病机理研究和/或药物测试中的应用。
25.本发明具有如下有益效果：
26.1、目前的胃肠癌类器官培养常存在无法还原体内肠道内菌群结构的问题，本技术中首次采用乳酸菌素和肉桂醛替代部分抗生素，通过调整抗生素组合物成分，起到了调整培养过程中的菌群结构的作用，使得培养环境最大程度还原体内环境，提高了胃肠癌类器官的细胞活率；
27.2、本技术中提供了一种新的用于胃肠癌类器官，尤其是直肠癌类器官的培养基；
28.3、采用本技术培养基及培养方法培养的直肠癌类器官具有细胞活率高，能够在体外再现患者对药物的反应，广泛适用于直肠癌相关病理及药理学研究过程。
具体实施方式
29.为了更清楚的阐释本技术的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
30.实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
31.其中，10μg/ml人胰岛素、10μg/ml人转铁蛋白、乳酸菌素、肉桂醛、青霉素/链霉素、l-wrn细胞条件培养基购自sigma-aldrich；1x n2培养基购自invitrogen；50ng/ml表皮细胞生长因子(egf)、200ng/ml小鼠成纤维细胞生长因子(fgf10)购自r&d；10μm rock抑制剂y27632、2.5μm gsk3抑制剂chir99021购自torics；dmem/f12购自gibco。
32.如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
33.肿瘤组织来源：采用人类直肠癌/结肠癌手术切除后的组织作为样本，所有样本和临床信息均在知情同意的情况下获得，本研究是按照“赫尔辛基宣言”进行的。
34.消化的方法：
35.直肠癌/结肠癌组织用添加抗生素的冷磷酸盐缓冲盐水洗涤5次，然后切碎成尺寸小于2mm3的碎片。组织片段用1mg/ml胶原酶a(罗氏诊断)在震荡培养箱中以37℃化学消化15-30min，然后在冷dmem/f12中重复移液机械分离4-5次。
36.实施例1抗生素组合单因素筛选实验
37.本技术中首次通过调整抗生素组合物成分，进而调节胃肠癌类器官的细胞活率。
38.具体胃肠癌类器官培养抗生素组合单因素筛选实验包括如下步骤：
39.取直肠癌或结肠癌单细胞样品与基质胶以体积比1:(1-3)混合均匀，25℃-40℃固化5-15min，加入培养基进行培养，培养条件为co2含量为4％-6％，o2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃，培养2-3天，获得直肠癌类器官，每组实验重复至少24个平行。
40.培养基配方为：不同抗生素组合物、10％-20％n2培养基、1％-5％表皮细胞生长因子、1％-5％小鼠成纤维细胞生长因子、1％-5％人胰岛素、1％-5％人转铁蛋白、1％-5％y27632、1％-5％chir99021、10％-20％dmem/f12、l-wrn细胞条件培养基补齐。
41.采用细胞计数仪对上述方法培养获得的直肠癌类器官进行细胞数量计算并统计细胞活率，计算公式如下所示，测试结果如表1所示。
42.细胞活率＝活细胞数/细胞总数*100％
43.表1
44.45.[0046][0047]
由表1结果可见，本技术中证明了采用乳酸菌素和肉桂醛在直肠癌类器官培养过程中能够替代部分抗生素，且通过调整抗生素组合物成分，能够提高胃肠癌类器官的细胞活率。
[0048]
实施例2
[0049]
本实施例中提供了一种直肠癌类器官的培养方法，包括如下步骤：
[0050]
步骤一、取直肠癌单细胞样品与基质胶以体积比1:1混合均匀，37℃固化15min；
[0051]
步骤二、加入培养基进行培养，培养条件为co2含量为5％，o2含量为2％，温度为37℃，培养3天，获得胃肠癌类器官。
[0052]
组合物配方为：1份乳酸菌素、2份肉桂醛、10份青霉素/链霉素。
[0053]
培养基配方为：1％组合物、10％n2培养基、2％表皮细胞生长因子(egf)、2％小鼠成纤维细胞生长因子(fgf10)、1％人胰岛素、5％人转铁蛋白、1％y27632、1％chir99021、12％dmem/f12、65％ l-wrn细胞条件培养基。
[0054]
实施例3
[0055]
本实施例与实施例2的区别仅在于培养4天。
[0056]
实施例4
[0057]
本实施例与实施例2的区别仅在于co2含量为7％，o2含量为3％。
[0058]
实施例5
[0059]
本实施例与实施例2的区别仅在于固化时间为20min。
[0060]
实施例6药物测试实验
[0061]
本实施例中对实施例2-5方法构建的直肠癌类器官模型进行药物敏感性筛选。已知该样本来源结直肠癌患者对奥沙利铂+卡培他滨(capeox)方案耐药，对奥沙利铂+亚叶酸钙+5-fu(mfolfox6)方案敏感。故针对该来源肿瘤类器官使用上述两种药物方案进行药敏检测，测试药物的最高浓度抑制率，以及半抑制浓度值ic50(μm)，以验证其临床结果一致性。
[0062]
具体方法为：给上述直肠癌类器官模型用药5天，每种药物的最高浓度为人体最大峰值血药浓度cmax。连续1:3稀释，连续9次稀释。使用celltiter-glo3d细胞活力测定法(promega)测定类器官的活力，半抑制浓度值ic50由细胞活力对药物浓度的影响产生，具体ic50数值如表2所示。其中，奥沙利铂+卡培他滨(capeox)药物方案ic50以卡培他滨浓度为准，奥沙利铂+亚叶酸钙+5-fu(mfolfox6)药物方案ic50以5-fu浓度为准。
[0063]
表2
[0064][0065]
注：/表示最高浓度下细胞抑制率仍低于半抑制率。
[0066]
综上所述，本技术提供的方法制备的直肠癌类器官能够再现患者对药物的反应，能够广泛应用于直肠癌治疗和病理相关的研究中。
[0067]
以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。

技术特征：
1.一种用于胃肠癌类器官培养的组合物，其特征在于，所述组合物包括质量比为(1-5):(1-5):(10-15)的乳酸菌素、肉桂醛、抗生素。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括质量比为1:2:10的乳酸菌素、肉桂醛、抗生素。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗生素选自青霉素/链霉素、青霉素、链霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢氨苄、卡那霉素中的一种或多种；优选的，所述抗生素为青霉素/链霉素。4.一种胃肠癌类器官培养基，其特征在于，所述培养基包括如权利要求1-3任一所述的组合物；优选的，以质量百分比计，所述培养基中组合物的含量为1％-5％；更优选的，1％。5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括：生长因子、胰岛素、转铁蛋白、rock抑制剂、gsk3抑制剂、n2培养基、dmem/f12、l-wrn细胞条件培养基；优选的，所述培养基还包括：n2培养基、表皮细胞生长因子、小鼠成纤维细胞生长因子、人胰岛素、人转铁蛋白、y27632、chir99021、dmem/f12、l-wrn细胞条件培养基。6.一种胃肠癌类器官的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括如下步骤：步骤一、取胃肠癌单细胞样品与基质胶以体积比1:(1-3)混合，25℃-40℃固化5-15min；步骤二、加入包含如权利要求1-3任一所述组合物的培养基或如权利要求4或5所述的培养基进行培养，培养2-3天，获得胃肠癌类器官。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养条件为co2含量为4％-6％，o2含量为1％-2％，温度为25℃-40℃；优选的，所述培养条件为co2含量为5％，o2含量为2％，温度为37℃。8.如权利要求6或7所述的培养方法获得的胃肠癌类器官；优选的，所述胃肠癌类器官选自食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌中的一种；更优选的，所述胃肠癌类器官为直肠癌。9.如权利要求1-3任一所述的组合物或如权利要求4或5所述的培养基或如权利要求6或7所述的培养方法在胃肠癌类器官培养中的应用；优选的，所述胃肠癌类器官选自食道癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌中的一种；更优选的，所述胃肠癌类器官为直肠癌。10.如权利要求1-3任一所述的组合物或如权利要求4或5所述的培养基或如权利要求6或7所述的培养方法或如权利要求8所述的胃肠癌类器官在非疾病诊断治疗目的的胃肠癌致病机理研究和/或药物测试中的应用。

技术总结
本发明提供了一种用于胃肠癌类器官培养的组合物，该组合物包括质量比为(1-5):(1-5):(10-15)的乳酸菌素、肉桂醛、抗生素。目前的胃肠癌类器官培养常存在无法还原体内肠道内菌群结构的问题，本发明首次采用乳酸菌素和肉桂醛替代部分抗生素，通过调整抗生素组合物成分，起到了调整培养过程中的菌群结构的作用，使得培养环境最大程度还原体内环境，提高了胃肠癌类器官的细胞活率；采用本发明培养基及培养方法培养的直肠癌类器官具有细胞活率高的优势，能够在体外再现患者对药物的反应，广泛适用于直肠癌相关病理及药理学研究过程。适用于直肠癌相关病理及药理学研究过程。


技术研发人员：闫巧莲 姜丽侠 王娟
受保护的技术使用者：山东三嘉四生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/28