BHK细胞化学限定培养基及其应用、口蹄疫疫苗的制备方法与流程

bhk细胞化学限定培养基及其应用、口蹄疫疫苗的制备方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种bhk细胞化学限定培养基及其应用、口蹄疫疫苗的制备方法。


背景技术：

2.目前，bhk细胞在应用于病毒的培养时，培养基中通常包含有血清或者诸多水解物。然而，在采用血清或者水解物作为培养基组分对bhk细胞进行悬浮培养时，会存在一些不可克服的缺陷，如细胞活率较低，细胞结团等问题。更为重要的是，血清来源于动物组分，具有极大的生物危害，且其价格高昂；血清、水解物来源不稳定，会造成产品产率，收率上有较大的波动，各批次质量难以稳定，无法保证疫苗稳定高效的生产；血清、水解物的存在，会产生较大的杂质负荷，给疫苗生产过程中的纯化操作增加困扰。
3.bhk细胞目前是生产口蹄疫疫苗重要的工程细胞。传统的口蹄疫疫苗生产过程中，为了维持细胞以及口蹄疫病毒的正常生长，培养基中需要添加血清和水解物，因此存在由于血清、水解物来源不稳定，导致的产品产率、收率不稳定，无法实现口蹄疫疫苗的稳定高效生产的问题；由于血清本身所带来的价格昂贵和外源因子污染的问题。此外，疫苗制备过程中，在发酵完成后，需要对口蹄疫病毒液进行纯化，来实现更好的免疫效果，降低免疫受体的副作用，由于血清、水解物的添加，导致纯化操作的复杂，传统的纯化方法多采用澄清过滤，浓缩，再辅之以化学沉淀法，来获得纯度较高的疫苗，工艺步骤多，口蹄疫病毒在整个纯化过程中，收率受到了较大的影响。


技术实现要素：

4.有鉴于此，为解决上述问题，本发明提出一种化学成分明确，不添加血清和水解物，不存在任何蛋白质成分，安全性高、稳定性强、杂质负荷低的bhk细胞化学限定培养基；同时提供了所述bhk细胞化学限定培养基的应用，在应用于疫苗制备领域时，可避免蛋白质成分带来的免疫副作用，由于成分中均为小分子化合物，可大幅简化下游纯化步骤；此外本发明还提供了一种基于所述bhk细胞化学限定培养基的安全性高、纯化步骤简单、生产效率高、收率高且稳定的口蹄疫疫苗的制备方法。
5.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
6.本发明一方面提供了一种bhk细胞化学限定培养基，包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、胱氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、磷酸氢二钠、氯化钾、f68、乙醇胺盐酸盐、丙酮酸、氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、核黄素、维生素、生物素、叶酸、泛酸钙、柠檬酸铵铁、无水硫酸镁、无水氯化钙、五水硫酸铜、七水硫酸锌、亚硒酸钠、四水氯化锰、氯化钠。
7.在本发明的一些优选的bhk细胞化学限定培养基的实施方式中，
8.所述bhk细胞化学限定培养基中各组分含量如下：
9.丙氨酸20～100mg/l、精氨酸400～1000mg/l、天冬酰胺400～1000mg/l、天冬氨酸400～1000mg/l、半胱氨酸20～100mg/l、谷氨酸100～500mg/l、组氨酸100～500mg/l、异亮氨酸100～500mg/l、亮氨酸100～500mg/l、赖氨酸100～500mg/l、甲硫氨酸100～500mg/l、苯丙氨酸100～500mg/l、脯氨酸100～500mg/l、丝氨酸100～500mg/l、苏氨酸100～500mg/l、色氨酸100～500mg/l、缬氨酸100～500mg/l、胱氨酸20～100mg/l、酪氨酸100～500mg/l、羟脯氨酸20～100mg/l、谷氨酰胺400～1000mg/l、甘氨酸20～100mg/l、谷胱甘肽5～20mg/l、葡萄糖4000～8000mg/l、磷酸氢二钠600～1100mg/l、氯化钾300～550mg/l、f68600～1100mg/l、乙醇胺盐酸盐20～100mg/l、丙酮酸20～100mg/l、氯化胆碱20～100mg/l、肌醇20～100mg/l、烟酰胺10～40mg/l、核黄素1～5mg/l、维生素b121～5mg/l、生物素2～10mg/l、叶酸2～10mg/l、泛酸钙2～10mg/l、柠檬酸铵铁20～100mg/l、无水硫酸镁20～100mg/l、无水氯化钙20～100mg/l、五水硫酸铜0.001～0.01mg/l、七水硫酸锌1～10mg/l、亚硒酸钠0.001～0.01mg/l、四水氯化锰0.001～0.01mg/l、氯化钠4000～5000mg/l。
10.所述bhk细胞化学限定培养基中各组分含量用表格表示如下：
11.[0012][0013]
本发明另一方面提供了bhk细胞化学限定培养基的制备方法：称取如权利要求1或2所述的各组分，用水溶解，全部物料配制完成后，总浓度在18～22g/l。
[0014]
所述的bhk细胞化学限定培养基中各组分均具有良好的溶解性，不需要对某单独组分用酸、碱或醇类物质进行溶解。
[0015]
本发明另一方面提供了bhk细胞化学限定培养基的用途：
[0016]
(a)在bhk细胞培养中的应用；
[0017]
(b)在制备口蹄疫疫苗、新城疫疫苗，伪狂犬疫苗，猪瘟疫苗等疫苗中的应用。
[0018]
本发明另一方面提供了口蹄疫疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0019]
s1、将bhk细胞接种于权利要求1或2所述的bhk细胞化学限定培养基中，对bhk细胞进行培养，实现bhk细胞的扩增；
[0020]
s2、再接种口蹄疫病毒，继续培养，实现口蹄疫病毒的增殖；
[0021]
s3、向收获的口蹄疫病毒液中加入酶混物溶液，消化核酸片段；
[0022]
s4、消化结束后，采用过滤的方式进行纯化；
[0023]
s5、再经过除菌过滤，完成口蹄疫疫苗原液的制备。
[0024]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，所述s1中，按照0.4～0.6
×
106cells/ml密度，将bhk细胞接种于bhk细胞化学限定培养基中，培养40～50h。
[0025]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，所述s2中，用bhk细胞化学限定培养基重悬bhk细胞至(6～10)
×
106cells/ml，再接种口蹄疫病毒，并于37℃、5％co2、120rpm的摇床培养箱中进行培养，至细胞密度降低至接种病毒时细胞密度的10％
以下，收获病毒液。
[0026]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，所述s3中，酶混物溶液是由酶混物用水溶解为液体形式后得到；所述酶混物包括核糖核酸酶和保护剂。
[0027]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，所述保护剂为动物血清蛋白、精氨酸、甘油、甘露醇、海藻糖中的一种或多种的混合。
[0028]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，所述酶混物为冻干粉形式，为白色粉末状，在2～8℃保存，其是由酶混物液体经冻干工艺处理掉水分后得到。
[0029]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，保护剂为动物血清蛋白、精氨酸、甘油、甘露醇、海藻糖中的一种，所述酶混物液体中核糖核酸酶的量为0.5～10mg/ml,对应活性单位100～2000万u/ml，保护剂的重量占酶混物液体重量的5～50％。
[0030]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，保护剂为动物血清蛋白、精氨酸、甘油、甘露醇、海藻糖中多种的混合，所述酶混物液体中核糖核酸酶的量为0.5～10mg/ml,对应活性单位100～2000万u/ml，动物血清蛋白的重量不超过酶混物液体重量的20％、精氨酸的重量不超过酶混物液体重量的20％、甘油的重量不超过酶混物液体重量的50％，甘露醇的重量不超酶混物液体重量的20％，海藻糖的重量不超过酶混物液体重量的20％。
[0031]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，酶混物溶液中酶混物与水的重量比为:酶混物：水＝1：1～1:50；
[0032]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，向收获的口蹄疫病毒液中加入酶混物溶液的量，以所述核糖核酸酶的单位活性量计为：每毫升收获的口蹄疫病毒液中20～300u。
[0033]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，所述s4中，采用切向流过滤的方式进行过滤纯化。
[0034]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，切向流过滤分为浓缩过滤阶段和纯化过滤阶段；浓缩过滤阶段，浓缩后体积占初始体积的5％-20％；纯化过滤阶段，过滤体积不小于浓缩后体积的6倍，不大于浓缩后体积的30倍。
[0035]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，切向流过滤采用的过滤器的分子孔径不低于100kd分子量，不高于1000kd分子量。
[0036]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，切向流过滤采用超滤膜包或中空纤维柱类型的过滤器。
[0037]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，切向流过滤后，料液中宿主蛋白残留不高于300ppm，核糖核酸不高于100ppm。
[0038]
在本发明的一些优选的口蹄疫疫苗的制备方法的实施方式中，所述s5中，除菌过滤为采用0.22um除菌过滤器进行过滤，通过泵，或者压力将料液流穿过0.22um的过滤器，实现对料液中细菌的有效拦截，让料液澄清和实现无菌存放。
[0039]
相对于现有技术，本发明所述的bhk细胞化学限定培养基及其应用、口蹄疫疫苗的制备方法具有以下优势：
[0040]
(1)本发明所述的bhk细胞化学限定培养基采用了仿血清成分替代技术，化学成分明确，不含血清和水解物，不存在任何蛋白质成分，在应用于疫苗制备时，可降低蛋白质成
分带来的免疫副作用，安全性高、稳定性强，可保证产品质量、产率的稳定，同时组分均为小分子化合物，去除了蛋白质成分，尤其是水解物成分，杂质产生水平低，可大幅简化下游纯化步骤；
[0041]
(2)本发明所述的bhk细胞化学限定培养基在具有杂质产生水平低、可简化下游纯化操作的优势的同时，在bhk细胞生长阶段和病毒维持阶段均有很好表现，培养基中含有对病毒感染有促进的成分的微量元素和相关物质的组合，通过这些组分的合理配比，可使培养的细胞对病毒更加敏感，达到提高产量的效果；同时通过营养组分的定向调整，保持病毒增殖所需的营养；
[0042]
(3)本发明所述的bhk细胞化学限定培养基各组分均具有很好的溶解性，不需要对某单独组分用酸、碱或有机溶剂进行溶解，简化操作步骤，同时成分稳定，培养基效期长；
[0043]
(4)本发明所述的口蹄疫疫苗的制备方法，通过不含有血清和水解物的bhk细胞化学限定培养基进行培养，培养效果好、安全性高、稳定性强、杂质产生水平低，再配合加入去除细胞宿主核糖核酸的酶混合物的方式，对发酵液进行水解，可有效简化下游纯化步骤，仅通过切向流过滤的方式，就可对发酵液中杂质组分进行高效去除，产率、收率高且稳定。
具体实施方式
[0044]
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0045]
下面结合实施例来详细说明本发明。
[0046]
实施例1bhk细胞化学限定培养基
[0047]
bhk细胞化学限定培养基包括如下含量的各组分：
[0048][0049][0050]
准确称取的上述组分用注射水溶解，并进行充分搅拌，完全溶解之后，采用0.22um除菌过滤器将溶解好的水溶液进行过滤，得到bhk细胞化学限定培养基。
[0051]
实施例2bhk细胞化学限定培养基
[0052]
bhk细胞化学限定培养基包括如下含量的各组分：
[0053][0054][0055]
准确称取的上述组分用注射水溶解，并进行充分搅拌，完全溶解之后，采用0.22um除菌过滤器将溶解好的水溶液进行过滤，得到bhk细胞化学限定培养基。
[0056]
实施例3bhk细胞化学限定培养基
[0057]
bhk细胞化学限定培养基包括如下含量的各组分：
[0058][0059][0060]
准确称取的上述组分用注射水溶解，并进行充分搅拌，完全溶解之后，采用0.22um除菌过滤器将溶解好的水溶液进行过滤，得到bhk细胞化学限定培养基。
[0061]
实验测试1
[0062]
采用实施例1～3制备的bhk细胞化学限定培养基对bhk细胞进行悬浮培养，按照0.4～0.6
×
106cells/ml密度进行接种扩增，培养48h，可以稳定的实现15～20倍细胞扩增，扩增密度到6～10
×
106cells/ml，扩增后细胞形态良好，无聚团数据，可知bhk细胞化学限
定培养基具有细胞生长稳定，细胞对培养基组分耐受性好，这为后续工业规模在5000～10000l的生产，带来极其便利和稳定的生产可靠性。
[0063]
下文中，实施例4和5中使用的bhk细胞化学限定培养基均为实施例1制备所得。
[0064]
实施例4制备口蹄疫疫苗
[0065]
步骤一、将bhk种子细胞培养至一定细胞密度，按照0.6
×
106cells/ml密度，接种于bhk细胞化学限定培养基中，培养体积150ml，于500ml摇瓶中，培养48h；
[0066]
步骤二、用bhk细胞化学限定培养基重悬细胞至9
×
106cells/ml，分别对应2个125ml摇瓶，总共2个摇瓶，装液体积30ml，重悬后细胞密度为9
×
106cells/ml
[0067]
步骤三、接种30ul的o型口蹄疫病毒液，并置于37℃、5％co2、120rpm的摇床培养箱中进行培养；
[0068]
步骤四、培养8h后，每隔2h取样计数，直至细胞密度降低至接种病毒时细胞密度的10％以下(即0.9
×
106cells/ml)，收获病毒液；
[0069]
步骤五、按照每毫升收获的口蹄疫病毒液中加入核糖核酸酶的单位活性量为100u计，加入酶混物溶液，震荡混匀消化2h；
[0070]
其中，酶混物溶液是由酶混物液体经冻干处理掉水分后，得到的冻干粉形式的酶混物经水复溶后制得，其中酶混物液体中核糖核酸酶的量为0.5～10mg/ml,对应活性单位100～2000万u/ml，酶混物液体中保护剂包括占酶混物液体重量30％的甘油，5％的甘露醇，5％的海藻糖；
[0071]
步骤六、反应结束后，将料液在4000g离心力的条件下，离心，去除料液中的细胞碎片等不溶性威力，之后采用分子量为300kd的切向流过滤器，将料液浓缩到初始体积的10％，并之后不断加入pb缓冲液，进行纯化过滤，纯化过滤总体积达到浓缩后体积15倍后，停止切向流过滤；
[0072]
步骤七、切向流过滤之后，采用0.22um除菌过滤器进行过滤，通过蠕动泵将步骤六完成的料液泵入过滤器中，穿过过滤膜，实现除菌过滤，完成口蹄疫疫苗原液制备。
[0073]
实施例5制备口蹄疫疫苗
[0074]
步骤一、将bhk种子细胞培养至一定细胞密度，按照0.5
×
106cells/ml密度，接种于bhk细胞化学限定培养基中，培养体积150ml，于500ml摇瓶中，培养48h；
[0075]
步骤二、用bhk细胞化学限定培养基重悬细胞至8
×
106cells/ml，分别对应2个125ml摇瓶，总共2个摇瓶，装液体积30ml，重悬后细胞密度为8
×
106cells/ml
[0076]
步骤三、接种30ul的a型口蹄疫病毒液，并置于37℃、5％co2、120rpm的摇床培养箱中进行培养；
[0077]
步骤四、培养8h后，每隔2h取样计数，直至细胞密度降低至接种病毒时细胞密度的10％以下(即0.8
×
106cells/ml)，收获病毒液；
[0078]
步骤五、按照每毫升收获的口蹄疫病毒液中加入核糖核酸酶的单位活性量为150u计，加入酶混物溶液，震荡混匀消化2h；
[0079]
其中，酶混物溶液是由酶混物液体经冻干处理掉水分后，得到的冻干粉形式的酶混物经水复溶后制得；其中酶混物液体中核糖核酸酶的量为0.5～10mg/ml,对应活性单位100～2000万u/ml，酶混物液体中保护剂包括占酶混物液体重量10％的牛血清白蛋白，5％的甘露醇，5％的海藻糖；
[0080]
步骤六、反应结束后，将料液在4000g离心力的条件下，离心，去除料液中的细胞碎片等不溶性威力，之后采用分子量为300kd的切向流过滤器，将料液浓缩到初始体积的10％，并之后不断加入pb缓冲液，进行纯化过滤，纯化过滤总体积达到浓缩后体积15倍后，停止切向流过滤；
[0081]
步骤七、切向流过滤之后，采用0.22um除菌过滤器进行过滤，通过蠕动泵将步骤六完成的料液泵入过滤器中，穿过过滤膜，实现除菌过滤，完成口蹄疫疫苗原液制备。
[0082]
对比例采用传统培养方法制备口蹄疫疫苗
[0083]
对比例1～2均采用如下的传统培养方法制备口蹄疫疫苗：
[0084]
步骤一、采用市场品牌b家含有水解物并需要添加血清的培养基，将bhk种子细胞培养至一定细胞密度，按照0.55
×
106cells/ml密度，接种于市售细胞培养液中，培养体积150ml，于500ml摇瓶中，加入培养体积2％牛血清，培养48h；
[0085]
步骤二、用市售细胞培养液重悬细胞至5.5
×
106cells/ml，分别对应2个125ml摇瓶，总共2个摇瓶，装液体积30ml，重悬后细胞密度为5.5
×
106cells/ml
[0086]
步骤三、接种30ul的口蹄疫病毒液(对比例1中接种的为o型口蹄疫病毒液，对比例2中接种的为a型口蹄疫病毒液)，并置于37℃、5％co2、120rpm的摇床培养箱中进行培养；
[0087]
步骤四、培养8h后，每隔2h取样计数，直至细胞密度降低至接种病毒时细胞密度的10％以下(即0.55
×
106cells/ml)，收获病毒液；
[0088]
步骤五、加入核糖核酸酶500u，震荡混匀消化2h；
[0089]
步骤六、、反应结束后，将料液在4000g离心力的条件下，离心，去除料液中的细胞碎片等不溶性威力，之后采用分子量为300kd的切向流过滤器，将料液浓缩到初始体积的10％，并之后不断加入pb缓冲液，进行纯化过滤，纯化过滤总体积达到浓缩后体积15倍后，停止切向流过滤；
[0090]
步骤七、切向流过滤之后，采用0.22um除菌过滤器进行过滤，通过蠕动泵将步骤六完成的料液泵入过滤器中，穿过过滤膜，实现除菌过滤。
[0091]
实验测试2
[0092]
采用如下方法对实施例4和5，对比例1和2制备的口蹄疫疫苗进行测定：
[0093]
疫苗产量测定：采用蔗糖梯度离心的方式，将样品过滤，放入15～55％蔗糖梯度的溶液中，35000r/min超速离心3h，用改装的高效液相色谱仪在259nm波长下检测，根据对照曲线，测试疫苗产量浓度；
[0094]
dna残留测定：采用市售的dna残留检测试剂盒，将样品做好处理，采用dna残留检测试剂盒处理样品，并测试dna残留；
[0095]
杂质蛋白残留测定：采用bhk elisa kit，和bsa elisa kit检测bhk宿主蛋白和血清中bsa残留，加总成为杂质蛋白残留。
[0096]
实验结果如表1和表2所示：
[0097]
表1
[0098]
样品编号疫苗产量dna残留杂质蛋白残留实施例417ug/ml934ng/ml26843ng/ml对比例14.8ug/ml4003ng/ml97085ng/ml
[0099]
表2
[0100]
样品编号疫苗产量dna残留杂质蛋白残留实施例518ug/ml837ng/ml29407ng/ml对比例23.2ug/ml9243ng/ml102761ng/ml
[0101]
由表1和表2可知，采用本发明所述的bhk细胞化学限定培养基和口蹄疫疫苗制备方法生产口蹄疫疫苗，疫苗产量可得到有效提高，经过简单的澄清过滤的纯化方式，就可有效去除杂质，dna残留含量和杂质蛋白残留含量低。
[0102]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.bhk细胞化学限定培养基，其特征在于：包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、胱氨酸、酪氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、谷胱甘肽、葡萄糖、磷酸氢二钠、氯化钾、f68、乙醇胺盐酸盐、丙酮酸、氯化胆碱、肌醇、烟酰胺、核黄素、维生素、生物素、叶酸、泛酸钙、柠檬酸铵铁、无水硫酸镁、无水氯化钙、五水硫酸铜、七水硫酸锌、亚硒酸钠、四水氯化锰、氯化钠。2.根据权利要求1所述的bhk细胞化学限定培养基，其特征在于，所述bhk细胞化学限定培养基中各组分含量如下：丙氨酸20～100mg/l、精氨酸400～1000mg/l、天冬酰胺400～1000mg/l、天冬氨酸400～1000mg/l、半胱氨酸20～100mg/l、谷氨酸100～500mg/l、组氨酸100～500mg/l、异亮氨酸100～500mg/l、亮氨酸100～500mg/l、赖氨酸100～500mg/l、甲硫氨酸100～500mg/l、苯丙氨酸100～500mg/l、脯氨酸100～500mg/l、丝氨酸100～500mg/l、苏氨酸100～500mg/l、色氨酸100～500mg/l、缬氨酸100～500mg/l、胱氨酸20～100mg/l、酪氨酸100～500mg/l、羟脯氨酸20～100mg/l、谷氨酰胺400～1000mg/l、甘氨酸20～100mg/l、谷胱甘肽5～20mg/l、葡萄糖4000～8000mg/l、磷酸氢二钠600～1100mg/l、氯化钾300～550mg/l、f68600～1100mg/l、乙醇胺盐酸盐20～100mg/l、丙酮酸20～100mg/l、氯化胆碱20～100mg/l、肌醇20～100mg/l、烟酰胺10～40mg/l、核黄素1～5mg/l、维生素b121～5mg/l、生物素2～10mg/l、叶酸2～10mg/l、泛酸钙2～10mg/l、柠檬酸铵铁20～100mg/l、无水硫酸镁20～100mg/l、无水氯化钙20～100mg/l、五水硫酸铜0.001～0.01mg/l、七水硫酸锌1～10mg/l、亚硒酸钠0.001～0.01mg/l、四水氯化锰0.001～0.01mg/l、氯化钠4000～5000mg/l。3.权利要求1或2所述的bhk细胞化学限定培养基的制备方法，其特征在于：称取如权利要求1或2所述的各组分，用水溶解，全部物料配制完成后，总浓度在18～22g/l。4.权利要求1或2所述的bhk细胞化学限定培养基的用途，其特征在于：(a)在bhk细胞培养中的应用；(b)在制备口蹄疫疫苗、新城疫疫苗，伪狂犬疫苗，猪瘟疫苗中的应用。5.一种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、将bhk细胞接种于权利要求1或2所述的bhk细胞化学限定培养基中，对bhk细胞进行培养，实现bhk细胞的扩增；s2、再接种口蹄疫病毒，继续培养，实现口蹄疫病毒的增殖；s3、向收获的口蹄疫病毒液中加入酶混物溶液，消化核酸片段；s4、消化结束后，采用过滤的方式进行纯化；s5、再经过除菌过滤，完成口蹄疫疫苗原液的制备。6.根据权利要求5所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述s1中，按照0.4～0.6
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106cells/ml密度，将bhk细胞接种于bhk细胞化学限定培养基中，培养40～50h。7.根据权利要求5所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述s2中，用bhk细胞化学限定培养基重悬bhk细胞至(6～10)
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106cells/ml，再接种口蹄疫病毒，并于37℃、5％co2、120rpm的摇床培养箱中进行培养，至细胞密度降低至接种病毒时细胞密度的10％以下，收获病毒液。8.根据权利要求5所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述s3中，酶混物溶液是由酶混物用水溶解为液体形式后得到；所述酶混物包括核糖核酸酶和保护剂；
优选地，所述保护剂为动物血清蛋白、精氨酸、甘油、甘露醇、海藻糖中的一种或多种的混合；优选地，所述酶混物为冻干粉形式，是由酶混物液体经冻干工艺处理掉水分后得到；优选地，保护剂为动物血清蛋白、精氨酸、甘油、甘露醇、海藻糖中的一种，所述酶混物液体中核糖核酸酶的量为0.5～10mg/ml,对应活性单位100～2000万u/ml，保护剂的重量占酶混物液体重量的5～50％；优选地，保护剂为动物血清蛋白、精氨酸、甘油、甘露醇、海藻糖中多种的混合，所述酶混物液体中核糖核酸酶的量为0.5～10mg/ml,对应活性单位100～2000万u/ml，动物血清蛋白的重量不超过酶混物液体重量的20％、精氨酸的重量不超过酶混物液体重量的20％、甘油的重量不超过酶混物液体重量的50％，甘露醇的重量不超酶混物液体重量的20％，海藻糖的重量不超过酶混物液体重量的20％；优选地，向收获的口蹄疫病毒液中加入酶混物溶液的量，以所述核糖核酸酶的单位活性量计为：每毫升收获的口蹄疫病毒液中20～300u。9.根据权利要求5所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述s4中，采用切向流过滤的方式进行过滤纯化；优选地，切向流过滤分为浓缩过滤阶段和纯化过滤阶段；浓缩过滤阶段，浓缩后体积占初始体积的5％-20％；纯化过滤阶段，过滤体积不小于浓缩后体积的6倍，不大于浓缩后体积的30倍；优选地，切向流过滤采用的过滤器的分子孔径不低于100kd分子量，不高于1000kd分子量；优选地，切向流过滤采用超滤膜包或中空纤维柱类型的过滤器；优选地，切向流过滤后，料液中宿主蛋白残留不高于300ppm，核糖核酸不高于100ppm。10.根据权利要求5所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述s5中，除菌过滤为采用0.22um除菌过滤器进行过滤。

技术总结
本发明提供了一种BHK细胞化学限定培养基及其应用、口蹄疫疫苗的制备方法，所述BHK细胞化学限定培养基采用了仿血清成分替代技术，不添加血清和水解物，不含蛋白质成分，均采用小分子化合物，在保证BHK细胞生长阶段、病毒扩增阶段足够的营养的同时，还可确保杂质产生的低水平，大幅简化下游纯化步骤。大幅简化下游纯化步骤。


技术研发人员：王俊 徐婧 王怀珣
受保护的技术使用者：上海二三生物技术有限公司
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/28