一种血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花及其制备方法与应用

1.本发明属于复合材料技术领域，具体涉及一种血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花及其制备方法与应用。


背景技术：

2.血红蛋白作为最广泛研究的氧化还原蛋白，价格低廉，具有与辣根过氧化物酶相似结构的活性中心铁卟啉。由于铁卟啉深埋于珠蛋白内部，难与催化底物直接接触，故血红蛋白催化活性远低于辣根过氧化物酶。研究者们通过将血红蛋白固定于纳米材料，解决血红蛋白催化活性低、易变性等问题，传统的固定方法有吸附法、包埋法、共价键法和交联法。这些方法可一定程度上改善血红蛋白的催化活性、稳定性和可循环性，但从本质上未解决铁卟啉深埋的问题。
3.有机-无机杂化纳米花是以生物酶为基础生长磷酸铜纳米片而形成的三维杂化纳米花，该纳米花结合了酶的高催化活性和专一性，磷酸铜的稳定性，是一种优异的酶固定化技术。然而，酶的绝缘性和磷酸铜差的导电性，难实现电活性中心与电极的直接电子转移，这极大限制有机-无机杂化纳米花在电化学生物传感器方面的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服上述现有技术中的问题，提供一种血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花及其制备方法与应用，该纳米花具有血红蛋白固定化稳定、电活性中心裸露度高、电化学性能好的特点，可作为电化学生物传感器敏感材料用于过氧化氢还原。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
6.一种血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，包括以下步骤：
7.在隔绝氧气且持续搅拌的水中，依次加入水溶性淀粉、牛血红蛋白冻干粉、coso4溶液、pbs溶液、feso4溶液和pbs溶液，静置反应，得到血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。
8.进一步的，水与水溶性淀粉的用量比为10～20ml:0.05～0.2mg。
9.进一步的，水与牛血红蛋白冻干粉的用量比为10～20ml:1～10mg。
10.进一步的，水与coso4溶液的用量比为10～20ml:1.25～5ml，coso4溶液的浓度为10mmol/l；
11.水与feso4溶液的用量比为10～20ml:1.25～5ml，feso4溶液的浓度为10mmol/l。
12.进一步的，pbs溶液的总用量与水的体积比为1～2:4。
13.进一步的，依次加入水溶性淀粉、牛血红蛋白冻干粉、coso4溶液、pbs溶液、feso4溶液和pbs溶液时，加入每种原料时间隔时间为5～10min。
14.进一步的，静置反应的温度为10～25℃，时间为24～72h。
15.一种根据如上所述方法制备的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花，形貌呈玫
瑰花状，在磷酸钴纳米花瓣表面垂直生长磷酸铁钴纳米片。
16.一种根据如上所述方法制备的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花作为电化学生物传感器敏感材料，在过氧化氢电催化还原的应用。
17.进一步的，将质量浓度为1～1.5mg/ml血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花悬浮液与nafion溶液按照体积比1～2:1混合，取5.0～10μl混合液涂覆在抛光后玻碳电极表面，获得工作电极；采用三电极体系进行过氧化氢电催化还原，参比电极为ag/agcl、对电极为铂丝，电位窗口为-0.7～0.1v。
18.进一步的，过氧化氢电催化还原在氮气氛围下进行。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.本发明的一种血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，采用血红蛋白为有机组分，钴、亚铁离子溶液为无机组分，水溶性淀粉为分散剂，通过一锅反应法制得血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花，制备工艺简单、原料易得、绿色环保、无需特殊设备，可批量制备。该纳米花呈玫瑰花状，由长方形纳米片指向中心自组装而成，在大的纳米花瓣表面垂直生长小的纳米片，大的比表面积，有利于催化底物是直接接触。纳米花表面具有丰富的电活性中心，其一，血红蛋白四级构象展开，促使电活性中心铁卟啉暴露；其二，钴离子与亚铁离子与血红蛋白相配位，形成可变价态的电活性中心。
21.进一步的，水溶性淀粉为分散剂，抑制磷酸盐晶体过快生长，制得的纳米花粒径均一、形貌规整。
22.进一步的，保持氮气氛围，防止氧气氧化亚铁离子，生成fe(oh)3颗粒。
23.进一步的，加入牛血红蛋白冻干粉、coso4溶液和pbs溶液顺序改变，或间隔时间过长过短，均无法得到本发明中的玫瑰花状结构。
24.进一步的，pbs溶液未分批次加入，或滴加速度过快，均无法得到本发明中的大纳米花瓣表面垂直生长小纳米片的结构。
25.本发明的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花能够作为电化学生物传感器敏感材料，在过氧化氢电催化还原中应用。利用铁钴离子之间的协同作用，不仅促进电活性中心与催化底物之间的电子交换，同时提高有机-无机杂化纳米花本征导电性，加快了电活性中心和电极之间的电子传输。所述敏感材料电化学性能优异，可高效催化过氧化氢还原生成水，易回收、无毒、无污染，在电化学生物传感器领域具备应用前景。
附图说明
26.图1为实施例3制备得到的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的xrd图；
27.图2为实施例3制备得到的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的eds图；
28.图3为实施例3制备得到的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的sem图；
29.图4为实施例3制备得到的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的tem图；
30.图5为实施例6测试所得的过氧化氢浓度与还原峰电流值之间的关系曲线。
31.图6为实施例6测试所得的过氧化氢浓度与还原峰电流值之间的关系曲线。
具体实施方式
32.通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。以下将对本发明提
供的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花及其对过氧化氢电催化还原的应用作进一步说明。
33.(1)血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，包括以下步骤：
34.通过一锅法制备：将氮气通入10～20ml超纯水中，排除氧气并保持氮气氛围，在持续磁力搅拌的情况下，通入氮气20～30min后加入0.05～0.2mg水溶性淀粉；5～10min后加入1～10mg牛血红蛋白冻干粉；5～10min后快速倒入1.25～5ml 10mmol/l的coso4溶液，；5～10min后使用注射器缓慢滴入1.25～5ml浓度为20mmol/l ph＝7.4的pbs溶液；5～10min后快速倒入1.25～5ml 10mmol/l的feso4溶液；5～10min后再次使用注射器缓慢滴入1.25～5ml pbs溶液；5～10min后停止搅拌和通入氮气，密封反应容器，在10～25℃下孵化24～72h，即可制得血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。
35.其中，水溶性淀粉为分散剂，抑制磷酸盐晶体过快生长，制得的纳米花粒径均一、形貌规整。
36.保持氮气氛围，防止氧气氧化亚铁离子，生成fe(oh)3颗粒。
37.加入牛血红蛋白冻干粉、coso4溶液和pbs溶液顺序改变，或间隔时间过长过短，均无法得到本发明中的玫瑰花状结构。
38.pbs溶液未分批次加入，或滴加速度过快，均无法得到本发明中的大纳米花瓣表面垂直生长小纳米片的结构。
39.本发明制备的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花，形貌呈玫瑰花状，利用生物矿化作用，基于血红蛋白分子生长磷酸钴晶体，在大的磷酸钴纳米花瓣表面垂直生长小的磷酸铁钴纳米片。
40.(2)血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花对过氧化氢电催化还原的应用
41.称取4～6mg血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花冻干粉分散于4ml pbs溶液，获得悬浮液；将悬浮液与nafion(全氟磺酸，5wt％)按照体积比1～2:1混合，获得电极修饰液；量取5.0～10μl电极修饰液涂覆在抛光后玻碳电极表面，获得nafion/血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花/玻碳电极。
42.具体的，玻碳电极的预处理：在抛光布表面依次使用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉进行抛光，在乙醇和超纯水中交替超声清洗6次，使用氮气气流吹干电极表面。
43.采用三电极体系进行电化学测试，参比电极为ag/agcl(3m kcl)、对电极为铂丝、nafion/血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花/玻碳电极为工作电极，电位窗口为-0.7～0.1v。
44.电化学测试前在pbs电解液中通入氮气20～30min，测试过程中在电解液液面上方保持氮气氛围，防止氧气产生的电流峰干扰过氧化氢还原信号。
45.本发明制备工艺简单、原料易得、绿色环保、无需特殊设备，可批量制备。所制得纳米花呈玫瑰花状，具有大的比表面积和丰富的电活性中心。铁钴离子之间的协同作用，不仅促进电活性中心与催化底物之间的电子交换，同时提高有机-无机杂化纳米花本征导电性，加快了电活性中心和电极之间的电子传输，可高效催化过氧化氢还原。
46.下面结合具体实施例对本发明进行阐述。
47.实施例1
48.血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备。
49.步骤1：量取10ml超纯水，通入氮气并开始磁力搅拌，排净氧气；
50.步骤2：通入氮气20min后加入0.05mg水溶性淀粉；
51.步骤3：5min后加入1mg牛血红蛋白冻干粉；
52.步骤4：5min后快速倒入1.25ml 10mmol/l的coso4溶液；
53.步骤5：5min后使用注射器缓慢滴入1.25ml浓度为20mmol/l ph＝7.4的pbs溶液；
54.步骤6：5min后快速倒入1.25ml 10mmol/l的feso4溶液；
55.步骤7：5min后再次使用注射器缓慢滴入1.25ml pbs溶液；
56.步骤8：5min后停止搅拌和通入氮气，在10℃下密封孵化24h得到血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。
57.实施例2
58.血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备。
59.步骤1：量取10ml超纯水，通入氮气并开始磁力搅拌，排净氧气；
60.步骤2：通入氮气30min后加入0.05mg水溶性淀粉；
61.步骤3：10min后加入1mg牛血红蛋白冻干粉；
62.步骤4：10min后快速倒入1.25ml 10mmol/l的coso4溶液；
63.步骤5：10min后使用注射器缓慢滴入1.25ml浓度为20mmol/l ph＝7.4的pbs溶液；
64.步骤6：10min后快速倒入1.25ml 10mmol/l的feso4溶液；
65.步骤7：10min后再次使用注射器缓慢滴入1.25ml pbs溶液；
66.步骤8：10min后停止搅拌和通入氮气，在25℃下密封孵化72h，得到血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。
67.实施例3
68.血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备。
69.步骤1：量取20ml超纯水，通入氮气并开始磁力搅拌，排净氧气；
70.步骤2：通入氮气30min后加入0.2mg水溶性淀粉；
71.步骤3：10min后加入10mg牛血红蛋白冻干粉；
72.步骤4：10min后快速倒入5ml 10mmol/l的coso4溶液；
73.步骤5：10min后使用注射器缓慢滴入5ml浓度为20mmol/l ph＝7.4的pbs溶液；
74.步骤6：10min后快速倒入5ml 10mmol/l的feso4溶液；
75.步骤7：10min后再次使用注射器缓慢滴入5ml pbs溶液；
76.步骤8：10min后停止搅拌和通入氮气，在25℃下密封孵化72h，得到血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。
77.实施例4
78.血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备。
79.步骤1：量取15ml超纯水，通入氮气并开始磁力搅拌，排净氧气；
80.步骤2：通入氮气30min后加入0.1mg水溶性淀粉；
81.步骤3：7min后加入4mg牛血红蛋白冻干粉；
82.步骤4：7min后快速倒入2ml 10mmol/l的coso4溶液；
83.步骤5：7min后使用注射器缓慢滴入2.5ml浓度为20mmol/l ph＝7.4的pbs溶液；
84.步骤6：7min后快速倒入2ml 10mmol/l的feso4溶液；
85.步骤7：7min后再次使用注射器缓慢滴入2.5ml pbs溶液；
86.步骤8：7min后停止搅拌和通入氮气，在25℃下密封孵化72h，得到血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。
87.实施例5
88.血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备。
89.步骤1：量取12ml超纯水，通入氮气并开始磁力搅拌，排净氧气；
90.步骤2：通入氮气30min后加入0.15mg水溶性淀粉；
91.步骤3：6min后加入6mg牛血红蛋白冻干粉；
92.步骤4：6min后快速倒入3ml 10mmol/l的coso4溶液；
93.步骤5：6min后使用注射器缓慢滴入1.5ml浓度为20mmol/l ph＝7.4的pbs溶液；
94.步骤6：6min后快速倒入5ml 10mmol/l的feso4溶液；
95.步骤7：6min后再次使用注射器缓慢滴入1.5ml pbs溶液；
96.步骤8：10min后停止搅拌和通入氮气，在25℃下密封孵化72h，得到血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。
97.实施例6
98.血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备。
99.步骤1：量取16ml超纯水，通入氮气并开始磁力搅拌，排净氧气；
100.步骤2：通入氮气30min后加入0.1mg水溶性淀粉；
101.步骤3：8min后加入8mg牛血红蛋白冻干粉；
102.步骤4：8min后快速倒入4ml 10mmol/l的coso4溶液；
103.步骤5：8min后使用注射器缓慢滴入4ml浓度为20mmol/l ph＝7.4的pbs溶液；
104.步骤6：8min后快速倒入3ml 10mmol/l的feso4溶液；
105.步骤7：8min后再次使用注射器缓慢滴入4ml pbs溶液；
106.步骤8：10min后停止搅拌和通入氮气，在25℃下密封孵化72h，得到血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。
107.图1和图2为实施例3制备的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的xrd和eds图谱。由图1可见，血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花复合材料的衍射峰分别与co3(po4)2·
8h2o(jcpds 41-0375)和co3fe4(po4)6(jcpds 49-1083)的标准衍射峰相对应，且没有其它杂质峰，峰型尖锐，说明成功制备出了血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴复合材料。图2表明，血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花所由co、fe、p、o、c及n元素组成，其中c和n元素来源于血红蛋白。
108.图3和图4为实施例3制备的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的sem和tem图谱。从图3和图4可以看出，血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花形貌呈玫瑰花状，由长方形纳米片指向中心自组装而成，在大的纳米花瓣表面垂直生长小的纳米片，花球粒径为3～5μm。
109.实施例7
110.nafion/血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花/玻碳电极的制备。
111.步骤1：称取6mg实施例3所制得血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花冻干粉分散于4ml pbs溶液，获得悬浮液；
112.步骤2：将悬浮液与nafion(全氟磺酸，5wt％)按照体积比2:1混合，获得电极修饰液；
113.步骤3：在抛光布表面依次使用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉对玻碳电极进行抛光，在乙醇和超纯水中交替超声清洗6次，使用氮气气流吹干电极表面；
114.步骤4：量取10μl电极修饰液涂覆在抛光后玻碳电极表面，获得nafion/血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花/玻碳电极，储存于4℃冰箱中。
115.实施例8
116.nafion/血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花/玻碳电极的制备。
117.步骤1：称取4mg实施例3所制得血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花冻干粉分散于4ml pbs溶液，获得悬浮液；
118.步骤2：将悬浮液与nafion(全氟磺酸，5wt％)按照体积比1:1混合，获得电极修饰液；
119.步骤3：在抛光布表面依次使用1.0、0.3和0.05μm氧化铝粉对玻碳电极进行抛光，在乙醇和超纯水中交替超声清洗6次，使用氮气气流吹干电极表面；
120.步骤4：量取5μl电极修饰液涂覆在抛光后玻碳电极表面，获得nafion/血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花/玻碳电极，储存于4℃冰箱中。
121.实施例9
122.nafion/血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花/玻碳电极对过氧化氢电催化还原的应用。
123.步骤1：配制100ml浓度为0.1mol/l ph＝7.4的pbs溶液，将该溶液作为电解液，通入氮气30min，排净溶液中氧气；
124.步骤2：使用实施例8所制得nafion/血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花/玻碳电极为工作电极，ag/agcl(3mol/l kcl溶液)为参比电极、铂丝为对电极，通过循环伏安法，对含有不同浓度(0-500μmol/l，参见图6)过氧化氢的pbs溶液进行测试，电位窗口为-0.7～0.1v。
125.图5显示nafion/血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花/玻碳电极在含不同浓度过氧化氢的pbs溶液中测试所得的循环伏安曲线，随着过氧化氢浓度的增加，还原峰电流值逐渐增大，说明血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花在过氧化氢电催化还原方面展现优异性能。
126.图6为过氧化氢浓度与还原峰电流值之间的关系曲线，在2～350μmol/l浓度范围内线性关系良好。
127.本发明的杂化材料可作为电化学生物传感器敏感材料，构筑电化学生物传感器，用于过氧化氢检测。
128.以上仅为本发明实施例中的较佳实施例而已，因此不能仅以此来限定本发明之权利范围，依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

技术特征：
1.一种血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在隔绝氧气且持续搅拌的水中，依次加入水溶性淀粉、牛血红蛋白冻干粉、coso4溶液、pbs溶液、feso4溶液和pbs溶液，静置反应，得到血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。2.根据权利要求1所述的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，其特征在于，水与水溶性淀粉的用量比为10～20ml:0.05～0.2mg。3.根据权利要求1所述的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，其特征在于，水与牛血红蛋白冻干粉的用量比为10～20ml:1～10mg。4.根据权利要求1所述的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，其特征在于，水与coso4溶液的用量比为10～20ml:1.25～5ml，coso4溶液的浓度为10mmol/l；水与feso4溶液的用量比为10～20ml:1.25～5ml，feso4溶液的浓度为10mmol/l。5.根据权利要求1所述的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，其特征在于，pbs溶液的总用量与水的体积比为1～2:4。6.根据权利要求1所述的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，其特征在于，依次加入水溶性淀粉、牛血红蛋白冻干粉、coso4溶液、pbs溶液、feso4溶液和pbs溶液时，加入每种原料时间隔时间为5～10min。7.根据权利要求1所述的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花的制备方法，其特征在于，静置反应的温度为10～25℃，时间为24～72h。8.一种根据权利要求1～7中任意一项所述方法制备的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花，其特征在于，形貌呈玫瑰花状，在磷酸钴纳米花瓣表面垂直生长磷酸铁钴纳米片。9.一种根据权利要求1～7中任意一项所述方法制备的血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花作为电化学生物传感器敏感材料，在过氧化氢电催化还原的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将质量浓度为1～1.5mg/ml血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花悬浮液与nafion溶液按照体积比1～2:1混合，取5.0～10μl混合液涂覆在抛光后玻碳电极表面，获得工作电极；采用三电极体系进行过氧化氢电催化还原，参比电极为ag/agcl、对电极为铂丝，电位窗口为-0.7～0.1v。

技术总结
本发明公开了一种血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花及其制备方法与应用，属于复合材料技术领域，通过一锅法，在隔绝氧气且持续搅拌的水溶液中，依次加入水溶性淀粉、牛血红蛋白冻干粉、CoSO4溶液、PBS溶液、FeSO4溶液和PBS溶液，静置反应，得到血红蛋白-磷酸钴-磷酸铁钴杂化纳米花。该合成方法工艺简单、原料易得、绿色环保、无需特殊设备，可批量制备。所制得纳米花呈玫瑰花状，具有大的比表面积和丰富的电活性中心。铁钴离子之间的协同作用，不仅促进电活性中心与催化底物之间的电子交换，同时提高有机-无机杂化纳米花本征导电性，加快了电活性中心和电极之间的电子传输，可高效催化过氧化氢还原。化过氧化氢还原。化过氧化氢还原。


技术研发人员：高娇娇 高晓明 张婷
受保护的技术使用者：延安大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/28