活性氧活性氮响应的纳米复合胶束及其制备方法和纳米载药胶束

1.本发明涉及生物材料和纳米医学技术领域，具体而言，涉及活性氧活性氮响应的纳米复合胶束及其制备方法和纳米载药胶束。


背景技术：

2.类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,ra)逐渐损害病人关节功能并最终导致残疾，显著降低病人生活质量，构成严重的社会负担。目前临床上广泛使用类固醇激素或其他免疫抑制药物以治疗类风湿性关节炎，然而其治疗效果易因产生耐药性、生物利用度差以及发生骨质疏松症、糖尿病和肝功能异常等不良反应而受到限制。近年来，越来越多的研究集中针对类风湿关节炎中的活性氧(reactive oxygen species,ros)和活性氮(reactive nitrogen species,rns)。活性氧与活性氮是不稳定和高活性的含氧与含氮物质，二者的过量产生是类风湿性关节炎的重要标志。一方面,过量产生的活性氧促进肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-1β(il-1β)和白细胞介素-6(il-6)等炎性细胞因子的产生，上述细胞因子与ros的相互作用加速类风湿性关节炎的进展。另一方面，类风湿关节炎中活化的巨噬细胞会产生高水平的一氧化氮(no)。该活性氮作为促炎介质在关节炎炎症及炎症级联反应中发挥关键作用。因此，清除类风湿关节炎中高水平的内源性活性氧和活性氮有望实现类风湿性关节炎的治疗。
3.迄今为止，治疗类风湿性关节炎的相关研究主要通过递送小分子抑制剂包括一氧化氮合酶抑制剂(nitric oxide synthase,nos)或抗氧化药物来下调活性氧与活性氮。此外，使用抗氧化药物(如维生素，天然多酚等)可有效降低炎症性疾病的活性氧水平。然而，传统的小分子药物存在结构稳定性差，清除活性差和关节靶向递送效率低等问题。作为小分子药物的替代品，具备高效清除活性氧或活性氮的功能性纳米材料已显示治疗类风湿性关节炎的巨大潜力，尤其是考虑到纳米材料的自组装体可以通过炎症部位增加的血管通透性和炎性细胞摄取(extravasation through leaky vasculature and subsequent inflammatory cell-mediated sequestration,elvis)效应，增加其在关节炎部位的积累。此外有研究表明，自身具备清除ros或rns的纳米载体递送抗类风湿关节炎药物以实现联合治疗可显著增强类风湿关节炎的治疗效果。因此，开发可长期清除ros和rns的活性纳米清除剂材料对于提高类风湿性关节炎的治疗效果具有重要意义。
4.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供活性氧活性氮响应的纳米复合胶束及其制备方法和纳米载药胶束。本发明提供的纳米复合胶束能够同时实现活性氧活性氮响应，即该纳米复合胶束在高浓度活性氧和活性氮的病灶部位下转变为亲水性物质，纳米复合胶束裂解，活性成分在靶向部位释放，进而去除病灶。
6.本发明是这样实现的：
7.第一方面，本发明提供一种活性氧活性氮响应的纳米复合胶束，其由活性氧响应的聚乙二醇嵌段聚合物a和活性氮响应的聚乙二醇嵌段聚合物b组成。
8.在可选的实施方式中，所述聚乙二醇嵌段聚合物a包括胆红素-聚乙二醇，所述聚乙二醇嵌段聚合物b包括邻苯二胺-聚乙二醇。
9.在可选的实施方式中，所述胆红素-聚乙二醇的分子量为1000-5000da，所述邻苯二胺-聚乙二醇的分子量为1000-10000da；
10.优选地，所述胆红素-聚乙二醇和所述邻苯二胺-聚乙二醇中聚乙二醇的分子量分别为1000-4000da，且其差值《2000da。
11.在可选的实施方式中，所述聚乙二醇嵌段聚合物a和所述聚乙二醇嵌段聚合物b的质量比为1:1-1:5。
12.第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束的制备方法，包括：将活性氧响应的聚乙二醇嵌段聚合物a和活性氮响应的聚乙二醇嵌段聚合物b进行自组装。
13.在可选的实施方式中，包括：通过乳化-溶剂蒸发法进行自组装。
14.第三方面，本发明提供一种纳米载药胶束，其包括药物成分和前述实施方式任一项所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束，所述药物成分负载于所述纳米复合胶束。
15.在可选的实施方式中，所述纳米载药胶束为核-壳结构，其中，核为所述纳米复合胶束的疏水端组成的区域，壳为所述纳米复合胶束的亲水端组成的区域，所述药物成分位于所述核-壳结构的核内。
16.在可选的实施方式中，所述纳米载药胶束的粒径为50-300nm，优选为140nm；
17.优选地，所述药物成分与所述纳米复合胶束的质量比为1:1-1:10；
18.优选地，所述药物成分为抗炎药物，优选祛风湿药物，更优选为羌活醇。
19.第四方面，本发明提供一种纳米载药胶束在制备治疗类风湿性关节炎的药物方面的应用。
20.第五方面，本发明提供一种药物制剂，所述药物制剂用于治疗类风湿性关节炎，其包括前述实施方式任一项所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束或前述实施方式所述的纳米载药胶束，所述药物制剂为静脉注射剂。
21.本发明具有以下有益效果：本发明实施例通过能活性氧响应的聚乙二醇嵌段聚合物a和活性氮响应的聚乙二醇嵌段聚合物b自组装形成的纳米复合胶束能够同时实现活性氧和活性氮的响应，继而在高浓度活性氧和活性氮的病灶部位下转变为亲水性物质，纳米复合胶束裂解，活性成分在病灶部位释放，进而去除病灶。同时，该纳米复合胶束稳定，提升药物成分的效果。且该纳米复合胶束进入病灶部位后，能够快速释放，降低了ros和no的含量，载体生物相容性好，解决了药物释放速率慢和作用部位广泛的缺点，提高了药物治疗的效果。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对
范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
23.图1为本发明实施例1和2提供的胆红素-聚乙二醇和邻苯二胺-聚乙二醇的合成路线图；
24.图2为本发明实施例1提供的胆红素-聚乙二醇的红外光谱图；
25.图3为本发明实施例2提供的邻苯二胺-聚乙二醇的红外光谱图；
26.图4为本发明实施例3提供的nbop纳米载药胶束的粒径分布图；
27.图5为本发明实施例3提供的nbop纳米载药胶束的扫描电镜图；
28.图6为本发明实施例3提供的nbop纳米载药胶束的紫外光谱图；
29.图7为本发明实施例3提供的nbop纳米载药胶束的稳定性实验；
30.图8为本发明实施例3提供的nbop纳米载药胶束的体外药物释放曲线；
31.图9为本发明实验例1提供的nbop纳米载药胶束在m0和m1巨噬细胞的细胞活性图；
32.图10为本发明实验例1提供的羌活醇(not)在raw264.7巨噬细胞中的细胞活性图；
33.图11为本发明实验例1提供的香豆素6(c6)和负载c6的bop纳米胶束在raw264.7巨噬细胞中的细胞摄取图，比例尺为500μm；
34.图12为本发明实验例1提供的cbp、cop和cbop纳米胶束在m0巨噬细胞中的摄取流式图(a)和荧光强度定量图(b)；
35.图13为本发明实验例1提供的cbp、cop和cbop纳米胶束在m1巨噬细胞中的摄取流式图(a)和荧光强度定量图(b)；
36.图14为本发明实验例2提供的使用dcfh-da荧光探针靶向nbp、nop和nbop纳米胶束处理后的胞内活性氧荧光成像图，比例尺为200μm；
37.图15为本发明实验例2提供的胞内活性氧水平的流式分析图；
38.图16为本发明实验例2提供的dcfh-da的荧光定量图；
39.图17为本发明实验例2提供的各纳米胶束在培养基上清的过氧化氢定量图；
40.图18为本发明实验例2提供的使用daf-fm da荧光探针靶向nbp、nop和nbop纳米胶束处理后的胞内一氧化氮荧光成像图，比例尺为200μm；
41.图19为本发明实验例2提供的胞内一氧化氮水平的流式分析图；
42.图20为本发明实验例2提供的daf-fm da的荧光定量图；
43.图21为本发明实验例2提供的各纳米胶束在培养基上清的一氧化氮定量图。
具体实施方式
44.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
45.第一方面，本发明提供一种活性氧活性氮响应的纳米复合胶束，其由能活性氧响应的聚乙二醇嵌段聚合物a和活性氮响应的聚乙二醇嵌段聚合物b组成。
46.其中，聚乙二醇嵌段聚合物a包括胆红素-聚乙二醇，即br-peg，其亲水端为甲氧基聚乙二醇mpeg，疏水端为胆红素br；其分子量为1000-5000da，例如，1000da、1500da、
2000da、2500da、3000da、3500da、4000da、4500da以及5000da等1000-5000da之间的任意数值或任意两个数值形成的范围值。
47.聚乙二醇嵌段聚合物b包括邻苯二胺-聚乙二醇，即opda-peg，其亲水端为甲氧基聚乙二醇mpeg，疏水端为邻苯二胺opda；其分子量为1000-10000da，例如，1000da、2000da、3000da、4000da、5000da、6000da、7000da、8000da、9000da、以及10000da等1000-10000da等之间的任意数值或任意两个数值形成的范围值。
48.本发明实施例分别以邻苯二胺和胆红素形成邻苯二胺-聚乙二醇和胆红素-聚乙二醇，两者形成的纳米复合胶束能够实现活性氧活性氮双响应，继而可以在通过elvis效应靶向炎症微环境。在具有高水平活性氧和一氧化氮的关节炎环境中，聚合物疏水端的胆红素和邻苯二胺分别消耗活性氧和一氧化氮，并被氧化为亲水性化合物，促使纳米复合胶束裂解以释放活性成分。总而言之，该活性氧活性氮双响应载药胶束不仅下调活性氧/活性氮，而且多通路多靶点抑制炎症。为了更好地应用上述方法到抗炎领域中。
49.进一步地，胆红素-聚乙二醇和所述邻苯二胺-聚乙二醇中聚乙二醇的分子量为1000-4000da，且其差值《2000da，例如，300da、1000da、1500da、2000da、2500da、3000da、3500da以及4000da等1000-4000da之间的任意数值或任意两个数值形成的范围值。差值为100da、300da、500da、1000da等《2000da之间的任意数值。
50.进一步地，聚乙二醇嵌段聚合物a和所述聚乙二醇嵌段聚合物b的质量比为1:1-1:5。例如质量比为1:1、1:2、1:3、1:4、以及1:5等1:1-1:5之间的任意数值或任意两个数值形成的范围值。
51.第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束的制备方法，包括：将活性氧响应的聚乙二醇嵌段聚合物a和活性氮响应的聚乙二醇嵌段聚合物b进行自组装。
52.在可选的实施方式中，包括：通过乳化-溶剂蒸发法进行自组装。
53.需要说明的是，胆红素-聚乙二醇和所述邻苯二胺-聚乙二醇中聚乙二醇的制备为本领域公知，本发明实施例不再进行详述。
54.第三方面，本发明提供一种纳米载药胶束，其包括药物成分和前述实施方式任一项所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束，所述药物成分负载于所述纳米复合胶束。
55.具体地，所述纳米载药胶束为核-壳结构，其中，核为所述纳米复合胶束的疏水端组成的区域，壳为所述纳米复合胶束的亲水端组成的区域，所述药物成分位于所述核-壳结构的核内。
56.其中，纳米载药胶束的粒径为50-300nm，优选为140nm；例如，粒径为50nm、80nm、100nm、120nm、150nm、180nm、200nm、240nm、260nm、280nm以及300nm等50-300nm之间的任意数值或任意两个数值形成的范围值。
57.所述药物成分与所述纳米复合胶束的质量比为1:1-1:10；例如为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1：6、1:7、1:8、1:9以及1:10等1:1-1:10之间的任意数值或任意两个数值形成的范围值。
58.纳米复合胶束的质量约等于聚乙二醇嵌段聚合物a和所述聚乙二醇嵌段聚合物b的质量总和。
59.优选地，所述药物成分为抗炎药物，优选祛风湿药物，更优选为羌活醇。
60.本发明实施例只是以羌活醇为例进行举例，其他的祛风湿或者抗炎药物也在本发明的保护范围内。
61.具体地，janus激酶/信号转导子和转录活化子(jak-stat)信号通路对于调节类风湿关节炎的发病机制和进展至关重要。jak-stat通路的激活导致多种炎性细胞因子和趋化因子的高表达，因此是治疗类风湿性关节炎极具吸引力的靶点之一。据报道，中药来源的活性成分羌活醇可直接与jak2和jak3激酶结构域中的关键位点结合，从而抑制jak-stat信号传导，减少炎症细胞因子和趋化因子产生。羌活醇提取方便，长期治疗成本低，是治疗类风湿性关节炎有潜力的候选药物。综上所述，开发具有活性氧/活性氮清除作用的纳米载体以递送jak-stat抑制剂，可多靶点作用实现有效的类风湿关节炎联合治疗。
62.而本发明实施例利用ros响应性分子胆红素(br)和no响应性分子邻苯二胺(opda)修饰聚乙二醇得到两亲性嵌段聚合物(br-peg和opda-peg)，自组装形成胶束以负载中药来源的jak-stat抑制剂羌活醇(not@br/opda-peg，nbop nps)。具体而言，该活性氧活性氮双响应纳米载药胶束可通过elvis效应靶向炎症微环境。在具有高水平活性氧和一氧化氮的关节炎环境中，聚合物疏水端的胆红素和邻苯二胺分别消耗活性氧和一氧化氮，并被氧化为亲水性化合物，促使纳米载药胶束裂解以释放羌活醇。羌活醇抑制jak-stat通路以抑制促炎细胞因子和趋化因子。总而言之，该活性氧活性氮双响应纳米载药胶束不仅下调活性氧/活性氮，而且多通路多靶点抑制炎症从而缓解类风湿性关节炎。为了更好地应用上述方法到类风湿性关节炎治疗领域中，特提出本发明实施例。
63.第四方面，本发明提供一种药物制剂，所述药物制剂用于治疗类风湿性关节炎，其包括前述实施方式任一项所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束或前述实施方式所述的纳米载药胶束。
64.该药物制剂再纳米载药胶束进入炎症部位后，在炎症环境下快速释放，降低了ros和no的含量，载体生物相容性好，解决了药物释放速率慢和作用部位广泛的缺点，提高了药物治疗类风湿性关节炎的效果。且该药物制剂分别具有ros和no响应性，可在高水平ros和no环境中被反应成亲水物质从而快速释放。
65.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
66.实施例1
67.本实施例提供一种胆红素-聚乙二醇(br-peg)的合成方法，
68.胆红素-聚乙二醇是胆红素在-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的催化下与聚乙二醇-氨基通过酰胺键结合得到(合成路径参见图1中a)。
69.具体操作如下：
70.将胆红素(br,1.49mg,2.5μm)溶解在1ml氯仿，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl,1.46mg)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs,0.88mg)各溶解在1ml氯仿中，按先后顺序加入圆底烧瓶并避光搅拌1h以激活羧基。然后将mpeg
2000-nh2(12.5mg,2.5μm)溶解在1ml氯仿并与br溶液混合。将混合物在室温下避光搅拌12h，用浓度为0.1m的hcl洗涤三次，收集有机相。旋转蒸发除去氯仿。使用甲醇溶解产物并通过过滤除去沉淀，旋转蒸发后的产物真空干燥后收集备用。
71.表征：红外光谱用于确认产物。如图2所示，br-peg的红外光谱中可以观察到来自br和peg-nh2的特征吸收带，证明br-peg被成功合成(分子量为2585da)。
72.实施例2
73.本实施例提供一种邻苯二胺-聚乙二醇(opda-peg)的合成方法，
74.邻苯二胺-聚乙二醇是邻苯二胺修饰后的apuema与巯基-聚乙二醇通过“烯键-巯基”点击反应合成得到(其合成路径参见图1中b)。
75.具体操作如下：
76.将邻苯二胺(opda,2.7g,25mmol)溶解在100ml无水乙腈中。2-甲基丙烯酸异氰基乙酯(3.88g,25mmol)溶解在20ml无水乙腈中并滴加到含邻苯二胺的乙腈溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，旋转蒸发除去乙腈并将残余物沉淀到过量的乙醚中以除去任何未反应的邻苯二胺和2-甲基丙烯酸异氰基乙酯。收集不溶性固体并用乙醚洗涤3次。得到apuema，为白色固体。
77.用2ml四氢呋喃溶解10mg apuema，3ml四氢呋喃溶解111mg mpeg
2000-sh，4mg安息香二甲醚作为点击反应催化剂用1ml四氢呋喃溶解，并按顺序依次加入圆底烧瓶搅拌。通入5分钟氮气以除去溶液中的氧气，使用光功率为107mw/cm2的紫外灯光照上述四氢呋喃溶液并避光封口。2h后旋蒸除去大部分四氢呋喃，剩余四氢呋喃溶液加入过量乙醚并充分混匀，2000rpm离心3分钟，弃上清，重复2次。将沉淀物置于真空干燥器真空干燥12h后得到peg-opda(分子量为2265da)。
78.表征：红外光谱用于确认产物。如图3所示，在opda-peg的红外光谱中可以观察到来自apuema和mpeg-sh的特征吸收带，证明opda-peg被成功合成。
79.实施例3
80.本实施例提供一种纳米载药胶束的制备方法，包括：
81.纳米载药胶束由上述实施例1和实施例2聚合物和药物通过乳化-溶剂法得到。具体操作如下：
82.用氯仿将实施例1制备得到的br-peg和实施例2制备得到的opda-peg和羌活醇(not)配置成10mg/ml的溶液待用。使br-peg和opda-peg的投料质量比分别为1:1的比例混合，总重量为6mg。加入0.1ml not氯仿溶液，加入去离子水(7ml)后用超声细胞破碎机乳化，参数为：超声5s，间隔5s，总时长5min，功率40％，在冰浴下将混合物超声乳化。旋转蒸发除去氯仿，得到nbop胶束。4℃避光保存。
83.表征：对得到的nbop胶束进行平均粒径检测、扫描电镜和紫外光谱检测，结果参见图4-图6。
84.根据图4可知，制备的nbop胶束平均粒径为137.7nm，电位为+4.69mv，最大载药率为9.53％，包封率为91.01％。根据图5可知，nbop胶束的扫描电子显微镜图像显示单分散球形纳米颗粒，直径约为140nm，这与测得的胶束平均粒径的结果一致。nbop胶束的粒径适用于药物输送，通过elvis效应来治疗ra。进行紫外-可见光谱以进一步证实nbop纳米胶束的制备。br-peg和opda-peg在310nm左右没有明显吸光度，而nbop和not在此表现出最大吸收峰(参见图6)。上述结果均说明本发明实施例制备得到nbop胶束。
85.稳定性研究：
86.在4℃下储存nbop胶束以研究了nbop的长期稳定性。结果见图7，根据图7可知，在4℃下储存的nbop胶束的尺寸和pdi在7天内没有明显变化，表明nbop具有良好的稳定性。
87.体外药物释放研究：
88.通过透析法研究了nbop的体外释放曲线，结果见图8，根据图8可知，在没有h2o2和no的情况下，只有54％的not被释放。然而，在1mm h2o2和100μm no处理72小时后，nbop分别释放了约85％和77％的总not。
89.这些结果表明，由于ros响应部分胆红素和no响应部分邻苯二胺在h2o2和no存在下促进nbop崩解，因此nbop纳米胶束表现出双重ros和no响应药物释放。
90.实施例4-实施例7
91.参照实施例3的方法制备纳米载药胶束，区别在于物质用量不同，具体如下：
92.实施例4：br-peg和opda-peg的投料质量比分别为1:2，羌活醇与br-peg和opda-peg总质量的比例为：1:10。
93.实施例5：br-peg和opda-peg的投料质量比分别为1:5，羌活醇与br-peg和opda-peg总质量的比例为：1:1。
94.实施例6：br-peg和opda-peg的投料质量比分别为1:3，羌活醇与br-peg和opda-peg总质量的比例为：1:7。
95.实施例7：br-peg和opda-peg的投料质量比分别为1:4，羌活醇与br-peg和opda-peg总质量的比例为：1:4。
96.实验例1
97.研究纳米载药胶束的细胞毒性和细胞摄取
98.使用mtt法评价游离药物not和nbop胶束的细胞毒性。将对数生长期的raw264.7细胞接种于96孔板，密度为1
×
104细胞/孔，37℃孵育过夜。分别将不同浓度的游离药物not和nbop胶束溶液加入各孔中，同时设置空白对照孔，每个浓度设置3个复孔，37℃孵育24h。随后每孔加入20μl 5mg/ml的mtt溶液，37℃继续培养4h后，取出96孔板，弃去培养液。每孔加入100μl的dmso，振荡10min，溶解活细胞产生的甲臢结晶，然后将96孔板置于酶标仪中，测定各孔在490nm处的吸光度值：按如下公式计算细胞活率：
99.细胞存活率＝样品的吸光度值/空白对照的吸光度值
×
100％
100.结果见图9和图10。根据图9可知，在非等效浓度范围(0.625-20μm)下，在m0和m1巨噬细胞中均未观察到nbop的毒性。值得注意的是，浓度为20μm的游离not在暴露于细胞时表现出强烈的毒性(图10)。这些结果表明，胆红素和邻苯二胺修饰不会影响聚乙二醇的生物相容性，并且在低于20μm的剂量下进一步使用是安全的。
101.随后采用dmi8倒置荧光显微镜定性考察lps刺激的raw264.7细胞对胶束的摄取，并用流式细胞仪对其定量。具体步骤为：以每孔5
×
104个细胞的密度接板(24孔板)，于细胞培养箱中孵育过夜。加入脂多糖(lps，终浓度为1μg/ml)孵育24h。而后lps刺激细胞分别与香豆素6(c6)标记的胶束溶液(终浓度为0.25μg/ml)共孵育6h，用pbs清洗3次除掉细胞表面吸附的胶束及其他杂质。加入hoechst 33342染色细胞核，随后用pbs清洗3次。置于dmi8倒置荧光显微镜下观察并拍照。
102.结果见图11-13。根据图11可知，c6@br/opda-peg(cbop)纳米粒与细胞共孵育1、2、3、4小时后表现出比游离c6更强的绿色荧光，表明bop的包封可以显着改善细胞摄取。根据图12可知，m0巨噬细胞对cbop纳米胶束的摄取比c6@br-peg(cbp)纳米胶束高2.1倍，比c6@opda-peg(cop)纳米胶束高6.2倍(图12中a和b)。根据图13可知，在m1巨噬细胞中也观察到类似的细胞摄取结果(图13中a和b)。这些结果证实了nbop纳米胶束可以在体外有效地靶向
巨噬细胞。
103.实验例2
104.纳米载药胶束消除胞内活性氧和活性氮
105.将raw264.7细胞以每孔5
×
104的密度接种在24孔板中，加入lps(10μg/ml)刺激24h。将细胞用not@br-peg np(nbp)、not@opda-peg np(nop)和nbop处理24h后，使用dcfh-da处理细胞，pbs洗涤3次，荧光显微镜观察。进行流式细胞术分析以定量细胞荧光强度。通过使用过氧化氢测定试剂盒评估培养物上清液中的过氧化氢水平。
106.结果见图14-图16，lps刺激的巨噬细胞(m1型)显示出比m0巨噬细胞更亮的dcfh-da荧光发射(图14)。nop不影响ros水平。然而，nbp纳米粒子和nbop纳米粒子都显着降低了绿色荧光，表明胆红素修饰纳米粒子具有有效的ros消耗活性。通过流式细胞术进一步量化细胞内dcfh-da信号(图15)。与lps刺激的巨噬细胞相比，nbp和nbop中dcfh-da的荧光强度降低了约39％和64％，这与荧光成像结果一致(图16)。
107.通过使用铁-二甲酚橙复合物的氢过氧化物测定法评估了不同纳米胶束处理组中培养物上清液的过氧化氢水平。
108.结果见图17。在lps刺激的巨噬细胞中，与空白组相比，nbp和nbop组的过氧化氢水平分别降低了30.6％和14.4％(图17)。这些结果表明nbop纳米胶束是缓解ra治疗氧化应激的潜在药物。
109.将raw 264.7细胞以5
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104个细胞/孔的密度接种在500μl dmem培养基中的24孔板上，培养12h。随后往细胞中加入lps(10μg/ml)刺激24h。将细胞用nbp、nop和nbop纳米粒处理24h后，使用daf-fm da处理细胞，pbs洗涤3次，荧光显微镜观察。进行流式细胞术分析以定量研究细胞的荧光强度。griess检测试剂盒检测不同组细胞上清液中一氧化氮水平。
110.结果见图18-20，daf-fm da信号在m1巨噬细胞中比在m0巨噬细胞中更强。nop和nbop纳米粒子处理后荧光强度显着降低，而nbp纳米粒子没有减弱绿色荧光(图18)。流式细胞术用于量化细胞内daf-fm da信号(图19)。m1巨噬细胞中da-fm da的荧光强度显着高于m0，经nop和nbop纳米胶束处理后荧光强度分别降低4.2倍和12.3倍，表明nbop纳米粒具有强效的no清除作用(图20)。
111.还通过griess测定评估了培养物上清液中的一氧化氮水平。nop和nbop还降低了培养上清液中的一氧化氮水平，这与da-fm da染色结果一致(图21)。
112.因此，nbop纳米胶束可有效清除巨噬细胞的一氧化氮以治疗ra。
113.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种活性氧活性氮响应的纳米复合胶束，其特征在于，其由活性氧响应的聚乙二醇嵌段聚合物a和活性氮响应的聚乙二醇嵌段聚合物b组成。2.根据权利要求1所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束，其特征在于，所述聚乙二醇嵌段聚合物a包括胆红素-聚乙二醇，所述聚乙二醇嵌段聚合物b包括邻苯二胺-聚乙二醇。3.根据权利要求2所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束，其特征在于，所述胆红素-聚乙二醇的分子量为1000-5000da，所述邻苯二胺-聚乙二醇的分子量为1000-10000da；优选地，所述胆红素-聚乙二醇和所述邻苯二胺-聚乙二醇中聚乙二醇的分子量分别为1000-4000da，且其差值<2000da。4.根据权利要求1-3任一项所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束，其特征在于，所述聚乙二醇嵌段聚合物a和所述聚乙二醇嵌段聚合物b的质量比为1:1-1:5。5.一种权利要求1所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束的制备方法，其特征在于，包括：将活性氧响应的聚乙二醇嵌段聚合物a和活性氮响应的聚乙二醇嵌段聚合物b进行自组装。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括：通过乳化-溶剂蒸发法进行自组装。7.一种纳米载药胶束，其特征在于，其包括药物成分和权利要求1-3任一项所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束，所述药物成分负载于所述纳米复合胶束。8.根据权利要求7所述的纳米载药胶束，其特征在于，所述纳米载药胶束为核-壳结构，其中，核为所述纳米复合胶束的疏水端组成的区域，壳为所述纳米复合胶束的亲水端组成的区域，所述药物成分位于所述核-壳结构的核内；优选地，所述纳米载药胶束的粒径为50-300nm，优选为140nm；优选地，所述药物成分与所述纳米复合胶束的质量比为1:1-1:10；优选地，所述药物成分为抗炎药物，优选祛风湿药物，更优选为羌活醇。9.权利要求7所述的纳米载药胶束在制备治疗类风湿性关节炎的药物方面的应用。10.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂用于治疗类风湿性关节炎，其包括权利要求1-3任一项所述的活性氧活性氮响应的纳米复合胶束或权利要求7所述的纳米载药胶束；所述药物制剂为静脉注射剂。

技术总结
本发明涉及生物材料和纳米医学技术领域，具体而言，涉及活性氧活性氮响应的纳米复合胶束及其制备方法和纳米载药胶束。活性氧活性氮响应的纳米复合胶束由活性氧响应的聚乙二醇嵌段聚合物A和活性氮响应的聚乙二醇嵌段聚合物B组成。该纳米复合胶束在高浓度活性氧和活性氮的炎症部位下转变为亲水性物质，纳米复合胶束裂解，活性药物在炎症部位释放，进而抑制炎症。炎症。炎症。


技术研发人员：陈美婉 梁瑞峰 花鹏
受保护的技术使用者：澳门大学
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/28