利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法

1.本发明涉及一种利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，属于土壤重金属修复技术领域。


背景技术：

2.盐渍化土在我国分布广泛，从热带到寒带、从滨海到内陆、从湿润地区到极端干旱的荒漠地区，均分布有大量盐渍化土。西北、华北、东北地区以及东部沿海地区是我国盐渍化土的主要集中分布区域，我国盐渍化土的总面积约为3600
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104hm2，占全国可利用土地面积的4.88％。许多盐渍化土受到了重金属(比如铅)的污染，盐渍化土中的盐分，包括nacl、na2so4、mgcl2、mgso4等，会活化土壤重金属，加剧重金属的生态风险。
3.目前，已经开发了多种土壤铅污染修复方法，包括物理修复法、化学修复法和生物修复法。物理修复法主要有客土法、换土法等，这类工程施工量大、污染修复投入的成本高，并且土壤置换后极易破坏本地环境的土体结构，造成土壤肥力下降，只适用于修复面积小且铅污染浓度高的土壤，对于地区性、面积广且浓度低的铅污染土壤不具有经济性。化学修复法主要是向污染土壤中加入钝化剂提升土壤自身的吸附和沉淀作用，从而降低土壤中铅的生物可利用性，减少污染物迁移，一定程度上可以改变土壤铅污染问题，但化学钝化剂存在破坏土壤理化性质、修复效果持久性差等问题。微生物修复法作为一种低成本且环境友好型方法，修复土壤铅污染的微生物修复方法包括生物吸附和生物成矿，生物吸附对铅的吸附钝化有不错的效果，但是环境中大量存在的其他阳离子会竞争吸附位点，而且细胞凋亡或分散后吸附的铅会被重新释放，难以真正应用到铅污染场地，而生物成矿具有修复效率高、成本低、操作简单等特点。
4.传统生物成矿技术是采用尿素型微生物诱导碳酸盐成矿技术，而尿素的大量使用会导致土壤氨氮问题，大量铵根离子会与pb等重金属阳离子形成金属氨络合物，反而加剧重金属的溶解，同时会产生土壤板结问题。此外，传统生物成矿技术会采用氯化钙作为钙源，在土壤修复后会残留大量氯离子，加剧土壤的盐渍化，不适用于盐渍化土的重金属修复。
5.综上所述，面对大面积、但中低浓度铅污染的盐渍化土，亟需一种经济、高效、且稳定的修复方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用施氏假单胞菌生物成矿过程修复盐渍化土铅污染的方法。本方法利用施氏假单胞菌降解醋酸钙和柠檬酸钙，原位矿化修复土壤重金属铅污染，与传统生物矿化相比，不会引起氮素污染问题，也不会加剧土壤盐渍化问题。
7.为了实现上述发明目的，本发明所用的具体技术方案如下：
8.本发明提供一种利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征
在于，将经过活性检验和适应性检验的施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)作为修复菌剂，醋酸钙和柠檬酸钙作为钙源，将修复菌剂、醋酸钙、柠檬酸钙、尿素、磷酸二氢钾溶于水中作为土壤修复液；将所述土壤修复液施加至待修复土壤中，并保持土壤处于好氧环境；施氏假单胞菌降解钙源生物合成碳酸钙沉淀，并在生物合成过程中将土壤中的铅离子以共沉淀的形式沉淀或锁定在碳酸钙晶格中，从而降低土壤中铅的迁移性和毒性，达到生物成矿原位修复盐渍化土铅污染的目的。
9.作为优选，上述施氏假单胞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc kb 20081858。
10.作为优选，上述土壤修复液包含0.01～0.05g/l施氏假单胞菌菌粉、1～5g/l醋酸钙、1～5g/l柠檬酸钙、0.4～2g/l尿素和0.05～0.25g/l磷酸二氢钾。
11.作为优选，上述活性检验和适应性检验具体方法如下：
12.将施氏假单胞菌分散至生理盐水中得到初始菌液；将所述初始菌液接种至第一培养基中进行生长活性培养；检测所述菌液的od600值，取od600值大于1.5的第一菌液，完成生长活性检测；
13.将所述完成生长活性检测的菌液接种至第二培养基中进行恒温培养；待第二培养基中菌液的od600值大于1.5，取少量沉淀物洗涤后，滴加浓度为1m的盐酸溶液进行适应性检验；所述沉淀物中出现气泡，则通过适应性检验；
14.所述第一培养基包括2.5g/l醋酸钙、2.5g/l柠檬酸钙、1.0g/l尿素、0.2g/l磷酸二氢钾和5.0g/l氯化钠；
15.所述第二培养基制备方法如下：土壤溶液中加入2.5g/l醋酸钙、2.5g/l柠檬酸钙、1.0g/l尿素、0.2g/l磷酸二氢钾后采用0.45μm滤膜过滤。
16.进一步的，上述初始菌液中的施氏假单胞菌的质量浓度为2g/l；所述第一培养基中初始菌液的接种量为1％；所述第二培养基中菌液的接种量为1％。
17.进一步的，上述土壤溶液制备方法如下：将过100目筛的待修复土壤按质量浓度为100g/l分散至水中获得土壤混合液；将所述土壤混合液在30℃和170rpm条件下，振荡8小时后采用0.45μm滤膜过滤得到上清液，即为土壤溶液。
18.作为优选，上述待修复土壤中的可溶性盐浓度ec值小于50ds/m，土壤ph范围为5～8，土壤铅污染深度小于40cm，土壤铅浓度小于100mg/kg。
19.作为优选，上述土壤修复液的施加量为每平方土1～4l。
20.作为优选，上述待修复土壤利用旋耕机进行翻耕，边翻耕、边喷洒土壤修复液；翻耕和喷洒土壤修复液的次数为2～3次。
21.作为优选，上述待修复土壤修复过程保持的温度为10～35℃，土壤含水率为10～30％，修复周期为5～10天。
22.相对于现有技术，本发明的优点如下：
23.(1)相较于传统生物成矿技术中采用氯化钙作为钙源导致在土壤修复后残留大量氯离子，从而加剧土壤的盐渍化问题，本发明中采用醋酸钙和柠檬酸钙作为钙源，利用施氏假单胞菌降解醋酸钙和柠檬酸钙，本发明提供的土壤修复液中的药剂都可以被完全降解或沉淀，不会残留盐分，不会加剧土壤的盐渍化。
24.(2)本发明土壤修复液中的尿素和磷酸二氢钾，不仅为施氏假单胞菌的生长和代
谢提供了营养元素，还可以作为氮肥和磷肥促进土壤中的植物生长。此外，微生物生长分泌的一些低分子有机物，也有利于植物生长。因此，本发明不仅可以修复盐碱土的铅污染，还可以促进土壤植被恢复或农作物增产。
25.(3)本发明应用于硫酸盐型的盐渍化土时，土壤修复液中的钙离子不仅是施氏假单胞菌生物成矿的重要原料，还能与土壤中的硫酸根离子结合形成硫酸钙沉淀(石膏)，从而降低土壤盐度，有利于增加土壤肥力、促进植物生长。
26.(4)本发明利用施氏假单胞菌的生物成矿作用修复盐渍化土的铅污染，与物理和化学方法相比，具有工艺简单、操作方便、成本低、见效快、无二次污染、不破坏土壤结构等优点，特别适用于中低浓度铅污染的盐渍化土修复。
具体实施方式
27.以下具体实施例用来进一步解释说明本发明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
28.本发明的发明构思是通过将处于对数生长期的施氏假单胞菌菌液接种到盐渍化铅污染的土壤中，在疏松的、空气和养分充足的土壤中，施氏假单胞菌可以快速生长，并迅速降解醋酸钙和柠檬酸钙合成碳酸钙沉淀。在碳酸钙沉淀的生物合成过程中，土壤中的铅离子能以共沉淀的形式被沉淀，或被锁定在碳酸钙的晶格中，从而有效降低土壤铅的迁移性和毒性，达到土壤铅原位钝化与土壤安全利用的目的。下面通过具体实施例来展示本发明所能达到的技术效果。
29.本发明下述实施例所用的施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏日期2005年10月25日，保藏号为cctcc kb 20081858。下述实施例中其余的试剂均可采用市售分析纯及以上的商业产品。
30.实施例
31.本实施例采用土壤小试试验，验证施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的效果，具体如下：
32.(1)待修复铅污染盐渍化土壤的获取，步骤如下：
33.采集华北地区某盐渍化农地的表层土壤(0～20cm)，过100目筛子，去除塑料、砾石、植物根等杂质。土壤含水率为15.4％，土壤ph为7.66，盐度为32.1ds/m，其中硫酸根、碳酸氢根和氯离子浓度分别为8.15mg/kg、0.13mg/kg和0.11mg/kg。取上述土壤40g，加入20ml氯化铅溶液(铅浓度为100mg/l)，并用玻璃棒搅拌均匀。通风阴凉处干燥，获得铅污染浓度为50mg/kg的待修复土壤。
34.(2)施氏假单胞菌的活性检验，包括生长活性检测和成矿活性检测，步骤如下：
35.称取0.1g施氏假单胞菌菌粉，分散至50ml生理盐水(0.9％氯化钠溶液)中，制得50ml初始菌液。移取1ml初始菌液，加入到100ml培养基中。培养基包括2.5g/l醋酸钙、2.5g/l柠檬酸钙、1.0g/l尿素、0.2g/l磷酸二氢钾和5.0g/l氯化钠。然后将含菌液的培养基置于恒温摇床中，在30℃和170rpm条件下，振荡培养24小时。培养结束后，监测所得溶液的od
600
值。如果od
600
值大于1.5，则通过生长活性检测，否则说明菌剂生长活性不足或已被污染。最后，取少量培养后的沉淀物，清水洗涤3次，滴加浓度为1m的盐酸溶液1ml。如果沉淀物产生
大量气泡，则通过成矿活性(即生物合成碳酸钙的活性)检测，否则说明菌剂成矿活性不足或已被污染。
36.上述步骤中的培养基制备过程如下：首先将0.1g尿素、0.02g磷酸二氢钾和0.5g氯化钠溶解于50ml去离子水中，121℃条件下高温灭菌20分钟。将0.25g醋酸钙和0.25g柠檬酸钙溶解于50ml去离子水中，0.45μm滤膜过滤，去除溶液中的杂菌。待高温灭菌溶液冷却至室温后，在超净工作台内，将上述两份50ml溶液混合，制得100ml培养基。
37.(3)施氏假单胞菌的适应性检验，步骤如下：
38.将步骤(1)中获取的待修复土壤过100目筛，称取10g过筛的土壤，分散至100ml去离子中，在30℃和170rpm条件下，振荡8小时，获得土壤溶液。将上述土壤溶液进行0.45μm滤膜过滤，获得无菌的土壤溶液。
39.采用上述土壤溶液，配置培养基，方法如下：取无菌的土壤溶液100ml，依次加入0.25g醋酸钙、0.25g柠檬酸钙、0.1g尿素和0.02g磷酸二氢钾；上述溶液再次进行0.45μm滤膜过滤，获得土壤溶液配置的无菌培养基。
40.取土壤溶液配置的无菌培养基100ml，接种1ml初始菌液，置于恒温摇床中，在30℃和170rpm条件下，振荡培养24小时。培养结束后，监测所得溶液的od
600
值。最后，取少量培养后的沉淀物，清水洗涤3次，滴加1ml盐酸溶液(浓度为1m)，观察沉淀物的气泡产生情况。如果od
600
值大于1.5，且沉淀物加盐酸后产生大量气泡，则通过土壤环境的适应性检验，否则说明所用菌剂不适应于待修复的土壤。
41.(4)土壤修复液配置，步骤如下：
42.将经过活性检验和适应性检验的施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)作为修复菌剂，称取0.05g施氏假单胞菌菌粉，分散至20ml生理盐水(0.9％氯化钠溶液)中。将0.25g醋酸钙、0.25g柠檬酸钙、0.1g尿素和0.02g磷酸二氢钾溶解于去离子水中，再加入1ml含有菌剂的生理盐水，充分混匀，制得土壤修复液。
43.(5)土壤修复，步骤如下：
44.取步骤(1)获得的待修复土壤，平均分为两份，每份20g。其中一组作为实验组，另一组作为对照组。在实验组中，均匀加入5ml步骤(4)获得的土壤修复液，并与待修复土壤充分混匀；在对照组中，均匀加入5ml去离子水，也与土壤充分混匀。混匀后，土壤均匀铺设于玻璃培养皿内，土壤厚度小于5mm。将上述土壤放置于25℃恒温箱内，两个玻璃培养皿敞口、并排放置，修复7天。
45.(6)土壤修复结果如下：
46.利用tessier五步提取法，对修复后的土壤进行连续化学提取，并分析各赋存形态铅(pb)的含量。结果显示，修复7天后，实验组中土壤可交换态pb下降至0.86mg/kg(钝化率为98.3％)，对照组仅下降至17.9mg/kg(钝化率仅为64.2％)。相比于对照组，实验组中碳酸盐结合态、铁锰氧化物结合态、有机结合态、残渣态等稳定的pb形态分别增加了1.6、2.0、1.6和1.5倍。
47.说明经过本发明提供的修复方法，施氏假单胞菌利用醋酸钙和柠檬酸钙生物合成碳酸钙沉淀的过程中，土壤中的铅离子能以共沉淀的形式被沉淀，或被锁定在碳酸钙的晶格中，从而有效降低土壤铅的迁移性和毒性，达到土壤铅原位钝化与土壤安全利用的目的。
48.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有
关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，将经过活性检验和适应性检验的施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)作为修复菌剂，醋酸钙和柠檬酸钙作为钙源，将修复菌剂、醋酸钙、柠檬酸钙、尿素、磷酸二氢钾溶于水中作为土壤修复液；将所述土壤修复液施加至待修复土壤中，并保持土壤处于好氧环境；施氏假单胞菌降解钙源生物合成碳酸钙沉淀，并在生物合成过程中将土壤中的铅离子以共沉淀的形式沉淀或锁定在碳酸钙晶格中，从而降低土壤中铅的迁移性和毒性，达到生物成矿原位修复盐渍化土铅污染的目的。2.根据权利要求1所述的利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，所述施氏假单胞菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc kb 20081858。3.根据权利要求1所述的利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，所述土壤修复液包含0.01～0.05g/l施氏假单胞菌菌粉、1～5g/l醋酸钙、1～5g/l柠檬酸钙、0.4～2g/l尿素和0.05～0.25g/l磷酸二氢钾。4.根据权利要求1所述的利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，所述活性检验和适应性检验具体方法如下：将施氏假单胞菌分散至生理盐水中得到初始菌液；将所述初始菌液接种至第一培养基中进行生长活性培养；检测所述菌液的od
600
值，取od
600
值大于1.5的第一菌液，完成生长活性检测；将所述完成生长活性检测的菌液接种至第二培养基中进行恒温培养；待第二培养基中菌液的od
600
值大于1.5，取少量沉淀物洗涤后，滴加浓度为1m的盐酸溶液进行适应性检验；所述沉淀物中出现气泡，则通过适应性检验；所述第一培养基包括2.5g/l醋酸钙、2.5g/l柠檬酸钙、1.0g/l尿素、0.2g/l磷酸二氢钾和5.0g/l氯化钠；所述第二培养基制备方法如下：土壤溶液中加入2.5g/l醋酸钙、2.5g/l柠檬酸钙、1.0g/l尿素、0.2g/l磷酸二氢钾后采用0.45μm滤膜过滤。5.根据权利要求4所述的利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，所述初始菌液中的施氏假单胞菌的质量浓度为2g/l；所述第一培养基中初始菌液的接种量为1％；所述第二培养基中菌液的接种量为1％。6.根据权利要求4所述的利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，所述土壤溶液制备方法如下：将过100目筛的待修复土壤按质量浓度为100g/l分散至水中获得土壤混合液；将所述土壤混合液在30℃和170rpm条件下，振荡8小时后采用0.45μm滤膜过滤得到上清液，即为土壤溶液。7.根据权利要求1所述的利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，所述待修复土壤中的可溶性盐浓度ec值小于50ds/m，土壤ph范围为5～8，土壤铅污染深度小于40cm，土壤铅浓度小于100mg/kg。8.根据权利要求1所述的利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，所述土壤修复液的施加量为每平方土1～4l。9.根据权利要求1所述的利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，所述待修复土壤利用旋耕机进行翻耕，边翻耕、边喷洒土壤修复液；翻耕和喷洒
土壤修复液的次数为2～3次。10.根据权利要求1所述的利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，其特征在于，所述待修复土壤修复过程保持的温度为10～35℃，土壤含水率为10～30％，修复周期为5～10天。

技术总结
本发明公开了一种利用施氏假单胞菌生物成矿修复盐渍化土铅污染的方法，属于土壤重金属修复技术领域。本发明将经过活性检验和适应性检验合格的施氏假单胞菌、醋酸钙和柠檬酸钙施加到铅污染的盐渍化土中，利用施氏假单胞菌的生物成矿作用，修复铅污染土壤。在施氏假单胞菌利用醋酸钙和柠檬酸钙生物合成碳酸钙沉淀的过程中，土壤中的铅离子能以共沉淀的形式被沉淀，或被锁定在碳酸钙的晶格中，从而有效降低土壤铅的迁移性和毒性，达到土壤铅原位钝化与土壤安全利用的目的。本发明涉及的所有药剂都可以被完全降解或沉淀，不会加剧土壤的盐渍化。本发明适用于中低浓度铅污染的盐渍化土修复。修复。


技术研发人员：何崭飞 杨莹莉 徐伊婷 李群群 谷涵远 张道勇 潘响亮
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2023.06.02
技术公布日：2023/8/28