肠艾美耳球虫延伸因子EF1α和EFG重组蛋白的应用

肠艾美耳球虫延伸因子ef1
α
和efg重组蛋白的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及肠艾美耳球虫延伸因子ef1α和efg重组蛋白的应用。


背景技术：

2.兔球虫病(rabbit coccidiosis)是一种危害较大的寄生虫病，由艾美耳球虫属原生动物寄生虫引起，具有感染率高、传染性强和发病急等特点。其中肠艾美耳球虫(eimeria intestinalis，ei)是致病力最强的虫种，主要寄生于空肠和回肠上皮细胞，引起家兔厌食、腹泻、体重减轻，甚至是死亡。
3.目前防控兔球虫病主要依赖抗球虫药，但会导致球虫产生耐药性和药物在食品中的残留等问题。免疫防控是具有潜力的替代技术，目前兔球虫疫苗研究主要包括活虫苗和重组亚单位疫苗。已成功选育出肠艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫和梨形艾美耳球虫的早熟株，并且在此基础上研制了一种早熟品系三价疫苗。然而与活虫苗相比，基因重组亚单位疫苗既安全稳定，易于大规模使用并且生产成本相对较低。目前在兔球虫中已经开发了针对斯氏艾美尔球虫和大型艾美耳球虫的重组亚单位疫苗，但肠艾美耳球虫重组亚单位疫苗尚无研究报道。
4.延伸因子家族(elongation factors，efs)是典型的高度保守蛋白，ef1α和efg在顶复门原虫入侵时位于子孢子顶端，在子孢子入侵过程中发挥重要作用，被认为具有疫苗抗原潜力。
5.因此，提供能够预防和治疗肠艾美尔球虫相关疾病的重组亚单位疫苗的候选抗原具有重要的现实意义。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供的重组蛋白及应用，能刺激家兔对肠艾美尔球虫感染产生细胞和体液免疫，减少增重损失和卵囊排出，减轻肠道病变，是肠艾美尔球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供了肠艾美耳球虫延伸因子在制备预防和/或治疗球虫感染的疫苗中的应用；
9.所述肠艾美耳球虫延伸因子包括ei-ef1α、ei-ef1β、ei-ef2、ei-eftu、ei-efts或ei-efg中的一种或多种；
10.所述球虫感染中的所述球虫包括肠艾美耳球虫、大型艾美尔球虫、斯氏艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、环孢子虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、贝氏贝诺孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫、环孢子虫或柔嫩艾美耳球虫中的一种或多种。
11.在本发明的一些具体实施方案中，上述应用的所述肠艾美耳球虫延伸因子为如下任一项：
12.(i)、ei-ef1α；
13.(ii)、ei-efg；
14.(iii)、ei-ef1α和ei-efg。
15.在本发明的一些具体实施方案中，上述应用的所述球虫感染中的所述球虫为肠艾美耳球虫。
16.在本发明的一些具体实施方案中，上述应用的所述疫苗具有如下任意特性：
17.(i)、提高宿主抗肠艾美耳球虫抗体水平；和/或
18.(ii)、提高宿主血清中白细胞介素和/或干扰素的水平；和/或
19.(iii)、阻碍宿主中肠艾美耳球虫的生长；和/或
20.(iv)、减少宿主肠艾美耳球虫卵囊排出；和/或
21.(v)、减轻宿主肠道病变；和/或
22.(vi)、减少宿主增重损失；
23.所述白细胞介素包括il-2、il-4或il-10中的一种或多种；
24.所述干扰素包括ifn-γ；
25.所述宿主包括家兔。
26.本发明还提供了表达载体，具有核苷酸序列1或核苷酸序列2；
27.所述核苷酸序列1为：
28.(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或
29.(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
30.(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
31.所述核苷酸序列2为：
32.(4)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或
33.(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
34.(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
35.所述多个为2个至50个。
36.本发明还提供了细胞，包括上述表达载体。
37.本发明还提供了上述表达载体或上述细胞在制备预防和/或治疗球虫感染的疫苗中的应用；
38.所述球虫感染中的所述球虫包括肠艾美耳球虫、大型艾美尔球虫、斯氏艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、环孢子虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、贝氏贝诺孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫、环孢子虫或柔嫩艾美耳球虫中的一种或多种。
39.本发明还提供了重组蛋白，包括：
40.(i)、rei-ef1α；或
41.(ii)、rei-efg；或
42.(iii)、rei-ef1α和rei-efg；
43.所述rei-ef1α具有：
44.(1)、如seq id no:2所示的氨基酸序列；或
45.(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
46.(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
47.所述rei-efg具有：
48.(4)、如seq id no:4所示的氨基酸序列；或
49.(5)、如(4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
50.(6)、与如(4)或(5)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；
51.所述多个为2个至10个。
52.本发明还提供了上述重组蛋白在如下任意项中的应用：
53.(i)、提高宿主抗肠艾美耳球虫抗体水平；和/或
54.(ii)、提高宿主血清中白细胞介素和/或干扰素的水平；和/或
55.(iii)、阻碍宿主中肠艾美耳球虫的生长；和/或
56.(iv)、减少宿主肠艾美耳球虫卵囊排出；和/或
57.(v)、减轻宿主肠道病变；和/或
58.(vi)、减少宿主增重损失；和/或
59.(vii)、制备预防和/或治疗球虫感染的疫苗中的应用；
60.所述白细胞介素包括il-2、il-4或il-10中的一种或多种；
61.所述干扰素包括ifn-γ；
62.所述宿主包括家兔；
63.所述球虫感染中的所述球虫包括肠艾美耳球虫、大型艾美尔球虫、斯氏艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、环孢子虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、贝氏贝诺孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫、环孢子虫或柔嫩艾美耳球虫中的一种或多种。
64.本发明还提供了疫苗，包括：
65.(a)、将上述表达载体转染至细胞中进行表达而获得的蛋白；或
66.(b)、培养上述细胞获得的蛋白；或
67.(c)、上述重组蛋白。
68.在本发明的一些具体实施方案中，上述疫苗还包括皂素。
69.本发明的重组蛋白及应用有如下效果：
70.感染球虫后对照组出现厌食和腹泻，肠道剖检可见肠壁明显增厚，白色结节连接成片，而免疫组症状相对较轻。rei-ef1α免疫组和rei-efg免疫组的家兔，其相对增重率(89.01％，56.04％)、卵囊减少率(75.18％，60.58％)和aci(176.31，133.54)均高于对照组(p《0.05)。疫苗接种后特异性抗体水平升高，并保持在较高水平(p《0.05)；免疫后rei-ef1α免疫组和rei-efg免疫组的ifn-γ、il-2和il-4水平明显升高(p《0.05)。
71.rei-ef1α和rei-efg均能不同程度地减少增重损失和卵囊排出，减轻肠道病变，诱导产生体液和细胞免疫反应，其中rei-ef1α免疫保护效果更佳，表明rei-ef1α是肠艾美尔球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。
附图说明
72.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
73.图1示ei-efs不同发育阶段转录水平；其中，a、b、c、d、e、f分别为ei-ef1α、ei-ef1β、ei-ef2、ei-eftu、ei-efts和ei-efg在不同发育阶段的相对转录水平；数据以3次平行重复的平均值加标准差的形式展示，发育阶段由左至右依次为未孢子化卵囊(u)、孢子化卵囊(s)、裂殖子(m)和配子体(g)阶段虫体，各组之间的统计学差异通过spss statistics20.0单因素方差分析进行，不同的字母标注的数据间存在显著差异(p《0.05)，相同字母标注的数据间不存在显著差异(p＞0.05)；
74.图2示不同物种ef1α(a)和efg(b)基因的多重序列比对；a中：e.magna：大型艾美耳球虫(登录号：oq626369)，e.stiedae：斯氏艾美耳球虫(登录号：uxb94620.1)，e.acervuline：堆型艾美耳球虫(登录号：xp_013247767.1)，c.cayetanensis：环孢子虫(登录号：xp_026193974.1)，e.maxima：巨型艾美耳球虫(登录号：xp_013336300.1)，e.necatrix：毒害艾美耳球虫(登录号：xp_013440853.1)，e.tenella：柔嫩艾美耳球虫(登录号：xp_013234784.1)；b中：b.besnoiti：贝氏贝诺孢子虫(登录号：xp_029219555)，t.gondii：刚地弓形虫(登录号：kfg54564.1；pim01008.1)，n.caninum：犬新孢子虫(登录号：xp_003884014.1)，c.cayetanensis：环孢子虫(登录号：xp_026194153.1)，e.tenella：柔嫩艾美耳球虫(登录号：xp_013233923.1)；α-helix：α螺旋，β-sheet：β折叠，consensus：一致序列，hydrophob：疏水性；黑框代表b细胞表位；
75.图3示ei-efs pcr扩增产物；其中，泳道m为dna分子质量标准d2000和markerⅲ；泳道1为ef1α；泳道2为efg；
76.图4示ei-ef1α、ei-efg质粒的双酶切；泳道m为dna分子质量标准d2000和markerⅲ；a为ei-ef1α；b为ei-efg；
77.图5示rei-ef1α、rei-efg的原核表达；其中泳道m为蛋白质分子质量标准；1、2为rei-ef1α；3、4为rei-efg；
78.图6示重组蛋白的蛋白可溶性分析；泳道m为蛋白质分子量标记(kda)；a为rei-ef1α；b为rei-efg；1为重组菌诱导表达后菌体裂解物上清；2、3、4为菌体裂解物先后溶解于2m、4m、8m尿素；
79.图7示rei-ef1α、rei-efg蛋白纯化；泳道m为蛋白质分子量标记(kda)；1为诱导表达后经纯化的rei-ef1α；2为诱导表达后经纯化的rei-efg；
80.图8示纯化后的2个重组蛋白的免疫印迹；泳道m为蛋白质分子量标记(kda)；a为rei-ef1α；b为rei-efg；1为经纯化的重组蛋白与自然感染肠艾美耳球虫兔血清识别反应；2为经纯化的重组蛋白与健康兔血清识别反应；
81.图9示免疫保护实验设计示意图；
82.图10示各组肠道剖检图；其中，a1、a2、a3示空白对照组；b1、b2、b3示攻虫对照组；c1、c2、c3示pet32a对照组；d1、d2、d3示rei-ef1α免疫组；e1、e2、e3示rei-efg免疫组；黑色箭头表示出血点或白色结节；
83.图11示实验兔血清中特异性igg抗体水平的变化情况；
84.图12示感染前rei-ef1α免疫组和rei-efg免疫组血清中细胞因子的测定。
具体实施方式
85.本发明公开了重组蛋白及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
86.本发明检测了肠艾美耳球虫延伸因子(ei-efs)在虫体不同发育阶段的转录水平，并筛选出ei-ef1α和ei-efg进行原核表达和纯化。用100μg rei-ef1α或rei-efg皮下免疫实验兔，每隔14天免疫一次共两次，然后口服接种肠艾美耳球虫卵囊。每周采集血清检测特异性抗体水平和细胞因子il-2、il-4、il-10和ifn-γ水平；攻虫后第14天剖杀，以相对增重率、卵囊减少率、抗球虫指数、病理变化、临床症状、特异性抗体水平和细胞因子水平为指标来评价rei-ef1α或rei-efg对肠艾美尔球虫的免疫保护效果。
87.本发明从课题组首次测定的肠艾美耳球虫转录组数据中筛选出6个efs，通过在不同发育阶段的转录水平的分析，筛选出ef1α和efg基因并进行了表达，并进行动物实验评价重组蛋白对兔的免疫保护作用。
88.ef1α参与许多重要的细胞过程，包括翻译控制、信号传导、细胞骨架组成和细胞形态等。ef1α定位于顶复门原虫顶质体，参与入侵结构的形成。在本发明的研究中，rei-ef1α免疫组的相对增重率为89.01％，卵囊减少率高达75.18％，aci值达到176.31，具有良好的抗球虫效果。在本发明的研究中，从多序列比对结果(图2)中可以看出，ei-ef1α与其他原虫的序列相似性较高，特别是兔的eimeria stiedae和eimeria magna，高达99.59％。ef1α可能对其他艾美耳球虫存在交叉保护作用。
89.efg是一种gtp酶，在易位过程中通过引导a位点转移rna来维持mrna阅读框架。研究表明efg可能是寄生虫疟原虫和弓形虫的顶质体的组成部分，这一基因表达减少将导致严重的毒力缺陷。在本研究中，rei-efg免疫组显示出56.04％的体重增加和60.58％的卵囊排出减少，本发明的免疫保护实验结果首次评价了efg该蛋白作为疫苗候选抗原的潜力。
90.本发明的研究结果显示与对照组相比，rei-efg和rei-ef1α接种后血清il-2、il-4水平显著升高(p＜0.05)，细胞免疫可能在抗肠艾美尔球虫中发挥了作用。
91.本发明的实验结果表明在注射rei-efg和rei-ef1α重组蛋白后，抗体igg水平开始上升并在二免后趋于稳定。球虫子孢子入侵和裂殖子溢出阶段是位于细胞外的，体液免疫在抗球虫保护中可能也发挥一定作用。皂素(saponin)被认为是针对细胞内病原体的一种理想疫苗佐剂，能刺激细胞和体液反应，在本发明的研究中，选择了皂素作为疫苗佐剂，免疫后各组均没有出现不良反应。
92.本发明成功获得了重组rei-ef1α和rei-efg蛋白并进行了免疫保护实验，结果表明，rei-ef1α和rei-e efg均对家兔肠艾美尔球虫感染有一定的免疫保护力，能刺激产生细胞和体液免疫，能不同程度地减少增重损失和卵囊排出，减轻肠道病变，其中rei-ef1α免疫保护效果更佳，是肠艾美尔球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。
93.本发明涉及的序列信息：
94.ef1α-核苷酸(seq id no:1):
[0095][0096]
ef1α-氨基酸(seq id no:2):
[0097][0098]
efg-核苷酸(seq id no:3):
[0099][0100]
efg-氨基酸(seq id no:4):
[0101][0102]
关于数据统计分析：
[0103]
本发明中所有统计学检验采用spss 24.0进行，组间差异的所有数据采用单因素方差分析(one-way anova)进行评估，当p＞0.05时不同实验组间差异无统计学意义，p＜0.05时差异被认为是显著的，p＜0.01被认为是非常显著的。所有数据均以平均值
±
标准差(sd)表示；使用graphpad prism 8.4.0.作图软件生成图形。
[0104]
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
[0105]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0106]
实施例1
[0107]
1.实验动物、虫株和血清制备
[0108]
5只1月龄无球虫新西兰幼兔用于收集新鲜虫种和阳性血清，均为本实验室自繁自养。兔笼、食具等经烘烤，饲料经高温干燥，饮水中加入抗球虫药，自由采食和饮水。未添加抗球虫药的饲料委托四川某兔料厂定制，在人工感染前3天开始使用。
[0109]
肠艾美耳球虫四川株是通过收集新鲜的e.intestinalis阳性感染兔的粪便分离而得，加入适量2.5％重铬酸钾溶液，并在适宜的温度、湿度和充足的氧气条件下孢子化培养，最后于4℃保存。
[0110]
用5
×
104e.intestinalis孢子化卵囊口服接种家兔，采集阳性血清。阴性血清取自1月龄家兔，该家兔严格在无球虫污染环境中饲养，每日采样镜检确保未曾接触过任何艾美耳球虫。所有血清均储存在摄氏零下20度。
[0111]
2.总rna提取、逆转录
[0112]
取适量4℃保存的孢子化卵囊用pbs溶液3000r/min反复离心洗去多余的重铬酸钾，另取适量冻存于液氮中的未孢子化卵囊、裂殖生殖阶段虫体和配子生殖阶段虫体按照rna抽提试剂盒(takara,dalian,china)说明书进行rna抽提，产物保存于-80℃超低温冰箱；取适量各阶段虫体总rna，按照反转录试剂盒((primescript
tm
rt reagent kit with gdna eraser,takara,dalian,china)说明书在pcr仪上进行反转录，产物cdna于-80℃超低温冰箱保存。
[0113]
实施例2：efs在肠艾美尔球虫不同发育阶段转录水平
[0114]
根据ei-efs基因序列设计特异性qrt-pcr引物(见表1)，以各阶段虫体cdna为模板进行qrt-pcr扩增，以ei-18s rrna、ei-β-tubulin作为内参基因进行比较，所有基因中的每一个都进行了三次平行重复。反应体系为10μl tb green premix ex taqii(tli rnaseh plus)(2x)(takara,dalian,china)，0.8μl上游引物(sangong,shanghai,china)，0.8μl下游引物(sangong,shanghai,china)，2μl cdna，6.4μl ddh2o，共计20μl。反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火60s，共40个循环；添加熔解曲线：95℃15s，60℃60s，95℃15s。以未孢子化阶段为校准基因比较其他发育阶段的表达水平。结果采用δδct(qr＝2-δδct
)法分析肠艾美尔球虫每个发育阶段的efs的相对转录水平，随后通过使用graphpad prism 8.4的单因素方差分析进行分析。
[0115]
表1：ei-efs和内参基因ei-18s rrna、ei-β-tubulin的qpcr引物
[0116][0117]
结果：
[0118]
筛选了两个参考基因ei-18s rrna和ei-β-微管蛋白，结果表明ei-β-tubulin在不同发育阶段的转录水平更稳定，选择了ei-β-tubulin作为内参基因进行分析。ei-ef1α；ei-ef1β；ei-ef2；ei-eftu；ei-efts；ei-efg基因在肠艾美耳球虫4个发育阶段均有转录，且转录水平存在差异(图1，其对应数据见表2)。其中ei-ef1α在裂殖体和配子体阶段相对于其他阶段有高转录水平，且差异非常显著(p《0.01)；ei-efg在孢子化卵囊阶段相对于其他阶段有高转录水平，且差异极显著(p＜0.05)；ei-ef1β、ei-efts在裂殖子阶段相对于其他阶段有高转录水平，且差异显著(p《0.05)；ei-ef2在配子生殖阶段相对于其他阶段有高转录水
平，且差异极显著(p＜0.01)；而ei-eftu在各个阶段转录无显著差异。
[0119]
表2：ei-efs在不同发育阶段的相对转录水平
[0120][0121]
实施例3：ef1α和efg的生物信息学分析
[0122]
结合荧光定量pcr的结果筛选出ei-ef1α和ei-efg，利用ncbi开放阅读框架查询器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)获得ei-ef1α和ei-efg的开放阅读框(orf)和氨基酸序列；利用signalp-5.0(http://services.healthtech.dtu.dk/signalp-5.0)、tmhmm server v.2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/tmhmm-2.0)预测蛋白质的信号肽、跨膜区域；使用在线工具(http://www.detaibio.com/tools/)(http://gpcr.biocomp.unibo.it/predgpi)预测蛋白质的物理化学性质，包括氨基酸数量、分子量、等电点和蛋白质二级结构；使用iebd分析资源(http://tools.immuneepitope.org/main/)预测b细胞和t细胞表位；使用algpred2(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred2/batch.html)预测有无过敏原。使用texshade进行多序列比对进行作图。
[0123]
结果：
[0124]
ei-ef1α基因开放阅读框为729bp，编码242个氨基酸。预测相对分子量为26.62kda，计算等电点(pi)为10.12；ei-efg基因开放阅读框为501bp，编码166个氨基酸，预测相对分子量为18.26kda，计算等电点(pi)为8.49。ei-ef1α、ei-efg基因均无跨膜区和信号肽。过敏性预测结果显示ei-ef1α、ei-efg基因均没有过敏性。
[0125]
将ei-ef1α氨基酸序列与大型艾美尔球虫(eimeria magna)、斯氏艾美耳球虫(eimeria stiedae)、堆型艾美耳球虫(eimeria acervuline)、环孢子虫(cyclospora cayetanensis)、巨型艾美耳球虫(eimeria maxima)、毒害艾美耳球虫(eimeria necatrix)、柔嫩艾美耳球虫(eimeria tenella)中的ef1α氨基酸序列，进行多序列比对(图2中的a)，总体上相似度高，特别是艾美耳属内，与大型和斯氏艾美耳球虫相似度高达99.59％；将ei-efg氨基酸序列与贝氏贝诺孢子虫(besnoitia besnoiti)、刚地弓形虫(toxoplasma gondii)、犬新孢子虫(neospora caninum)、环孢子虫(cyclospora cayetanensis)、柔嫩艾美耳球虫(eimeria tenella)的efg氨基酸序列，进行多序列比对(图2中的b)，该基因氨基酸序列在种属间相似性较高，最高只有83.73％。同时用网站预测三个氨基酸的二级结构、b细胞和t细胞抗原表位并在图中标注。
[0126]
实施例4：克隆、表达、蛋白纯化和免疫印迹分析
[0127]
利用blast检测，结合转录组数据鉴定出肠艾美耳球虫的ei-ef1α和ei-efg基因序列，用primer premier 5.0软件设计能扩增完整orf序列的引物，上、下游引物分别选用限制性内切酶bami和hindⅲ，设计ei-ef1α、ei-efg含限制性酶切位点的引物见表3，以上述收集的肠艾美尔球虫cdna为模板进行pcr扩增。
[0128]
表3：ei-ef1α、ei-efg含限制性酶切位点的引物
[0129][0130]
回收目的条带与pmd19-t载体(takara,dalian,china)连接并转化至dh5α感受态细胞(tiangen,beijing,china)中，涂于含amp平板表面，37℃培养12h后挑取阳性克隆送上海生物工程有限公司进行测序分析。将测序正确的菌落进行扩大培养并提取质粒，将提取的质粒用bami、hindⅲ快切酶进行双酶切，选用pet32a为表达载体，连接后转入大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑取单菌落培养后测序；测序正确后，将重组表达质粒pet32a-ei-ef1α转到大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)(tiangen,beijing,china)中，在lb液体培养基中扩大培养，当od
590
为0.6后加入诱导剂iptg(sigma,cream ridge,nj,usa)，37℃诱导12h，然后收集菌液进行sds-page(solebao,beijing,china)电泳验证表达情况，并通过超声破碎分析重组蛋白的表达形式，最后用金属(ni
2+
)螯合亲和层析柱(qiagen,dusseldorf,germany)进行蛋白纯化，然后用12％ sds-page检测蛋白纯度。
[0131]
将纯化的rei-ef1α和rei-efg进行sds-page，分别转移到硝化纤维素(nc)膜上。首先在tbst中清洁nc膜三次(每次5分钟)，在室温下用含5％脱脂奶粉的tris缓冲盐水(tbs)中封闭2小时。封闭完成后，将nc膜与阳性和阴性血清(稀释比例为1:200)，并在4℃下孵育过夜。用tbst洗涤膜三次后，将其与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg(hrp-igg)(boster,wuhan,china)在室温下以1:1000稀释比例孵育2小时。最后用tbst洗涤膜5次后，用二氨基联苯胺(dab)试剂盒(solar-bio，beijing，china)停止反应。
[0132]
结果：
[0133]
以肠艾美耳球虫四阶段虫体混合的cdna为模板扩增出相应的特异性条带，大小分别为ef1α：729bp；efg：501bp(图3)。
[0134]
双酶切可得到pmd19-t载体骨架和729bp的ef1α基因片段和501bp的efg基因片段(图4)，同时将pet32a质粒进行双酶切。酶切反应完成后，其产物进行琼脂糖凝胶电泳(图4)。目的基因片段与预期大小相符，说明ei-ef1α、ei-efg基因已经成功克隆至t载体。
[0135]
从肠艾美尔球虫cdna中扩增出ei-ef1α(genbank登录号：oq223224)和ei-efg(genbank登录号：oq223225)的全长序列，扩增片段分别为729bp和501bp。经过克隆和测序分析，在肠艾美尔球虫的转录组数据中，每个扩增片段与ei-ef1α和ei-efg的序列相似性为100％。两个重组蛋白在诱导剂iptg的诱导下成功地表达，rei-ef1α和rei-efg预测的大小分别在26.62kda和18.26kda左右，加上pet32a编码的约20kda的标签融合肽，结果与预测一致(图5)，表明了该重组蛋白的成功表达。
[0136]
可溶性分析结果表明，pet32a-ei-ef1α、pet32a-ei-efg重组蛋白均表达在包涵体中(图6)。重组蛋白通过镍离子亲和层析柱纯化后，经12％ sds-page电泳分离，结果显示纯化后的蛋白均为单一条带(图7)。免疫印迹分析表明，rei-ef1α和rei-efg均能识别阳性血清，具有良好的反应原性(图8)。
[0137]
实施例5：rei-ef1α和rei-efg的免疫保护效果评价
[0138]
1.免疫程序和实验分组
[0139]
将60只30日龄的无球虫幼兔(0.83
±
0.14kg)随机分为5组，每组各12只，由四川农业大学动物寄生虫病研究中心提供，严格在无球虫环境中饲养。实验兔于30日龄进行首免，14d后同等剂量进行二免，均采用颈部皮下注射的方式进行免疫，二免两周后，口服接种新鲜复活的肠艾美耳球虫孢子化卵囊5
×
104/只。各组免疫程序如表4所示，实验设计示意图见图9。
[0140]
表4
[0141][0142]
2.保护效果评价指标
[0143]
安全性观察：感染后观察各组精神状态、饮食欲、腹围等；若出现死亡，记录死亡时间并剖检。每隔7d记录一次体重，相对增重率＝试验组增重率/未免疫不攻虫组增重率
×
100％。
[0144]
感染后第14天(14dpc)剖杀所有试验兔，剖检时收集适量直肠粪样进行卵囊排出量的定量检查，统计各组平均每克粪便卵囊数(oocyst per gram，opg)，并计算卵囊减少率，卵囊减少率＝(攻虫对照组opg﹣免疫组opg)/攻虫对照组opg；剖检时收集空肠后段和整段回肠，具体病变评分标准见表5。
[0145]
表5：病变评分标椎
[0146][0147][0148]
抗球虫指数(anticoccidial index，aci)是国际上通用的对抗球虫药物或疫苗的效果评价的客观指标，评判标准见表6。aci＝(存活率+相对增重率)-(病变值+卵囊值)；存活率＝存活实验兔数量/实验兔总量
×
100％；病变值＝各组平均病变计分
×
10。
[0149]
表6：aci值判定标椎
[0150]
aci值抗球虫效果aci＜120无120≤aci＜160中等160≤aci≤180良好aci＞180优秀
[0151]
结果：
[0152]
各组实验兔的存活率均为100％。感染球虫后空白对照组空肠和回肠无肉眼病变，攻虫对照组和pet32a对照组出现厌食和腹泻的症状，肠道剖检发现攻虫对照组和pet32a对照组均出现肠壁广泛出血，白色结节连接成片，肠壁极度扩张增厚，而rei-ef1α免疫组和rei-efg免疫组病变较轻微(图10)。
[0153]
初次免疫、二次免疫和攻虫时各组体重无明显差异。攻虫14天后与攻虫对照组相比，rei-ef1α免疫组和rei-efg免疫组的相对增重率分别为89.01％(p＜0.05)和56.04％(p＜0.05)。另外rei-ef1α免疫组和rei-efg免疫组的平均opg与攻虫对照组相比均显著减少，rei-ef1α免疫组和rei-efg免疫组的卵囊减少率分别达75.18％(p＜0.05)和60.58％(p＜0.05)。
[0154]
综合肠艾美耳球虫感染的保护效果评价结果，两个免疫组在aci值上有所差异，其中rei-ef1α免疫组的aci值为176.31，抗球虫效果为良好，而rei-efg免疫组的aci只有133.54，只有中等保护抗球虫效果(表7)。
[0155]
表7：rei-ef1α和rei-efg针对肠艾美耳球虫感染的保护效果评价
[0156][0157]
注：数据以mean
±
standard deviation(sd)的形式展示。在每一列，不同的字母标注的数据间存在显著差异(p《0.05)，相同字母标注的数据间不存在显著差异(p＞0.05)。
[0158]
实施例6：血清抗rei-ef1α和rei-efg的igg水平的测定
[0159]
为观察免疫重组蛋白后实验兔的特异性血清igg水平变化，每隔7d收集实验兔血清，所有血清样品均储存于-20℃保存备用。使用间接elisa法检测rei-ef1α和rei-efg蛋白免疫组及对照组兔血清特异性抗体igg水平，最佳血清稀释度为1:160。
[0160]
结果：
[0161]
免疫接种后，rei-ef1α免疫组和rei-efg免疫组血清平均特异性igg抗体水平升高，在第二次免疫后达到最高水平，抗体水平见顶后略有下降，但在攻虫两周后仍可以保持高水平，其平均水平显著的高于pbs对照组。pet32a对照组也表现出如疫苗组一般的上升趋势，但整体数值较疫苗组而言偏低(图11，注：在第一次免疫(第0天)、加强免疫(第14天)和用肠艾美球虫攻击(第28天)后血清抗rei-ef1α(a)和rei-efg(b)igg水平的变化；其对应数据见表8、表9)。
[0162]
表8：rei-ef1α免疫组血清中特异性igg抗体水平
[0163]
[0164]
表9：rei-efg免疫组血清中特异性igg抗体水平
[0165][0166]
实施例7：血清细胞因子检测
[0167]
本实验采集了实验兔二免后后14天的血清，也就是攻虫前的血清，使用elisa法检测二免后的白细胞介素(il)il-2、il-4、il-10和干扰素-γ(ifn-γ)，购买自solar-bio公司。相应细胞因子的检测均按照厂商的说明书进行。
[0168]
结果：
[0169]
二次免疫后，各组ifn-γ浓度无差异(p＜0.05)。与pbs对照组相比，rei-ef1α免疫组的il-2、il-4和il-10水平均显著增加，且差异均有统计学意义(p＞0.05)；与pbs对照组相比rei-efg免疫组的il-2、il-4、il-10和ifn-γ浓度增加均无显著差异(p＞0.05)，il-10水平与pet32a对照组无差异(p＜0.05)。(图12，注：采用elisa法测定家兔血清中细胞因子il-10(a)、ifn-γ(b)、il-2(c)和il-4(d)的水平。不同上标(a，b，c)表示差异显著(p《0.05)。相同上标表示无显著性差异(p》0.05)；浓度单位为pg/ml；所有值均通过anova(邓肯事后分析)估计，p≤0.05；其对应数据如表10)。
[0170]
表10：感染前rei-ef1α免疫组和rei-efg免疫组血清中细胞因子水平
[0171][0172][0173]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.肠艾美耳球虫延伸因子在制备预防和/或治疗球虫感染的疫苗中的应用；所述肠艾美耳球虫延伸因子包括ei-ef1α、ei-ef1β、ei-ef2、ei-eftu、ei-efts或ei-efg中的一种或多种；所述球虫感染中的所述球虫包括肠艾美耳球虫、大型艾美尔球虫、斯氏艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、环孢子虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、环孢子虫或柔嫩艾美耳球虫中的一种或多种。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠艾美耳球虫延伸因子为如下任一项：(i)、ei-ef1α；(ii)、ei-efg；(iii)、ei-ef1α和ei-efg。3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括：所述球虫感染中的所述球虫为肠艾美耳球虫；和/或所述疫苗具有如下任意特性：(i)、提高宿主抗肠艾美耳球虫抗体水平；和/或(ii)、提高宿主血清中白细胞介素和/或干扰素的水平；和/或(iii)、阻碍宿主中肠艾美耳球虫的生长；和/或(iv)、减少宿主肠艾美耳球虫卵囊排出；和/或(v)、减轻宿主肠道病变；和/或(vi)、减少宿主增重损失；所述白细胞介素包括il-2、il-4或il-10中的一种或多种；所述干扰素包括ifn-γ；所述宿主包括家兔。4.表达载体，其特征在于，具有核苷酸序列1和/或核苷酸序列2；所述核苷酸序列1为：(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述核苷酸序列2为：(4)、如seq id no:3所示的核苷酸序列；或(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；所述多个为2个至50个。5.细胞，其特征在于，包括如权利要求4所述的表达载体。6.如权利要求4所述的表达载体或如权利要求5所述的细胞在制备预防和/或治疗球虫感染的疫苗中的应用；所述球虫感染中的所述球虫包括肠艾美耳球虫、大型艾美尔球虫、斯氏艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、环孢子虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、环孢子虫或柔嫩艾美耳球虫
中的一种或多种。7.重组蛋白，其特征在于，包括：(i)、rei-ef1α；或(ii)、rei-efg；或(iii)、rei-ef1α和rei-efg；所述rei-ef1α具有：(1)、如seq id no:2所示的氨基酸序列；或(2)、如(1)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或(3)、与如(1)或(2)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；所述rei-efg具有：(4)、如seq id no:4所示的氨基酸序列；或(5)、如(4)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或(6)、与如(4)或(5)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的氨基酸序列；所述多个为2个至10个。8.如权利要求7所述的重组蛋白在如下任意项中的应用：(i)、提高宿主抗肠艾美耳球虫抗体水平；和/或(ii)、提高宿主血清中白细胞介素和/或干扰素的水平；和/或(iii)、阻碍宿主中肠艾美耳球虫的生长；和/或(iv)、减少宿主肠艾美耳球虫卵囊排出；和/或(v)、减轻宿主肠道病变；和/或(vi)、减少宿主增重损失；和/或(vii)、制备预防和/或治疗球虫感染的疫苗中的应用；所述白细胞介素包括il-2、il-4或il-10中的一种或多种；所述干扰素包括ifn-γ；所述宿主包括家兔；所述球虫感染中的所述球虫包括肠艾美耳球虫、大型艾美尔球虫、斯氏艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、环孢子虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、环孢子虫或柔嫩艾美耳球虫中的一种或多种。9.疫苗，其特征在于，包括：(a)、将如权利要求4所述的表达载体转染至细胞中进行表达而获得的蛋白；或(b)、培养如权利要求5所述的细胞获得的蛋白；或(c)、如权利要求7所述的重组蛋白。10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，还包括皂素。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及肠艾美耳球虫延伸因子EF1α和EFG重组蛋白的应用。本发明提供了重组rEi-EF1α和rEi-EFG蛋白并进行了免疫保护实验。实验结果表明，rEi-EF1α和rEi-E EFG均对家兔肠艾美尔球虫感染有一定的免疫保护力，能刺激产生细胞和体液免疫，能不同程度地减少增重损失和卵囊排出，减轻肠道病变，其中rEi-EF1α免疫保护效果更佳，是肠艾美尔球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。尔球虫重组亚单位疫苗的候选抗原。


技术研发人员：杨光友 何维
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2023.06.05
技术公布日：2023/8/28