八宝丹用于增强PD-1抑制剂抗肝癌效果和/或减轻PD-1抑制剂毒副作用的用途的制作方法

八宝丹用于增强pd-1抑制剂抗肝癌效果和/或减轻pd-1抑制剂毒副作用的用途
技术领域
1.本发明属于八宝丹(bbd)应用技术领域，更具体而言，本发明涉及八宝丹用于增强pd-1抑制剂抗肝癌效果和/或减轻pd-1抑制剂毒副作用的用途。


背景技术：

2.肿瘤免疫治疗是当下肿瘤治疗领域最有前景的研究方向。免疫检查点抗体pd-1/pd-l1通路显示抗肿瘤活性跨越多种恶性病。
3.pd-1全称叫做细胞程序性死亡-配体1，也叫做表面抗原分化素274，是人体内的一种蛋白质，有cd274基因编码。这是一种ⅰ型跨膜蛋白，在体内与程序性死亡受体-1进行结合，传导免疫抑制的信号，降低淋巴结内cd8+t细胞的增生和活化。由于pd-1抑制剂(也可称为抗pd-1免疫检查点抑制剂，)带给部分晚期肿瘤患者长期的生存优势，pd-1抑制剂受到了极大关注。
4.但是，pd-1抑制剂具有一定的毒副作用，包括消化道不良反应、皮肤反应、肝毒性反应、肺毒性反应、肾毒性反应、暴发性心肌炎等其他不良反应。消化道不良反应包括腹泻、食欲减退、恶心、呕吐、便秘等。肝毒性反应主要表现为患者转氨酶升高、肝炎，并常伴有疲乏、腹水等症状。在临床使用中，大部分患者能够对肝毒性反应耐受，无需停止治疗，但仍有少部分患者因严重的肝毒性放弃治疗甚至危及生命。肺毒性反应主要包括肺炎、咳嗽、呼吸困难、呼吸衰竭等。其中，最常见的肺毒性反应是不同程度的肺炎。
5.卡瑞利珠单抗是一种抗pd-1单抗，属于抗肿瘤免疫治疗药物，是我国自主研发的人类免疫球蛋白g4(igg4)单克隆抗体(humab)，可与pd-1受体结合，阻断其与配体pd-l1和pd-l2间的相互作用，阻断pd-1通路介导的免疫抑制反应，从而抑制肿瘤的生长。其适应证包括霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、非小细胞肺癌(非鳞状)、食管鳞癌、鼻咽癌等。自上市以来，卡瑞利珠单抗的临床应用逐渐增多，导致其药品不良反应(adverse drug reactions，adr)也逐步呈现出来。在应用卡瑞利珠单抗治疗之后，可以出现全身多个器官组织的不良反应，可能会表现为血液、循环系统异常，内分泌、代谢系统异常，神经系统异常等，部分患者会出现肝炎、肺炎、肾炎等脏器损伤性疾病。这在很大程度上限制了其临床使用率。作为一种免疫检测的抑制剂，卡瑞利珠单抗临床副作用是贫血、发热、乏力、甲状腺功能减退症、蛋白尿、咳嗽、食欲降低及脏器毒性等。
6.因此，减轻pd-1抑制剂的毒副作用，已成为临床面临的巨大难题。
7.八宝丹源自中药古方，具有清利湿热、活血解毒、去黄止痛等功效。适用于湿热蕴结所致发热、黄疸、小便黄赤、恶心呕吐、纳呆、肋痛腹胀、舌苔黄腻或厚腻干白，或湿热下注所致尿道灼热刺痛、小腹胀痛，以及传染性病毒性感染、急性胆囊炎、急性泌尿系统感染等。


技术实现要素：

8.本技术发明人通过实验表明，与单独使用pd-1抑制剂卡瑞利珠单抗相比，八宝丹
(bbd)与卡瑞利珠单抗联用可以显著减小肿瘤体积和重量。同时，还确认，八宝丹(bbd)与卡瑞利珠单抗联用可有效减缓卡瑞利珠单抗导致的脏器毒性，具有减轻卡瑞利珠单抗毒性的功效。
9.因此，本发明一方面提供八宝丹用于制备增强pd-1抑制剂抗肝癌效果和/或减轻pd-1抑制剂毒副作用的药物的用途。
10.在实施方式中，所述pd-1抑制剂可以是卡瑞利珠单抗。
11.在实施方式中，所述肝癌是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)。
12.在实施方式中，所述减轻pd-1抑制剂毒副作用是指减缓卡瑞利珠单抗导致的脏器毒性。所述脏器包括肝脏、心脏、肺和肾脏。
13.在实施方式中，八宝丹可以是八宝丹胶囊，八宝丹药物粉末，八宝丹药物提取物或者类似物。
14.本发明的药物可以为本领域常规的各种剂型，例如固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液、混悬液、锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂和散剂等。所述药物的给药途径可以为注射给药或口服给药。所述注射给药可以包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。
15.基于质量百分比，所述药物可以包括0.01～100％的八宝丹或其提取物，以及99.99％～0的一种或多种药学上可接受的辅料。
16.所述药学上可接受的辅料例如可以选自赋形剂、填充剂、稀释剂、表面活性剂、粘合剂、抗氧剂、防腐剂、矫味剂、甜味剂、风味剂、香精、吸附剂、润滑剂、包衣剂、缓释剂、促进剂、推进剂、着色剂、颜料、染料等。
17.另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含：八宝丹和pd-1抑制剂。
18.本发明的药物组合物可以是任何合适的形式，例如，其包括各自独立包装的八宝丹和pd-1抑制剂的形式，也可以是八宝丹和pd-1抑制剂配制成单一组合物的形式，可以是试剂盒的形式，可以是上文所述的药物的各种剂型。
19.关于pd-1抑制剂和八宝丹的描述与前文相同。
20.本发明中，术语“减轻”、“减缓”和“缓解”可以互换使用，表示对卡瑞利珠单抗导致的脏器毒性的改善作用。
21.在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
22.除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本技术文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于
或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。
附图说明
23.图1显示收集的小鼠肿瘤和脾脏重量测量结果。
24.图2显示各组小鼠血清和肝脏中与细胞凋亡、纤维化等相关蛋白的检测结果。
25.图3显示各组小鼠心脏he染色结果。
26.图4显示各组小鼠肝脏he染色结果。
27.图5显示各组小鼠脾脏he染色结果。
28.图6显示各组小鼠肺组织he染色结果。
29.图7显示各组小鼠肾脏he染色结果。
具体实施方式
30.在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。
31.下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
32.下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.为了探究八宝丹是否可以增加pd-1抑制剂的治疗效果，选用临床常用药
‑‑‑
卡瑞利珠单抗作为pd-1抑制剂的实例进行实验。
34.1.实验材料
35.1.1小鼠：
36.c57bl/6小鼠(no.110011220104808771)购自北京维通利华实验动物技术有限公司
37.1.2药物：
38.八宝丹胶囊性状：胶囊内容物为黄褐色或灰棕褐色的内容物，提供单位：厦门中药厂有限公司，贮存方法：阴凉、干燥、室温保存。
39.八宝丹母液配制：称取bbd药物粉末，使用dmso配置成浓度为100mg/ml的母液，超声30min助溶后，用0.22μm的过滤器过滤，于-20℃冰箱储存备用，使用时采用dmso稀释配成实验所需的浓度。
40.卡瑞利珠单抗(camrelizumab，clm)，国药准字s20190027，购自江苏恒瑞医药股份有限公司，动物给药时用生理盐水配制成相应浓度。
41.1.3试剂
42.表1实验试剂
[0043][0044][0045]
1.4仪器
[0046]
表2实验仪器
[0047][0048]
2.实验方法
[0049]
c57bl/6小鼠适应性饲养一周后，随机分为对照(control)组、八宝丹(bbd)组、clm
(5mg/kg)组、clm(5mg/kg)+bbd组、clm(10mg/kg)组、clm(10mg/kg)+bbd组，采用皮下注射h22细胞进行肝癌皮下瘤模型造模后，待瘤长至适当大小时，通过灌胃给予八宝丹以及采用尾静脉注射给予clm抑制剂治疗两周，对照组灌胃给予生理盐水以及采用尾静脉注射给予生理盐水治疗，然后处死小鼠，收集肿瘤以及小鼠的血液、肝脏、心脏、脾脏、肺以及肾脏，进行下述实验。
[0050]
2.1肿瘤和小鼠脾脏
[0051]
测量收集的肿瘤和脾脏重量。
[0052]
2.2小鼠血清中ast(谷草转氨酶)及alt(谷丙转氨酶)的检测
[0053]
为了考察八宝丹是否可以减轻clm抑制剂的毒副作用，检测了小鼠血清中ast(谷草转氨酶)及alt(谷丙转氨酶)的表达，两者可作为肝脏功能的重要指标。
[0054]
ast的检测
[0055]
血清直接取样进行测定。按照ast检测试剂盒说明书进行操作，若酶活力超过150卡门氏单位时，需用生理盐水稀释血清后重新测定。
[0056]
操作表1
[0057][0058][0059]
操作表2
[0060][0061]
按操作表1操作获得ast标准曲线后，再按照操作表2测定获得各孔od值，以绝对od值(测定孔od值减去对照孔od值)，查标准曲线，求得相应的ast/gpt活力单位。
[0062]
alt的检测
[0063]
血清直接取样进行测定。按照alt检测试剂盒说明书进行操作，若酶活力超过150卡门氏单位时，需用生理盐水稀释血清后重新测定。
[0064]
操作表1
[0065][0066][0067]
操作表2
[0068][0069]
按操作表1操作获得alt标准曲线后，再按照操作表2测定获得各孔od值，以绝对od值(测定孔od值减去对照孔od值)，查标准曲线，求得相应的alt/gpt活力单位。
[0070]
2.2western blot检测肝脏中细胞损伤相关的蛋白
[0071]
为了进一步探究八宝丹对高剂量clm抑制剂引起的肝脏毒副作用的影响，采用western blot对肝脏中细胞损伤相关的蛋白进行了检测。
[0072]
检测方法如下。
[0073]
称取30mg左右各组小鼠的肝脏组织，冰浴破碎后加入0.5ml的组织裂解液置于冰上裂解30min，于12000g，4℃条件下离心5min。随后，取上清，采用bca蛋白定量法进行蛋白浓度测定。加入适量4
×
sds蛋白上样缓冲液定量蛋白于同一浓度，再置于金属浴中加热5min，使蛋白充分变性，待冷却后，置于-80℃冰箱保存备用。最后采用sds-page凝胶电泳法分离样品中的蛋白质后，将蛋白转移至pvdf膜上，4℃孵育相应一抗过夜，第二天用辣根过氧化物酶标记法检测目的蛋白的表达。
[0074]
2.3he染色
[0075]
为了考察八宝丹对clm高剂量引起的肝脏、心脏、脾脏、肺以及肾脏的毒副作用的影响，采用he染色进行观察。
[0076]
he染色如下进行。
[0077]
2.3.1组织包埋
[0078]
(1)乙醇脱水：组织经不同浓度的乙醇溶液(70％，80％，90％，95％，100％，100％)进行逐级脱水，每级乙醇40min。注意：骨性及钙化组织需在jybl
‑ⅱ
脱钙液中浸泡24h，待组织软化后再进行乙醇脱水步骤；
[0079]
(2)透明：组织依次浸泡于三个二甲苯中，每缸各1h；
[0080]
(3)浸蜡：组织依次浸泡于三个石蜡缸中，每缸各1h；
[0081]
(4)包埋：将液态的石蜡倒入模具盒中，再将浸好蜡的组织块平放底部，注意切面
方向朝下放置，待石蜡凝固后去掉包埋框，完全冷却变硬后再修整蜡块，组织外围的石蜡保留适中以便切片。
[0082]
2.3.2切片制作
[0083]
将预冷的蜡块固定在石蜡切片机上，使蜡块的切面与刀口成平行方向，刀的倾斜度通常15℃，转动轮转推进器，调节切片厚度为4μm，切成厚度均匀的切片。左手持毛笔，右手旋动切片机转把，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，再用镊子轻镊蜡片，以正面放入展片箱中，其水温45℃左右。待摊平整后捞片。贴附切片左手持载玻片之一端，垂直入水去附贴切片，右手用镊子辅助推动，附贴至玻片上的三分之二处。切片贴附后，放在空气中稍晾干，放置65℃烤片机上烤1h，再放置烘箱内烘烤2h。
[0084]
2.3.3石蜡切片脱蜡至水
[0085]
依次将石蜡切片放入二甲苯ⅰ10min-二甲苯ⅱ10min-二甲苯ⅲ10min-无水乙醇ⅰ5min-无水乙醇ⅱ5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-50％酒精5min梯度脱蜡。
[0086]
2.3.4he染色
[0087]
石蜡切片入苏木素染0.5-1分钟min，自来水漂洗，1％盐酸酒精分化数秒，自来水漂洗，然后1％氨水水溶液返蓝1min，流水冲洗数秒，放入伊红染液中染色数秒，流水漂洗。
[0088]
2.3.5脱水封片
[0089]
石蜡切片依次放入75％乙醇2min-85％乙醇2min-无水乙醇5min-无水乙醇5min-二甲苯5min透明，将切片从二甲苯拿出来中性树胶封片。
[0090]
2.3.6结果判读
[0091]
细胞核为蓝色，细胞质为红色。
[0092]
3.统计学处理
[0093]
所有实验均独立重复3次以上，graghpad prim 8软件用来进行统计学分析，统计结果以均数
±
sd表示，样本比较应用t检验。p＜0.05被认为具有统计学差异。*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
[0094]
4.实验结果
[0095]
4.1八宝丹联合卡瑞利珠单抗能够更加减小肿瘤的大小
[0096]
小鼠肿瘤和脾脏重量和体积测量结果见表3和图1。
[0097]
表3小鼠肿瘤和脾脏重量
[0098][0099]
图1显示收集的小鼠肿瘤和脾脏重量测量结果，其中，a为各组小鼠肿瘤图片；b为各组小鼠脾脏图片；c为各组小鼠肿瘤重量统计图；d为各组小鼠脾脏重量统计图。n≥6，与model组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0100]
表3和图1结果显示：单独给予八宝丹、clm(5mg/kg)、clm(10mg/kg)均可减小肿瘤的体积和重量，而clm(5mg/kg)+bbd组相对于单独给予八宝丹或clm(5mg/kg)能显著减小肿瘤的体积和重量，clm(10mg/kg)+bbd组比单独给予八宝丹或clm(10mg/kg)更加能显著减小肿瘤的体积和重量。
[0101]
上述结果表明八宝丹能够增加卡瑞利珠单抗的抗hcc效果，说明八宝丹能够增强pd-1抑制剂抗肝癌效果。
[0102]
4.2八宝丹能够减轻卡瑞利珠单抗的毒副作用
[0103]
各组小鼠血清中ast及alt的检测结果和肝脏中与细胞凋亡、纤维化等相关蛋白的检测结果见表4和图2。
[0104]
表4
[0105][0106]
图2显示各组小鼠血清和肝脏中与细胞凋亡、纤维化等相关蛋白的检测结果，其中，a为各组小鼠血清中ast的检测水平；b为各组小鼠血清中alt的检测水平；c和d为western blot法检测各组小鼠肝脏中与细胞凋亡、纤维化等相关蛋白的表达情况。n≥6，与control组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001；与clm 10mg相比，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001。与clm(5mg/kg)组相比较，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001。
[0107]
由图2的a和b可以看出，卡瑞利珠单抗(clm)(10mg/kg)可显著增加小鼠血清中ast及alt的表达，而给予八宝丹后可显著减缓此现象，提示八宝丹可减轻卡瑞利珠单抗引起的肝脏毒副作用，说明八宝丹能够减轻pd-1抑制剂对肝脏的毒副作用。
[0108]
由图2的c和d可以看出，相对于对照组，卡瑞利珠单抗(clm)高剂量(10mg/kg)组中，凋亡相关蛋白bax、纤维化相关蛋白α-sma及p-smad3显著升高，说明clm高剂量(10mg/kg)可以诱导肝脏细胞发生凋亡及纤维化，而给予八宝丹后二者水平得到了一定程度的降低。此外，卡瑞利珠单抗(clm)高剂量(10mg/kg)组中，抗凋亡蛋白mcl-1及bcl-2显著降低，而八宝丹联合治疗后，这些指标有所上升，提示八宝丹对卡瑞利珠单抗(clm)高剂量引起的肝脏毒性具有一定的保护作用，能减轻卡瑞利珠单抗引起的肝脏毒副作用，说明八宝丹能够减轻pd-1抑制剂对肝脏的毒副作用。
[0109]
图3显示各组小鼠心脏he染色结果。由图3可见，与对照组相比，八宝丹组和低剂量卡瑞利珠单抗(clm)(5mg/kg)以及bbd+低剂量卡瑞利珠单抗(clm)(5mg/kg)无明显的心脏损伤现象，细胞核分布居中清晰，形态完整、心肌纤维排列整齐，间隙的大小均匀。而高剂量clm(10mg/kg)组小鼠的心脏细胞核分布散乱，心肌纤维排列杂乱，间隙变大。而给予八宝丹治疗后该症状得到缓解。这提示八宝丹对卡瑞利珠单抗(clm)高剂量引起的心脏毒性具有一定的保护作用，能减轻卡瑞利珠单抗(clm)引起的心脏毒副作用，说明八宝丹能够减轻
pd-1抑制剂对心脏的毒副作用。
[0110]
图4显示各组小鼠肝脏he染色结果。如图4所示，与对照组相比，八宝丹组和低剂量卡瑞利珠单抗(clm)(5mg/kg)以及bbd+低剂量卡瑞利珠单抗(clm)(5mg/kg)无明显的肝脏损伤现象，各组小鼠肝脏组织中，可以看见正常的肝架构，肝细胞从中央静脉辐射；肝细胞中心呈现出圆形的细胞核；扁平的内皮细胞和枯否氏细胞排列形成血窦；细胞间隙清晰。而高剂量卡瑞利珠单抗(clm)(10mg/kg)组小鼠的肝组织破坏，增生的结缔组织包绕大小不等的略呈圆形的肝细胞团，肝索排列紊乱，而给予八宝丹治疗后该症状得到缓解。这指示八宝丹对卡瑞利珠单抗(clm)高剂量引起的肝脏毒性具有一定的保护作用，能减轻卡瑞利珠单抗引起的肝脏毒副作用，说明八宝丹能够减轻pd-1抑制剂对肝脏的毒副作用。
[0111]
图5显示各组小鼠脾脏he染色结果。如图5所示，各组小鼠脾组织中可见脾小体结构清晰，脾脏结构正常。
[0112]
图6显示各组小鼠肺组织he染色结果。如图6所示，与对照组相比，八宝丹组和低剂量卡瑞利珠单抗(clm)(5mg/kg)以及bbd+低剂量卡瑞利珠单抗(clm)(5mg/kg)无明显的肺损伤现象，而高剂量卡瑞利珠单抗(clm)(10mg/kg)组小鼠的肺组织结构严重损伤，肺泡结构不完整，肺间质中有大量的胶原纤维，肺部出现成片的纤维灶；而该组在给八宝丹治疗后肺组织破坏程度和纤维灶数量明显降低。这指示八宝丹可减轻卡瑞利珠单抗(clm)引起的肺损伤，说明八宝丹能够减轻pd-1抑制剂对肺的毒副作用。
[0113]
图7显示各组小鼠肾脏he染色结果。如图7所示，对照组、八宝丹组以及八宝丹+卡瑞利珠单抗(clm)低剂量(5mg/kg)组小鼠肾小球及肾小管形态正常，未见固有细胞增生和萎缩；卡瑞利珠单抗(clm)低剂量(5mg/kg)组肾小球形态正常，间质有轻微空泡和少量炎性细胞浸润，给予八宝丹后，该症状有所减轻；卡瑞利珠单抗(clm)高剂量(10mg/kg)组小鼠肾小管水肿，结构不清，出现间质纤维增生及肾小管损伤，如肾小管上皮细胞空泡变性，细胞扁平、脱落，管腔扩张，细胞管型，甚至形成裸基底膜等表现，而联合八宝丹治疗后，该现象得以缓解。这指示八宝丹可减轻卡瑞利珠单抗(clm)引起的肾脏损伤，说明八宝丹能够减轻pd-1抑制剂对肾脏的毒副作用。
[0114]
以上结果表明，卡瑞利珠单抗(clm)高剂量(10mg/kg)组小鼠具有一定的心、肝、肺及肾脏毒性，而卡瑞利珠单抗(clm)联合八宝丹治疗可在一定程度上减轻上述脏器毒性。结合western blot实验结果，八宝丹可下调肝脏中的凋亡相关蛋白表达而上调抗凋亡相关蛋白的表达，以及八宝丹可下调卡瑞利珠单抗(clm)高剂量(10mg/kg)引起的小鼠肝脏纤维化相关蛋白水平的表达，提示八宝丹具有减轻卡瑞利珠单抗(clm)毒性的功效，说明八宝丹能够减轻pd-1抑制剂的毒副作用。

技术特征：
1.八宝丹用于制备增强pd-1抑制剂抗肝癌效果和/或减轻pd-1抑制剂毒副作用的药物的用途。2.权利要求1所述的用途，其中，所述pd-1抑制剂是卡瑞利珠单抗。3.权利要求1所述的用途，其中，所述肝癌是肝细胞癌。4.权利要求1所述的用途，其中，所述减轻pd-1抑制剂毒副作用是指减缓卡瑞利珠单抗导致的脏器毒性。5.权利要求1所述的用途，其中，所述脏器包括肝脏、心脏、肺和肾脏。6.权利要求1所述的用途，其中，八宝丹是八宝丹胶囊，八宝丹药物粉末，八宝丹药物提取物或者类似物。7.权利要求1所述的用途，其中，所述药物的给药途径为口服给药。8.一种药物组合物，其包含：八宝丹和pd-1抑制剂。9.权利要求8所述的药物组合物，其中，所述pd-1抑制剂是卡瑞利珠单抗。10.权利要求8所述的药物组合物，其中，八宝丹是八宝丹胶囊，八宝丹药物粉末，八宝丹药物提取物或者类似物。

技术总结
本发明涉及八宝丹用于增强PD-1抑制剂抗肝癌效果和/或减轻PD-1抑制剂毒副作用的用途。本发明还提供一种药物组合物，其包含：八宝丹和PD-1抑制剂。本发明经试验证实，八宝丹能够增强PD-1抑制剂抗肝癌效果，减轻PD-1抑制剂的脏器毒性。的脏器毒性。


技术研发人员：车莉 于海洋 赖志成 关斌 刘彩艳 陈西翌 黄蔓如 曾佳涵 张思祺 郑珊珊
受保护的技术使用者：厦门中药厂有限公司
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/8/28