基于重组C因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法与流程

基于重组c因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法
技术领域
1.本发明属于内毒素检测技术领域，尤其涉及一种基于重组c因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法。


背景技术：

2.《中国药典》2020年版二部氟胞嘧啶注射液收载了热原检查项，该方法存在动物源性的个体差异，灵敏度不高，检测结果不能定量，标准化实验过程过长，且不符合动物3r原则。
3.凝胶法为细菌内毒素检查的经典方法，操作简单，灵敏度高，干扰因素少，结果重现性好，替代热原检查法成为必然。但又因细菌内毒素检查法中凝胶法及光度法所需的鲎试剂原材料未来可能限制生产。
4.所以本领域亟需一种可避免因鲎试剂限制导致无法进行细菌内毒素检查的全新检测方法。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于重组c因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法。本发明主要包括如下步骤：(1)标准品系列溶液的配制；(2)供试品系列稀释溶液的配制；(3)供试品加标系列溶液的配制；(4)加样并预热；(5)加入底物试剂进行检测。本发明采用重组c因子法对氟胞嘧啶注射液进行细菌内毒素方法学进行了研究，结果表明，本品细菌内毒素限值为0.50eu/ml，最大不干扰浓度为8倍，试验中三批样品细菌内毒素检查结果均低于限值，符合《中国药典》2020年版四部9251细菌内毒素检查法应用指导原则的要求，方法可行。
6.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
7.本发明提供了一种基于重组c因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，包括如下步骤：
8.(1)标准品系列溶液的配制：
9.配置5.0eu/ml、1.0eu/ml、0.5eu/ml、0.05eu/ml、0.005eu/ml标准品系列溶液；
10.(2)供试品系列稀释溶液的配制：
11.配制2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品系列稀释溶液；
12.(3)供试品加标系列溶液的配制：
13.配制2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品加标系列溶液，其中每一浓度的供试品加标溶液中均含有0.50eu/ml浓度的细菌内毒素；
14.(4)加样并预热；
15.(5)加入底物试剂进行检测。
16.优选的，所述步骤(2)的具体过程为：根据mvd＝cl/λ计算，供试品mvd溶液为100倍稀释液，取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品系列
稀释溶液，其中100倍的供试品稀释溶液为供试品mvd溶液。
17.优选的，所述步骤(3)的具体过程为：首先取供试品，使用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、50倍的供试品系列稀释溶液，然后取原液及所述供试品系列稀释溶液，加入1.0eu/ml的标准品溶液，使每一浓度的试验液中均含有0.50eu/ml浓度的细菌内毒素，供试品的最终稀释倍数为2倍、4倍、8倍、16倍、100倍，其中100倍的供试品稀释溶液为供阳mvd溶液。
18.优选的，所述步骤(4)的具体过程为：将标准品系列溶液，阴性对照，供试品系列稀释溶液，供试品加标系列溶液依次加入到96孔无热原白板中，每孔加样量为100μl，加样后将96孔板放到36～38℃生化培养箱中预热5-30分钟。
19.进一步优选的，其特征在于，所述步骤(4)中加样后将96孔板放到37℃生化培养箱中预热10-20分钟。
20.优选的，所述步骤(5)的具体过程为：将平衡至室温的荧光底物溶液、测定缓冲液和rfc酶溶液按照5:4:1的比例轻轻混匀制成底物试剂，在预热的96孔板中每孔加入100μl底物试剂，将96孔板放到36～38℃培养箱中孵育0.9～1.1小时，将酶标仪检测参数设置为380nm激发波长和440nm发射波长，分别检测孵育前(rfu
0h
)和孵育1小时(rfu
1h
)的荧光值。
21.进一步优选的，所述步骤(5)中加入底物试剂后，将96孔板放到37℃培养箱中孵育1小时。
22.优选的，所述氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法中氟胞嘧啶注射液细菌内毒素限值设定为：l＝0.50eu/ml。
23.优选的，所述氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法还包括数据统计的步骤：rfu
1h
减去rfu
0h
得到荧光差值(δrfu)；将标准品和样品的δrfu减去阴性对照的δrfu，得到标准品和样品的净δrfu值；计算内毒素工作标准品平均净δrfu和浓度(eu/ml)的对数，以log(标准品浓度)为横坐标，log(净δrfu)为纵坐标绘图并进行线性拟合，r2应≥0.980；通过拟合曲线计算供试品系列稀释溶液和供试品加标系列溶液的内毒素含量，计算加标回收率：加标回收率％＝(内毒素浓度
加标-内毒素浓度
未加标
)/加标内毒素浓度
×
100％，回收率在50％～200％之间认为样品无干扰，通过拟合曲线计算供试品mvd溶液，供阳mvd溶液的内毒素浓度，根据样品稀释倍数计算未稀释样品的内毒素浓度。
24.与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
25.(1)本发明采用重组c因子法对氟胞嘧啶注射液进行细菌内毒素方法学进行了研究，结果表明，本品细菌内毒素限值为0.50eu/ml，最大不干扰浓度为8倍，试验中三批样品细菌内毒素检查结果均低于限值，符合《中国药典》2020年版四部9251细菌内毒素检查法应用指导原则的要求，方法可行；
26.(2)本发明中的方法消除了鲎试剂中β-1,3-葡聚糖导致的假阳性结果的干扰；不依赖动物源性成分，可提供更高的供应安全性；重组表达生产，产品批间一致性良好；灵敏度范围更高；符合3r的替代原则；具有更高的特异性，更好的专属性、精密度、准确度。
附图说明
27.图1为本发明实施例1中内毒素标准品的拟合曲线。
具体实施方式
28.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
29.下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
30.实施例1重组c因子法
31.1材料与方法
32.1.1供试品：氟胞嘧啶注射液，回音必集团江西东亚制药有限公司生产，规格：250ml：2.5g，批号：2022052563、2022052564、2022030661。
33.1.2仪器：kb53生化培养箱；3001型酶标仪；ed115型恒温干燥箱。
34.1.3试剂试药：lonzapyrogene
tm
重组c因子内毒素检测试剂盒(本试剂盒的最低检测浓度为0.005eu/ml)，批号：0001079736。
35.1.4供试品细菌内毒素限值的确定：根据氟胞嘧啶注射液说明书，本品用法用量为静脉滴注，临床每小时最大用量为：0.05g/kg
·
h。内毒素限值：l＝k/m(k为人每千克体重临界的内毒素致热剂量，取5eu/kg；m为人1小时内每千克体重推荐使用的最大供试剂量，即0.05g/kg
·
h)。根据上述公式计算氟胞嘧啶的限值l为0.1eu/mg，又因本品浓度为10mg/ml，即l＝1eu/ml。本品为抗感染用药，存在联合用药的可能性，基于适当严格考虑，本品细菌内毒素限值设定为0.50eu/ml，这个限值同时符合100ml及以上装量的大输液类制剂限值的一般规定。综上，氟胞嘧啶注射液细菌内毒素限值设定为：l＝0.50eu/ml。
36.1.5实验方法
37.1.5.1标准品系列溶液的配制：取lonzapyrogene
tm
重组c因子内毒素检测试剂盒中的细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水配置成5.0eu/ml、1.0eu/ml、0.5eu/ml、0.05eu/ml、0.005eu/ml标准品系列溶液。
38.1.5.2供试品系列稀释溶液的配制：根据mvd＝cl/λ计算，供试品mvd溶液为100倍稀释溶液。取2022052563、2022052564、2022030661三个批号的供试品，分别用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品溶液。其中100倍的供试品稀释溶液为供试品mvd溶液。
39.1.5.3供试品加标系列溶液的配制：取2022052563、2022052564、2022030661三个批号的供试品，分别使用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、50倍的供试品溶液。取原液及上述各稀释溶液，各加入等量的1.0eu/ml的细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有0.50eu/ml浓度的细菌内毒素，供试品的最终稀释倍数为2倍、4倍、8倍、16倍、100倍。其中100倍的供试品稀释溶液为供阳mvd溶液。
40.1.5.4加样：将上述标准品系列溶液，阴性对照，供试品系列稀释溶液，供试品加标系列溶液依次加入到96孔无热原白板中，每孔加样量为100μl。加样后将96孔板放到37℃生化培养箱中预热10-20分钟。
41.1.5.5加入底物试剂和检测：将平衡至室温的荧光底物溶液、测定缓冲液和rfc酶溶液按照5:4:1的比例轻轻混匀制成底物试剂。在预热的96孔板中每孔加入100μl底物试剂，将96孔板放到37℃培养箱中孵育1小时。将酶标仪检测参数设置为380nm激发波长和440nm发射波长，分别检测孵育前(rfu
0h
)和孵育1小时(rfu
1h
)的荧光值。
42.1.6数据统计：rfu
1h
减去rfu
0h
得到荧光差值(δrfu)。将标准品和样品的δrfu减
去阴性对照的δrfu，得到标准品和样品的净δrfu值。计算内毒素工作标准品平均净δrfu和浓度(eu/ml)的对数，以log(标准品浓度)为横坐标，log(净δrfu)为纵坐标绘图并进行线性拟合，r2应≥0.980。通过拟合曲线计算供试品系列稀释溶液和供试品加标系列溶液的内毒素含量，计算加标回收率：加标回收率％＝(内毒素浓度
加标-内毒素浓度
未加标
)/加标内毒素浓度
×
100％，回收率在50％～200％之间认为样品无干扰，通过拟合曲线计算供试品mvd溶液，供阳mvd溶液的内毒素浓度，根据样品稀释倍数计算未稀释样品的内毒素浓度。
43.2结果
44.所得标准品拟合曲线如图1所示，各样品加标回收率如表1所示。
45.图1中标准品拟合曲线的方程为：log(净δrfu)＝0.908*log(内毒素浓度)+2.0246，可靠性试验结果：r2＝0.9984。
46.表1供试品干扰试验和内毒素含量结果
[0047][0048]
由表1可知：使用重组c因子法对三批氟胞嘧啶注射液进行细菌内毒素检查，将供试品稀释到8倍可以排除干扰，三批样品细菌内毒素含量分别为：0eu/ml(批号2022052563)，0.002eu/ml(批号2022052564)，0eu/ml(批号2022030661)，均小于设定的细菌内毒素限值l。重组c因子法可用于氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检查。
[0049]
3结论
[0050]
采用重组c因子法对氟胞嘧啶注射液进行细菌内毒素方法学研究，结果表明，本品细菌内毒素限值为0.50eu/ml，最大不干扰浓度为8倍，三批样品细菌内毒素检查结果均低于限值，符合《中国药典》2020年版四部9251细菌内毒素检查法应用指导原则的要求，方法可行。
[0051]
对比例1凝胶法
[0052]
1材料
[0053]
细菌内毒素工作标准品(cse)：中国药品生物制品检定所，规格：1ml，效价：90eu/支，批号：150601-202191。
[0054]
鲎试剂(tal)：湛江安度斯生物有限公司：灵敏度：0.125eu/ml，批号：2103222；厦门鲎试剂生物科技股份有限公司：灵敏度：0.125eu/ml，批号：22111043；湛江安度斯生物有限公司，灵敏度：0.125eu/ml，批号：2203160。
[0055]
细菌内毒素检查用水(bet水)：湛江安度斯生物有限公司，规格：50ml，批号：2007240。
[0056]
氟胞嘧啶注射液：规格：250ml：2.5g，回音必集团江西东亚制药有限公司，批号：2022052563、2022052564、2022030661。
[0057]
仪器：ed115型恒温干燥箱(20212641)；ols200振摇水浴锅(20040553)。
[0058]
2方法
[0059]
2.1供试品细菌内毒素理论限值(l)的确定
[0060]
根据氟胞嘧啶注射液说明书，本品用于念珠菌属心内膜炎、隐球菌属脑膜炎、念珠菌属或隐球菌属真菌败血症、肺部感染和尿路感染。用法用量：静脉滴注，一日0.1～0.15g/kg，分2～3次给药，静滴速度4～10ml/min。由此得出临床每小时最大用量为：0.05g/kg
·
h。
[0061]
内毒素限值：l＝k/m
[0062]
k为人每千克体重临界的内毒素致热剂量，取5eu/kg，m为人1小时内每千克体重推荐使用的最大供试剂量。
[0063]
参照氟胞嘧啶注射液的用量，氟胞嘧啶的限值计算如下：
[0064]
l＝k/m＝[5eu/(kg
·
h)]/[50mg/(kg
·
h)]＝0.1eu/mg
[0065]
本品浓度为10mg/ml，即l＝1eu/ml，本品为抗感染用药，存在联合用药的可能性，基于适当严格考虑，本品细菌内毒素设定为0.50eu/ml，这个限值同时符合100ml及以上装量的大输液类制剂限值的一般规定。
[0066]
综上，氟胞嘧啶注射液细菌内毒素限值为：l＝0.50eu/ml。
[0067]
2.2鲎试剂灵敏度(λ)复核
[0068]
按《中国药典》2020年版二部附录细菌内毒素检查法进行灵敏度复核实验。将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15min，然后稀释成2λ、λ、0.5λ、0.25λ等系列浓度，依法进行试验。
[0069]
2.3供试品最大有效稀释倍数(mvd)
[0070]
根据中国药典规定，供试品最大有效稀释倍数mvd＝cl/λ，其中λ为鲎试剂标示灵敏度，c为1ml/ml，l为氟胞嘧啶注射液的细菌内毒素限值0.50eu/ml。若取λ为0.25、0.125、0.06、0.03eu/ml，则氟胞嘧啶注射液的对应有效稀释浓度为：c0.25＝2倍供试品稀释液；
c0.125＝4倍供试品稀释液；c0.06＝8.3倍供试品稀释液；c0.03＝16.6倍供试品稀释液。
[0071]
2.4干扰预试验
[0072]
随机选三批同厂家生产的氟胞嘧啶注射液，最终抽选的是材料中的三批，用细菌内毒素检查用水分别稀释成2倍、4.15倍、8.3倍的供试品稀释液，记为1/2mvd溶液。取原液及上述1/2mvd溶液各加入等体积的细菌内毒素检查用水配制成2倍、4倍、8.3倍、16.6倍的供试品稀释液，将此系列浓度溶液记为npc；另外取原液及上述1/2mvd溶液中各加入等量的4λ浓度的细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，记此系列浓度溶液记为ppc。
[0073]
取材料中两个厂家的三个鲎试剂，分别与上述ppc和npc进行反应，每一浓度重复两管，并设阳性和阴性对照，进行干扰预试验。
[0074]
2.5正式干扰试验
[0075]
取氟胞嘧啶注射液原液作为1/2mvd溶液。
[0076]
取材料中两个厂家的三个鲎试剂，分别加入2λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液和含2λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品稀释液进行反应，每一浓度重复四管，并设分别加入检查用水和供试品溶液的阴性对照，各重复两管。
[0077]
2.6供试品细菌内毒素检查
[0078]
按中国药典细菌内毒素检查法，使用0.125eu/ml的鲎试剂对3批供试品进行细菌内毒素检查，并同时设立供试品的自身阳性对照管。
[0079]
3结果
[0080]
3.1鲎试剂灵敏度(λ)复核鲎试剂灵敏度(λ)复核结果如表2所示。
[0081]
表2tal灵敏度复核结果
[0082][0083]
实验结果表明，所用tal灵敏度均在0.5λ～2λ范围内，符合规定。
[0084]
3.2干扰预试验
[0085]
干扰预试验结果如表3所示。
[0086]
表3氟胞嘧啶注射液干扰预试验结果
[0087][0088][0089]
由干扰预试验结果可以初步了解，氟胞嘧啶注射液在4倍稀释的浓度下，对细菌内毒素检查均不存在干扰作用，可在此浓度下进行正式干扰试验。
[0090]
3.3正式干扰试验
[0091]
正式干扰试验结果如表4所示。
[0092]
表4氟胞嘧啶注射液正式干扰试验结果
[0093][0094][0095]
试验结果表明，es在0.5λ～2λ范围内，es/et比值均在0.5～2.0范围之内(包括0.5和2.0)，本品在稀释倍数为4倍时不干扰鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应，可按低于或等于此浓度进行细菌内毒素检查。
[0096]
3.4供试品细菌内毒素检查
[0097]
经内毒素干扰试验，当供试品稀释至4倍稀释液或以下浓度时对内毒素和鲎试剂反应无干扰作用，可采用凝胶法对供试品进行内毒素检查。使用鲎试剂(tal)：湛江安度斯生物有限公司，灵敏度：0.125eu/ml，批号：2203160，对抽验的供试品共3批进行细菌内毒素检查，结果如表5所示。
[0098]
表5氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检查结果
[0099][0100]
结果表明，氟胞嘧啶注射液的细菌内毒素检查方法具有可行性，可按内毒素限值l＝0.50eu/ml进行细菌内毒素检查。抽验的3批供试品细菌内毒素检查合格。
[0101]
将实施例1与对比例1比较得知：本发明的方法与对比例1中的方法相比，本发明中的方法操作更加方便简洁；灵敏度范围更高；对鲎资源的保护，重组c因子法更具有适用性；重组c因子法可定量检测。
[0102]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.基于重组c因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)标准品系列溶液的配制：配置5.0eu/ml、1.0eu/ml、0.5eu/ml、0.05eu/ml、0.005eu/ml标准品系列溶液；(2)供试品系列稀释溶液的配制：配制2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品系列稀释溶液；(3)供试品加标系列溶液的配制：配制2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品加标系列溶液，其中每一浓度的供试品加标溶液中均含有0.50eu/ml浓度的细菌内毒素；(4)加样并预热；(5)加入底物试剂进行检测。2.根据权利要求1所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体过程为：根据mvd＝cl/λ计算，供试品mvd溶液为100倍稀释液，取供试品，用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、16倍、100倍的供试品系列稀释溶液，其中100倍的供试品稀释溶液为供试品mvd溶液。3.根据权利要求2所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体过程为：首先取供试品，使用细菌内毒素检查用水稀释成2倍、4倍、8倍、50倍的供试品系列稀释溶液，然后取原液及所述供试品系列稀释溶液，加入1.0eu/ml的标准品溶液，使每一浓度的试验液中均含有0.50eu/ml浓度的细菌内毒素，供试品的最终稀释倍数为2倍、4倍、8倍、16倍、100倍，其中100倍的供试品稀释溶液为供阳mvd溶液。4.根据权利要求3所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体过程为：将标准品系列溶液，阴性对照，供试品系列稀释溶液，供试品加标系列溶液依次加入到96孔无热原白板中，每孔加样量为100μl，加样后将96孔板放到36～38℃生化培养箱中预热5-30分钟。5.根据权利要求4所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中加样后将96孔板放到37℃生化培养箱中预热10-20分钟。6.根据权利要求5所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(5)的具体过程为：将平衡至室温的荧光底物溶液、测定缓冲液和rfc酶溶液按照5:4:1的比例轻轻混匀制成底物试剂，在预热的96孔板中每孔加入100μl底物试剂，将96孔板放到36～38℃培养箱中孵育0.9～1.1小时，将酶标仪检测参数设置为380nm激发波长和440nm发射波长，分别检测孵育前(rfu
0h
)和孵育1小时(rfu
1h
)的荧光值。7.根据权利要求6所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中加入底物试剂后，将96孔板放到37℃培养箱中孵育1小时。8.根据权利要求1所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法中氟胞嘧啶注射液细菌内毒素限值设定为：l＝0.50eu/ml。9.根据权利要求1所述的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，其特征在于，所述氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法还包括数据统计的步骤：rfu
1h
减去rfu
0h
得到荧光差值(δrfu)；将标准品和样品的δrfu减去阴性对照的δrfu，得到标准品和样品的净δrfu值；计
算内毒素工作标准品平均净δrfu和浓度(eu/ml)的对数，以log(标准品浓度)为横坐标，log(净δrfu)为纵坐标绘图并进行线性拟合，r2应≥0.980；通过拟合曲线计算供试品系列稀释溶液和供试品加标系列溶液的内毒素含量，计算加标回收率：加标回收率％＝(内毒素浓度
加标-内毒素浓度
未加标
)/加标内毒素浓度
×
100％，回收率在50％～200％之间认为样品无干扰，通过拟合曲线计算供试品mvd溶液，供阳mvd溶液的内毒素浓度，根据样品稀释倍数计算未稀释样品的内毒素浓度。

技术总结
本发明提供了一种基于重组C因子法的氟胞嘧啶注射液细菌内毒素检测方法，属于内毒素检测技术领域。本发明主要包括如下步骤：(1)标准品系列溶液的配制；(2)供试品系列稀释溶液的配制；(3)供试品加标系列溶液的配制；(4)加样并预热；(5)加入底物试剂进行检测。本发明采用重组C因子法对氟胞嘧啶注射液进行细菌内毒素方法学进行了研究，结果表明，本品细菌内毒素限值为0.50EU/ml，最大不干扰浓度为8倍，试验中三批样品细菌内毒素检查结果均低于限值，符合《中国药典》2020年版四部9251细菌内毒素检查法应用指导原则的要求，方法可行。方法可行。方法可行。


技术研发人员：秦美蓉 王平 姜睿琪 陈润桦 王晓炜 陈宁
受保护的技术使用者：深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心）
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/8/28