病毒载体的调配物的制作方法

1.本公开总体上涉及包括病毒载体的调配物。调配物包括防止病毒载体聚集的试剂，所述病毒载体提供易于施用的稳定调配物。


背景技术：

2.病毒载体是用于在疫苗和基因疗法中递送治疗性核酸的媒剂。为了产生病毒载体，使生产细胞生长并转染，所述生产细胞通常是质粒。然后从细胞中采集病毒载体并调配以供使用。在没有聚集的情况下实现高载体浓度是制造病毒载体的重要技术瓶颈。
3.病毒颗粒可以形成聚集体，所述聚集体增加其抵抗环境应力和消毒剂降解的抗性。聚集受细胞类型和细胞相关杂质、病毒类型、病毒的生化性质(例如，病毒大小和形状、等电点等)、理化因子(例如，ph、离子强度)以及操作因子(例如，工艺温度)的影响。虽然对病毒聚集的研究始于20世纪50年代，但这一现象仍在继续研究并且被视为病毒载体制造的主要挑战之一。
4.病毒聚集影响治疗剂的下游处理以及其施用的合适性。病毒聚集是由于静电和疏水相互作用而发生的，并且聚集的病毒颗粒可能会导致下游处理的并发症，导致在如过滤和后续纯化步骤等基于膜的过程期间的显著载体损失和产率降低。此外，聚集体影响提供最终产物质量指标的病毒感染性读数。


技术实现要素：

5.本公开涉及一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及球状蛋白。在各实施例中，所述球状蛋白是白蛋白、甲胎蛋白、维生素d结合蛋白、阿法敏(afamin)、珠蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白或其组合。在各实施例中，所述调配物是液体。在各实施例中，所述调配物包括约0.1％至约5.0％的球状蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.5％至约2.0％的球状蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.75％至约1.5％的球状蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.8％至约1.2％的球状蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约1.0％的球状蛋白。
6.本公开还涉及一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及白蛋白。在各实施例中，所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或乳清蛋白。在各实施例中，所述调配物是液体。在各实施例中，所述调配物包括约0.1％至约5.0％的白蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.5％至约2.0％的白蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.75％至约1.5％的白蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.8％至约1.2％的白蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约1.0％的白蛋白。
7.本发明涉及一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及多糖。在各实施例中，所述多糖是糖胺聚糖。在各实施例中，所述多糖是透明质酸钠、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、肝素、软骨素、硫酸软骨素、皮肤素、硫酸皮肤素、角质素、硫酸角质素、褐藻胶、壳聚糖、壳聚糖硫酸盐、葡聚糖、硫酸葡聚糖或其组合。在各实施例中，所述多糖是透明质酸钠。在各实施例
中，所述调配物是液体。在各实施例中，所述调配物包括约0.01ng/ml至约1mg/ml的多糖。在各实施例中，所述调配物包括约0.05ng/ml至约0.5mg/ml的多糖。在各实施例中，所述调配物包括约0.1ng/ml至约0.3mg/ml的多糖。在各实施例中，所述调配物包括约0.15ng/ml至约0.25mg/ml的多糖。在各实施例中，所述调配物包括约0.2ng/ml的多糖。在各实施例中，所述调配物包括约0.01ng/ml至约1mg/ml的透明质酸钠。在各实施例中，所述调配物包括约0.05ng/ml至约0.5mg/ml的透明质酸钠。在各实施例中，所述调配物包括约0.1ng/ml至约0.3mg/ml的透明质酸钠。在各实施例中，所述调配物包括约0.15ng/ml至约0.25mg/ml的透明质酸钠。在各实施例中，所述调配物包括约0.2ng/ml的透明质酸钠。
8.在各实施例中，本公开还提供了包括球状蛋白和多糖两者的调配物。在各实施例中，本公开提供了包括白蛋白和多糖两者的调配物。在这些调配物的实施例中，所述多糖是透明质酸钠。
9.在本文的调配物的实施例中，所述调配物是液体。在液体调配物的实施例中，所述调配物包括约2mm至约100mm的缓冲液。在所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约5mm至约50mm的缓冲液。在所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约15mm至约25mm的缓冲液。在所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约20mm的缓冲液。
10.在本文的调配物的实施例中，所述缓冲液是磷酸钠、l-组氨酸、tris、琥珀酸盐、柠檬酸钠或其组合。
11.在各实施例中，本文的调配物进一步包括糖。在包括糖的所述调配物的实施例中，所述调配物是液体。在包括糖的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约50mm至约500mm的糖。在包括糖的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约100mm至约400mm的糖。在包括糖的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约250mm至约350mm的糖。在包括糖的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约290mm的糖。在包括糖的所述调配物的实施例中，所述糖是蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖或其组合。在各实施例中，所述糖是蔗糖。
12.在各实施例中，本文的调配物进一步包括表面活性剂。在包括表面活性剂的所述调配物的实施例中，所述调配物是液体。在包括表面活性剂的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约0.01％至约0.1％的表面活性剂。在包括表面活性剂的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约0.015％至约0.025％的表面活性剂。在包括表面活性剂的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约0.02％的表面活性剂。在包括表面活性剂的所述调配物的实施例中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20或kolliphor p188。
13.在各实施例中，本文的调配物进一步包括氯化钠。在包括氯化钠的所述调配物的实施例中，所述调配物是液体。在包括氯化钠的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约10mm至约500mm的氯化钠。在包括氯化钠的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约50mm至约300mm的氯化钠。在包括氯化钠的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约100mm至约200mm的氯化钠。在包括氯化钠的所述液体调配物的实施例中，所述调配物包括约150mm的氯化钠。
14.在本文所公开的所述调配物的实施例中，所述调配物是冷冻干燥的固体。在冷冻干燥的调配物的实施例中，所述缓冲液是磷酸钠、l-组氨酸、柠檬酸钠或其组合。在所述冷冻干燥的调配物的实施例中，所述调配物进一步包括糖。在各实施例中，所述糖是蔗糖、乳
糖、葡萄糖、海藻糖或其组合。在各实施例中，所述糖是蔗糖。在所述冷冻干燥的调配物的实施例中，所述调配物进一步包括表面活性剂。在各实施例中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20或kolliphor p188。在所述冷冻干燥的调配物的实施例中，所述调配物进一步包括氯化钠。
15.在本文的任何调配物的实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约50nm。在各实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约40nm。在各实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约31nm。在各实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约25nm。在各实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约20nm。
16.在本文的任何调配物的实施例中，所述调配物的多分散性指数小于或等于约0.5。在各实施例中，所述调配物的多分散性指数小于或等于约0.35。在各实施例中，所述调配物的多分散性指数小于或等于约0.3。
17.在本文的任何调配物的实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或杂交载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺病毒载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。
18.在本文的任何调配物的实施例中，所述调配物被调配用于向人施用。
19.本公开还提供了一种用于减少调配物中病毒载体聚集的方法，所述方法包括将所述病毒载体调配成本文所公开的任何调配物。
20.在各实施例中，本公开还提供了一种调配物，其包括：约10
×
108vg/ml至约10
×
10
13
vg/ml的病毒载体；约5mm至约40mm的磷酸钠；约200mm至约400mm的蔗糖；以及约0.1％至约5.0％的白蛋白。在各实施例中，所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其组合。在各实施例中，所述调配物包括约10
×
109vg/ml至约10
×
10
11
vg/ml的所述病毒载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或杂交载体。
21.在各实施例中，本公开还提供了一种调配物，其包括：约10
×
108vg/ml至约10
×
10
13
vg/ml的病毒载体；约5mm至约40mm的磷酸钠；约200mm至约400mm的蔗糖；以及约0.05mg/ml至约0.4mg/ml的透明质酸钠。在各实施例中，所述调配物包括约10
×
109vg/ml至约10
×
10
11
vg/ml的所述病毒载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或杂交载体。
附图说明
22.以下附图构成本说明书的一部分并且被包含以进一步阐述本发明的某些方面的示例性实施例。
23.图1示出了dna酶i消化和热衣壳开放步骤对使用qpcr进行aav2滴定的影响的病毒基因组滴度的条形图，如实例5.1中所描述的。
24.图2示出了在艾本德管(eppendorf tube)中储存24小时后混合样品相较于非混合样品的aav2滴度定量的条形图，如实例5.1中所描述的。
25.图3a和3b示出了aav2样品的透射电子显微镜(tem)图像，如实例5.1中所描述的：(a)用标准样品制备方案制备的滴度为1
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vg/ml的aav2样品和(b)用修改的样品制备方案制备的滴度为1
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vg/ml的aav2样品。
26.图4a-f示出了用动态光散射(dls)和多角度动态光散射(madls)获得的结果图，如实例5.1中所描述的：(a)通过反向散射滴度为1.0
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vg/ml的四个复制品获得的颗粒大小分布，(b)反向散射测量结果的相关曲线，(c)反向散射，(d)侧向散射，(e)前向散射和(f)madls。
27.图5a和5b是实例5.1中描述的ζ电位测量结果的图：(a)相位图和(b)滴度为1
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vg/ml的aav2调配物的ζ电位测量结果。
28.图6是用实例5.1中描述的alamarblue试剂进行的u2os-htb-96细胞活力测定的图。
29.图7是在用aav2-cmv-gfp以105和106vg/细胞的moi感染u2os细胞之后的荧光的条形图(激发：488nm，发射：520nm)，如实例5.1中所描述的。
30.图8是在用aav2以103、104、105、106vg/细胞的moi转导u2os-htb-96细胞24小时、48小时、72小时、96小时和7天之后的荧光强度的条形图(激发：460nm，发射：515nm)，如实例5.1中所描述的。
31.图9是在t0时用调配物研究1的qpcr测量的aav2-cmv-gfp滴定结果的条形图，如实例5.2中所描述的。
32.图10是在t0时从调配物研究1的gfp表达测定中检测到的荧光的条形图，如实例5.2中所描述的。在用aav2-cmv-gfp调配物转导后在24小时、48小时和72小时之后测量u2os细胞的荧光。
33.图11示出了调配物3、4、6和7(从左到右)的冻干饼的图像，如实例5.3中所描述的。调配物3和4在饼中示出较小的裂纹。
34.图12是在调配物研究2期间用qpcr测量的所有滴度定量的总结的条形图，如实例5.3中所描述的。
35.图13是u2os细胞在用与t0和储存在-20℃和-80℃下三个月的冷冻样品相比储存在2-8℃下一个或三个月的不同aav2调配物转导之后的荧光的条形图，如实例5.3中所描述的。
36.图14是u2os细胞在用与t0和储存在-20℃和-80℃下三个月的冷冻样品相比储存在25℃下一个月的不同aav2调配物转导之后的荧光的条形图，如实例5.3中所描述的。
37.图15是u2os细胞中的gfp表达在暴露于冻融循环、水平搅拌应力以及暴露于40℃下之后的条形图，如实例5.3中所描述的。
38.图16a-h是在t0时通过反向散射所有调配物获得的颗粒大小分布图，如实例5.3中所描述的：(a)调配物1，(b)调配物2，(c)调配物3，(d)调配物4，(e)调配物5，(f)调配物6，(g)调配物7和(h)调配物8。
39.图17(a)是所有调配物在所有测量的拉点期间的z平均值的条形图并且图17(b)是所有调配物在所有测量的拉点期间的多分散性指数的条形图，如实例5.3中所描述的。
40.图18a-h是具有不同大小的亚可见颗粒的条形图，如实例5.3中所描述的：(a)所有调配物中的亚可见颗粒计数≥2μm，(b)所有安慰剂中的亚可见颗粒计数≥2μm，(c)所有调配物中的亚可见颗粒计数≥5μm，(d)所有安慰剂中的亚可见颗粒计数≥5μm，(e)所有调配物中的亚可见颗粒计数≥10μm，(f)所有安慰剂中的亚可见颗粒计数≥10μm，(g)所有调配物中的亚可见颗粒计数≥25μm，(h)所有安慰剂中的亚可见颗粒计数≥25μm。
41.图19是在调配物研究2中测量的所有ζ电位的总结的条形图，如实例5.3中所描述的。
42.图20a和20b是以下的总结ph测量结果的条形图，如实例5.3中所描述的：(a)所有调配物和(b)安慰剂。
43.图21是示出了在用不同的0.2μm无菌pvdf过滤器进行无菌过滤之后150mm氯化钠对aav2滴度回收率的影响的病毒滴度的条形图，如实例5.4中所描述的。
44.图22a-c是通过dls测量的不含氯化钠的aav2调配物与含150mm nacl的调配物相比的颗粒大小分布图，如实例5.4中所描述的。(a)不含任何nacl的调配物，(b)补充有150mm nacl的调配物，(c)含150mm nacl的调配物并且通过0.2μm millex pvdf无菌过滤器进行无菌过滤。
45.图23是示出了补充有不同染料和不同浓度的所有样品的热偏移的图，如实例5.4中所描述的。
46.图24a和24b是(a)补充有1x、5x和10x sypro-orange的aav2样品的荧光强度的图(b)补充有1x、5x和10x sybr-gold的aav2样品的荧光强度的图，如实例5.4中所描述的。
47.图25示出了用于对空aav2衣壳和完整aav2衣壳进行定量的tem图像，如实例5.1中所描述的。9个图像用11kv拍摄，一个图像用20kv拍摄并且一个图像用37kv拍摄。
48.图26a-h示出了在t0时通过反向散射所有安慰剂获得的颗粒大小分布图，如实例5.1中所描述的：(a)安慰剂1，(b)安慰剂2，(c)安慰剂3，(d)安慰剂4，(e)安慰剂5，(f)安慰剂6，(g)安慰剂7和(h)安慰剂8。
49.图27a-h示出了在25℃下一个月之后通过反向散射获得的调配物的图，如实例5.1中所描述的：(a)调配物1，(b)调配物2，(c)调配物3，(d)调配物4，(e)调配物5，(f)调配物6，(g)调配物7和(h)调配物8。
具体实施方式
50.本文描述了具有提高的稳定性和减少的病毒载体聚集的病毒载体调配物。增加的稳定性和减少的聚集使得调配物更容易储存、运输和施用。本文还描述了用于增加稳定性和减少病毒载体调配物的病毒载体聚集的方法。
51.如本文所使用的，“一个(a)”或“一种(an)”可以意指一个或多个。如本文所使用的，当与单词“包括(comprising)”结合使用时，单词“一个”或“一种”可以意指一个或多于一个。如本文所使用的，“另一个”或“另外”可以意指至少第二个或更多个。
52.贯穿本技术，术语“约”用于指示值包含用于测定值的方法/装置固有的误差变化或研究受试者间存在的变化。通常，根据情况，术语“约”意在涵盖大约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％或更高的可变性。在各实施例中，由于在本文中使用术语“约”的上下文，本领域的技术人员将理解由所述术语指示的可变性水平。还应当理解，术语“约”的使用还包含具体列举的值。
53.权利要求中对术语“或”的使用用于意指“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或替代方案相互排斥，尽管本公开支持仅指代替代方案以及指代“和/或”的定义。
54.如本文所使用的，术语“包括(comprising)”(以及包括的任何变体或形式，如“包
括(comprise)”和“包括(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何变体或形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包含(including)”(以及包含的任何变体或形式，如“包含(includes)”和“包含(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何变体或形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包容性的或开放性的并且不排除另外的未列举的元素或方法步骤。
55.术语“例如(for example)”及其对应的缩写“例如(e.g.)”(无论是否斜体)的使用意指所引用的特定术语是本公开的代表性实例和实施例，除非另有明确说明，否则所述代表性实例和实施例不旨在限于所参考或引用的特定实例。
56.如本文所使用的，“之间”是包含范围末端的范围。例如，x与y之间的数字明确地包含数字x和y以及落入x和y内的任何数字。
57.球状蛋白调配物
58.本公开提供了包括球状蛋白的病毒载体调配物，所述球状蛋白具有提高的稳定性和降低的载体聚集。在各实施例中，本公开提供了一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及球状蛋白。
59.在各实施例中，球状蛋白可以是适用于减少病毒载体调配物中病毒聚集的任何球状蛋白。在各实施例中，调配物包括多于一种类型的球状蛋白。术语球状蛋白是指形状相对呈球形的水溶性蛋白。在一些实施例中，术语球状蛋白是指具有大量α-螺旋和/或β-折叠的蛋白，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个α-螺旋和/或2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个β-折叠。在一些实施例中，α-螺旋和/或β-折叠折叠成紧密结构。在一些实施例中，球状蛋白包括疏水性氨基酸侧链和亲水性氨基酸侧链，其中大多数疏水性氨基酸侧链掩埋在球状蛋白的内部(即，不能与水相互作用)并且其中大多数亲水性氨基酸侧链位于球状蛋白的表面上(即，能够与水相互作用)。在一些实施例中，球状蛋白包括疏水性氨基酸侧链，其中60％、70％、80％或90％的疏水性氨基酸侧链掩埋在球状蛋白的内部。在一些实施例中，球状蛋白包括亲水性氨基酸侧链，其中60％、70％、80％或90％的亲水性氨基酸侧链掩埋在球状蛋白的内部。在一些实施例中，球状蛋白具有1个、2个、3个或更多个二硫键。在一些实施例中，球状蛋白包括多于一种多肽，例如，球状蛋白包括2种、3种或4种形成三维结构的多肽。在各实施例中，球状蛋白基本上没有变性，即，球状蛋白基本上保持其三维结构。因此，在一些实施例中，本公开提供了一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及球状蛋白，其中所述调配物适用于将球状蛋白保持在其天然状态，即，球状蛋白基本上没有变性。
60.在一些实施例中，球状蛋白的分子量为10kda至1200kda、约20kda至约1200kda、约30kda至约1000kda、约30kda至约700kda、约40kda至约500kda、约50kda至约250kda、约50kda至约200kda、约50kda至约150kda或约50kda至约100kda。在一些实施例中，球状蛋白的分子量为700kda至1200kda、800kda至1200kd、900kda至1200kda或1000kda至1200kda。
61.在一些实施例中，球状蛋白的溶解度为约10mg/ml至约150mg/ml、约20mg/ml至约120mg/ml、约30mg/ml至约100mg/ml、约40mg/ml至约90mg/ml、约40mg/ml至约80mg/ml或约40mg/ml至约70mg/ml。
62.在各实施例中，球状蛋白是白蛋白、甲胎蛋白、维生素d结合蛋白、阿法敏、珠蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白或其组合。在各实施例中，球状蛋白是水溶性球状蛋白。在各实施例中，球状蛋白是白蛋白。在各实施例中，球状蛋白是血清白蛋白。在各实施例中，所述白
蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或乳清蛋白。在各实施例中，所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其组合。在各实施例中，白蛋白是人血清白蛋白。在各实施例中，白蛋白是牛血清白蛋白。
63.在各实施例中，所述调配物包括约0.1％至约5.0％的球状蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.5％至约2.0％的球状蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.75％至约1.5％的球状蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.8％至约1.2％的球状蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约1.0％的球状蛋白。在各实施例中，调配物包括约0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5.0％的球状蛋白。
64.在各实施例中，调配物是液体或凝胶。在各实施例中，所述调配物是液体。在各实施例中，调配物由液体或凝胶冻干而成。在各实施例中，调配物由冻干形式重构。
65.在各实施例中，本公开提供了一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及白蛋白。
66.在各实施例中，调配物包括多于一种类型的白蛋白。在各实施例中，所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或乳清蛋白。在各实施例中，所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其组合。在各实施例中，白蛋白是人血清白蛋白。在各实施例中，白蛋白是牛血清白蛋白。
67.在各实施例中，所述调配物包括约0.1％至约5.0％的白蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.5％至约2.0％的白蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.75％至约1.5％的白蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约0.8％至约1.2％的白蛋白。在各实施例中，所述调配物包括约1.0％的白蛋白。在各实施例中，调配物包括约0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5.0％的白蛋白。
68.在各实施例中，包括白蛋白的调配物是液体或凝胶。在各实施例中，所述调配物是液体。在各实施例中，调配物由液体或凝胶冻干而成。在各实施例中，调配物由冻干形式重构。
69.多糖调配物
70.在其它实施例中，本公开提供了一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及多糖。
71.在各实施例中，多糖可以是适用于减少病毒载体调配物中病毒聚集的任何多糖。在各实施例中，调配物包括多于一种多糖。在各实施例中，多糖是透明质酸钠、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、肝素、软骨素、硫酸软骨素、皮肤素、硫酸皮肤素、角质素、硫酸角质素、褐藻胶、壳聚糖、壳聚糖硫酸盐、葡聚糖、硫酸葡聚糖或其组合。在各实施例中，多糖是糖胺聚糖。在各实施例中，多糖是硫酸角质素。在各实施例中，所述多糖是透明质酸钠。
72.如本文所使用的，术语“透明质酸钠”包含共轭碱形式的透明质酸盐和酸形式的透明质酸两者。
73.在各实施例中，所述调配物包括约0.01ng/ml至约1mg/ml的多糖。在各实施例中，所述调配物包括约0.05ng/ml至约0.5mg/ml的多糖。在各实施例中，所述调配物包括约0.1ng/ml至约0.3mg/ml的多糖。在各实施例中，所述调配物包括约0.15ng/ml至约0.25mg/ml的多糖。在各实施例中，所述调配物包括约0.2ng/ml的多糖。在各实施例中，调配物包括约0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.15ng/ml、0.2ng/ml、0.25ng/ml、0.3ng/ml、0.35ng/ml、0.4ng/
ml、0.45ng/ml或0.5ng/ml的多糖。
74.在各实施例中，调配物包括约0.01ng/ml至约1mg/ml的糖胺聚糖。在各实施例中，调配物包括约0.05ng/ml至约0.5mg/ml的糖胺聚糖。在各实施例中，调配物包括约0.1ng/ml至约0.3mg/ml的糖胺聚糖。在各实施例中，调配物包括约0.15ng/ml至约0.25mg/ml的糖胺聚糖。在各实施例中，调配物包括约0.2ng/ml的糖胺聚糖。在各实施例中，调配物包括约0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.15ng/ml、0.2ng/ml、0.25ng/ml、0.3ng/ml、0.35ng/ml、0.4ng/ml、0.45ng/ml或0.5ng/ml的糖胺聚糖。
75.在各实施例中，所述调配物包括约0.01ng/ml至约1mg/ml的透明质酸钠。在各实施例中，所述调配物包括约0.05ng/ml至约0.5mg/ml的透明质酸钠。在各实施例中，所述调配物包括约0.1ng/ml至约0.3mg/ml的透明质酸钠。在各实施例中，所述调配物包括约0.15ng/ml至约0.25mg/ml的透明质酸钠。在各实施例中，所述调配物包括约0.2ng/ml的透明质酸钠。在各实施例中，调配物包括约0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.15ng/ml、0.2ng/ml、0.25ng/ml、0.3ng/ml、0.35ng/ml、0.4ng/ml、0.45ng/ml或0.5ng/ml的透明质酸钠。
76.在各实施例中，调配物是液体或凝胶。在各实施例中，所述调配物是液体。在各实施例中，调配物由液体或凝胶冻干(即，冷冻干燥)而成。在各实施例中，调配物由冻干形式重构。
77.组合调配物
78.在各实施例中，本公开提供了一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；球状蛋白；以及多糖。在各实施例中，调配物包括上文所公开的浓度的球状蛋白和上文所公开的浓度的多糖两者。在各实施例中，调配物包括白蛋白和多糖两者。在各实施例中，调配物包括上文所公开的浓度的白蛋白和上文所公开的浓度的多糖两者。
79.在各实施例中，调配物包括白蛋白和糖胺聚糖两者。在各实施例中，调配物包括上文所公开的浓度的白蛋白和上文所公开的浓度的糖胺聚糖两者。
80.在组合调配物的实施例中，多糖是透明质酸钠。在各实施例中，调配物包括白蛋白和透明质酸钠两者。在各实施例中，调配物包括上文所公开的浓度的白蛋白和上文所公开的浓度的透明质酸钠两者。
81.液体和凝胶调配物
82.在各实施例中，调配物包括缓冲液。在各实施例中，调配物是液体并且包括缓冲液。在各实施例中，调配物是凝胶并且包括缓冲液。在各实施例中，调配物包括约2mm至约100mm的缓冲液。在各实施例中，调配物包括约5mm至约50mm的缓冲液。在各实施例中，调配物包括约15mm至约25mm的缓冲液。在各实施例中，调配物包括约20mm的缓冲液。在各实施例中，调配物包括约5mm至约75mm的缓冲液。在各实施例中，调配物包括约10mm至约30mm的缓冲液。在各实施例中，调配物包括约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mm的缓冲液。
83.在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约2mm至约100mm的缓冲液。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约5mm至约50mm的缓冲液。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约15mm至约25mm的缓冲液。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约20mm的缓冲液。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约5mm至约75mm的缓冲液。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约10mm至约30mm的缓冲液。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约5、10、15、20、25、30、35或40mm的缓冲液。
84.在各实施例中，缓冲液是磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液、tricine缓冲液、四硼酸盐缓冲液、mpos缓冲液、甘氨酸缓冲液或咪唑缓冲液。在各实施例中，缓冲液是磷酸钠、l-组氨酸、柠檬酸钠或其组合。
85.在各实施例中，调配物进一步包括糖。在各实施例中，调配物是液体并且进一步包括糖。在各实施例中，调配物是凝胶并且进一步包括糖。在各实施例中，调配物包括约50mm至约500mm的糖。在各实施例中，调配物包括约100mm至约400mm的糖。在各实施例中，调配物包括约250mm至约350mm的糖。在各实施例中，调配物包括约290mm的糖。在各实施例中，调配物包括约50mm至约400mm的糖。在各实施例中，调配物包括约100mm至约340mm的糖。在各实施例中，调配物包括约200mm至约340mm的糖。在各实施例中，调配物包括约240mm至约340mm的糖。在各实施例中，调配物包括约210mm、220mm、230mm、240mm、250mm、260mm、270mm、280mm、290mm、300mm、310mm、320mm、330mm、340mm、350mm、360mm、370mm、380mm、390mm或400mm的糖。
86.在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约50mm至约500mm的糖。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约100mm至约400mm的糖。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约250mm至约350mm的糖。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约290mm的糖。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约50mm至约400mm的糖。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约100mm至约340mm的糖。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约200mm至约340mm的糖。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约240mm至约340mm的糖。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约210mm、220mm、230mm、240mm、250mm、260mm、270mm、280mm、290mm、300mm、310mm、320mm、330mm、340mm、350mm、360mm、370mm、380mm、390mm或400mm的糖。
87.在各实施例中，糖是单糖、二糖或三糖。在各实施例中，糖是右旋糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、核糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖或其组合。在各实施例中，所述糖是蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖或其组合。在各实施例中，所述糖是蔗糖。
88.在各实施例中，调配物进一步包括表面活性剂。在各实施例中，调配物是液体并且进一步包括表面活性剂。在各实施例中，调配物是凝胶并且进一步包括表面活性剂。在各实施例中，调配物包括约0.01％至约0.1％的表面活性剂。在各实施例中，调配物包括约0.015％至约0.025％的表面活性剂。在各实施例中，调配物包括约0.02％的表面活性剂。在各实施例中，调配物包括约0.05％至约0.50％的表面活性剂。在各实施例中，调配物包括约0.05％至约0.3％的表面活性剂。在各实施例中，调配物包括约0.1％至约0.3％的表面活性剂。在各实施例中，调配物包括约0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％或0.3％的表面活性剂。
89.在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约0.01％至约0.1％的表面活性剂。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约0.015％至约0.025％的表面活性剂。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约0.02％的表面活性剂。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约0.05％至约0.50％的表面活性剂。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约0.05％至约0.3％的表面活性剂。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约0.1％至约0.3％的表面活性剂。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％或0.3％的表面活性剂。
90.本领域已知的各种表面活性剂，并且可以包含阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性离子表面活性剂。
91.每种类型的一些常见表面活性剂包含：
92.离子表面活性剂：i.)阴离子表面活性剂(通常基于硫酸根、磺酸根或羧酸根阴离子)，例如α-烯烃硫酸盐、辛基/癸基醚硫酸铵、磺基琥珀酸钠、十三烷基醚硫酸钠、三乙醇胺月桂基硫酸盐、甘胆酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、n-月桂酰基肌氨酸、烷基硫酸盐，具体地碱金属或碱土金属烷基硫酸盐，如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂等或十二烷基硫酸铵；月桂基醚硫酸钠、烷基苯磺酸盐、脱氧胆酸碱金属盐或碱土金属盐或脱氧胆酸、磷酸酯及其盐，ii.)阳离子表面活性剂，例如基于如十六烷基三甲基溴化铵或其它烷基三甲基铵盐等季铵阳离子、如硬脂基胺乙酸酯或椰油烷基胺乙酸酯等烷基胺盐、苯扎氯铵和溴化物，例如苄索氯铵或甲基苄索氯铵、硬脂基氨基聚乙二醇醚或油氨基聚乙二醇醚。
93.如十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氨基氧化物、chaps、chapso、bigchap、empigen bb(n-十二烷基-n,n-二甲基甘氨酸)、月桂基二甲基氨基氧化物、两性洗涤剂3-08、两性洗涤剂3-10、两性洗涤剂3-12、两性洗涤剂3-14、两性洗涤剂3-16等两性离子(两性)表面活性剂或如烷基聚环氧乙烷、烷基聚糖苷等非离子表面活性剂，包含：辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷，例如nonidet p10或nonidet p40表面活性剂、mega-8、-9或-10、triton x 100和相关的表面活性剂或吐温家族表面活性剂，如吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、apo-10、apo-12、c8e6、ci0e6、ci2e6、ci2e8、ci2e9、ci2e
10
、ci6ei2、ci6e
2i
、庚烷-1,2,3-三醇、lubrol px、genapol家族，正十二烷基-b-d-吡喃葡萄糖苷、四聚乙二醇单月桂醚、普朗尼克家族等。
94.在一些实施例中，表面活性剂是至少两种表面活性剂的组合。优选地，一种表面活性剂是阳离子表面活性剂，而至少一种另外的表面活性剂是非离子表面活性剂。在一些实施例中，表面活性剂是作为阳离子表面活性剂的十六烷基三甲基溴化铵和作为非离子表面活性剂的聚山梨醇酯，例如吐温20或吐温80的组合。在一些实施例中，表面活性剂不是十六烷基三甲基溴化铵。
95.在一些实施例中，表面活性剂是阴离子表面活性剂。在各实施例中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20或kolliphor p188。
96.在各实施例中，调配物进一步包括氯化钠。在各实施例中，调配物是液体并且进一步包括氯化钠。在各实施例中，调配物是凝胶并且进一步包括氯化钠。在各实施例中，调配物包括约10mm至约500mm的氯化钠。在各实施例中，调配物包括约50mm至约300mm的氯化钠。在各实施例中，调配物包括约100mm至约200mm的氯化钠。在各实施例中，调配物包括约150mm的氯化钠。在各实施例中，调配物包括约50mm至约250mm的氯化钠。在各实施例中，调配物包括约125mm至约175mm的氯化钠。在各实施例中，调配物包括约50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、200mm、210mm、220mm、230mm、240mm或250mm的氯化钠。
97.在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约10mm至约500mm的氯化钠。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约50mm至约300mm的氯化钠。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约100mm至约200mm的氯化钠。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约150mm的氯化钠。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约50mm至约250mm的氯化钠。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约125mm至约175mm的氯化
钠。在各实施例中，调配物是液体并且调配物包括约50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm、150mm、160mm、170mm、180mm、190mm、200mm、210mm、220mm、230mm、240mm或250mm的氯化钠。
98.冷冻干燥(冻干)调配物
99.在各实施例中，调配物是冷冻干燥(冻干)的固体。冷冻干燥的固体可以使用本领域已知的方法制备，包含本文所描述的方法。
100.在各实施例中，冷冻干燥的固体包括缓冲液。在各实施例中，缓冲液是磷酸钠、l-组氨酸、tris、琥珀酸盐、柠檬酸钠或其组合。在各实施例中，冷冻干燥的调配物进一步包括糖。在各实施例中，所述糖是蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖或其组合。在各实施例中，所述糖是蔗糖。
101.在各实施例中，冷冻干燥的调配物进一步包括表面活性剂。在各实施例中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20或kolliphor p188。
102.在各实施例中，冷冻干燥的调配物进一步包括氯化钠。
103.在各实施例中，冷冻干燥的调配物通过冷冻干燥如本文所描述的液体或凝胶调配物来制备。在各实施例中，重构冷冻干燥的调配物以形成如本文所描述的液体或凝胶调配物。在各实施例中，在水中重构冷冻干燥的调配物以形成如本文所描述的液体或凝胶调配物。
104.调配物性质
105.在各实施例中，病毒载体在病毒颗粒中。因此，在一些实施例中，术语病毒载体可以包含与病毒载体相关(例如，涵盖病毒载体)的蛋白衣壳颗粒。在一些实施例中，病毒载体在感染性病毒颗粒中，即，所述病毒载体能够感染宿主生物体。为了完全清楚起见，如本文所使用的，在一些实施例中，术语病毒载体可以包含病毒颗粒，例如，感染性病毒颗粒。因此，本文所描述的调配物或方法中提及的病毒载体可以包含病毒颗粒，例如，感染性病毒颗粒。
106.在各实施例中，调配物具有使用本领域用于评估病毒载体调配物的标准技术测量的性质。在各实施例中，测量调配物的z平均值。如本文所使用的术语“z平均值”是溶液中颗粒的强度加权平均流体动力学大小。在各实施例中，病毒载体调配物中较大颗粒的存在可以指示载体聚集。本文描述了用于测量z平均值的方法。在各实施例中，使用动态光散射(dls)测量z平均值。在各实施例中，使用多角度动态光散射(madls)测量z平均值。在各实施例中，使用纳米跟踪分析测量z平均值。
107.在各实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约50nm。在各实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约40nm。在各实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约31nm。在各实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约25nm。在各实施例中，所述调配物的z平均值小于或等于约20nm。
108.在各实施例中，测量调配物的多分散性指数(pdi)。如本文所使用的术语“多分散性指数”是基于大小的样品异质性的量度。在各实施例中，病毒载体调配物中异质颗粒的存在可以指示病毒载体聚集。本文描述了用于测量多分散性指数的方法。在各实施例中，使用动态光散射测量多分散性指数。在各实施例中，使用尺寸排阻色谱法，例如，凝胶渗透色谱法测量多分散性指数。在各实施例中，使用质谱法测量多分散性指数。
109.在各实施例中，所述调配物的多分散性指数小于或等于约0.5。在各实施例中，所述调配物的多分散性指数小于或等于约0.35。在各实施例中，所述调配物的多分散性指数小于或等于约0.3。
110.病毒载体
111.调配物中的病毒载体可以是本领域已知的任何病毒载体。在各实施例中，调配物包括多于一种类型的病毒载体。在各实施例中，调配物包括多于一种相同类型的病毒载体，其中病毒载体中的每一种病毒载体包括不同的核酸序列。
112.在各实施例中，病毒载体是腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或杂交载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺病毒载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。在各实施例中，病毒载体是血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7或aav8的腺相关病毒载体。
113.在各实施例中，本公开提供了一种调配物，其包括约10
×
108vg/ml(病毒基因组/ml)至约10
×
10
13
vg/ml的病毒载体。在各实施例中，所述调配物包括约10
×
109vg/ml至约10
×
10
11
vg/ml的所述病毒载体。在各实施例中，所述调配物包括约10
×
105vg/ml至约10
×
10
15
vg/ml的所述病毒载体。在各实施例中，所述调配物包括约10
×
106vg/ml至约10
×
10
14
vg/ml的所述病毒载体。在各实施例中，所述调配物包括约10
×
107vg/ml至约10
×
10
13
vg/ml的所述病毒载体。在各实施例中，所述调配物包括约10
×
108vg/ml至约10
×
10
12
vg/ml的所述病毒载体。在各实施例中，调配物包括约10
×
105vg/ml、10
×
106vg/ml、10
×
107vg/ml、10
×
108vg/ml、10
×
109vg/ml、10
×
10
10
vg/ml、10
×
10
11
vg/ml、10
×
10
12
vg/ml、10
×
10
13
vg/ml、10
×
10
14
vg/ml或10
×
10
15
vg/ml的病毒载体。
114.向受试者施用
115.在各实施例中，调配物被调配成向哺乳动物施用。在各实施例中，调配物被调配用于向人施用。在各实施例中，调配物被调配成向伴侣动物施用，例如狗或猫。在各实施例中，调配物被调配成向农场动物施用，例如，牛、猪、家禽、绵羊、山羊或马。
116.减少病毒载体聚集的方法
117.在各实施例中，本公开提供了用于减少调配物中病毒载体聚集的方法。在各实施例中，用于减少调配物中病毒载体聚集的方法包括将病毒载体调配成本文所公开的任何调配物。在各实施例中，用于减少病毒载体聚集的方法在用于制造治疗性蛋白的过程中使用。在各实施例中，用于减少病毒载体聚集的方法在用于制造治疗性抗体的过程中使用。在各实施例中，用于减少病毒载体聚集的方法在用于制造疫苗的过程中使用。在各实施例中，用于减少病毒载体聚集的方法在用于开发治疗性蛋白的过程中使用。在各实施例中，用于减少病毒载体聚集的方法在用于开发治疗性抗体的过程中使用。在各实施例中，用于减少病毒载体聚集的方法在用于开发疫苗的过程中使用。
118.调配物
119.在各实施例中，本公开提供了一种调配物，其包括：
120.约10
×
108vg/ml至约10
×
10
13
vg/ml的病毒载体；
121.约5mm至约40mm的磷酸钠；
122.约200mm至约400mm的蔗糖；以及
123.约0.1％至约5.0％的白蛋白。
124.在调配物的实施例中，白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其组合。在各实施例中，所述调配物包括约10
×
109vg/ml至约10
×
10
11
vg/ml的所述病毒载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或杂交载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺病毒载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。在各实施例中，病毒载体是血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7或aav8的腺相关病毒载体。
125.在各实施例中，本公开提供了一种调配物，其包括：
126.约10
×
108vg/ml至约10
×
1013vg/ml的病毒载体；
127.约5mm至约40mm的磷酸钠；
128.约200mm至约400mm的蔗糖；以及
129.约0.05mg/ml至约0.4mg/ml的透明质酸钠。
130.在调配物的实施例中，调配物包括约10
×
109vg/ml至约10
×
10
11
vg/ml的病毒载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或杂交载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺病毒载体。在各实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。在各实施例中，病毒载体是血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7或aav8的腺相关病毒载体。
131.实例
132.对相关领域的普通技术人员而言将显而易见的是，在不脱离任何实施例的范围的情况下，可以对本文所描述的方法和应用作出其它合适的修改和调整。以下实例仅出于说明的目的包含在本文中并且不旨在是限制性的。
133.1所使用的缩写
134.aav腺相关病毒
135.p188kolliphorp188
136.ps80聚山梨醇酯80
137.qpcr定量聚合酶链反应
138.ntc无模板对照
139.tem透射电子显微镜
140.dsf差示扫描荧光测定法
141.dls动态光散射
142.madls多角度动态光散射
143.sst系统合适性测试
144.pen/strep青霉素和链霉素
145.fbs胎牛血清
146.gfp绿色荧光蛋白
147.vg/ml病毒基因组/ml
148.bp碱基对
149.pdi多分散性指数
150.dsdna双链脱氧核糖核酸
151.moi感染复数(添加到一个细胞中用于转导的病毒基因组数量)
152.f120mml-组氨酸，290mm蔗糖，ph5.5，0.02％ps80，1.095
·
10
11
vg/ml
153.f220mml-组氨酸，290mm蔗糖，ph6.8，0.02％ps80，1.095
·
10
11
vg/ml
154.f320mm柠檬酸钠，290mm蔗糖，ph6.8，0.02％ps80，1.095
·
10
11
vg/ml
155.f420mm磷酸钠，290mm蔗糖，ph6.8，0.02％ps80，1.095
·
10
11
vg/ml
156.f520mm磷酸钠，290mm蔗糖，ph6.8，0.02％ps80，1.095
·
10
11
vg/ml
157.f620mm磷酸钠，290mm蔗糖，ph6.8，1％人白蛋白，1.095
·
10
11
vg/ml
158.f720mm磷酸钠，290mm蔗糖，ph6.8，0.2mg/ml透明质酸钠，1.095
·
10
11
vg/ml
159.f820mm磷酸钠，290mm蔗糖，ph6.8，0.001％p188，1.095
·
10
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vg/ml
160.摘要
161.背景：腺相关病毒血清型2(aav2)已成为基因疗法中的流行载体。基于其在不表现出基因毒性的情况下产生高效且稳定的转基因表达的能力，这些载体对于治疗方法是有希望的[1]。尽管基于aav2的基因疗法已经进入市场，但关于其调配物开发的文献报道很少。
[0162]
目的：本文报道了用于表征aav2的分析方法的评估和开发以及这些策略在为期三个月的调配物稳定性研究中的应用以提高和扩展对aav2调配物的认识。
[0163]
方法：为了表征aav2样品，使用了以下方法：反向末端重复序列qpcr、用aav2-cmv-gfp感染u2os-htb-96细胞、透射电子显微镜(tem)、动态光散射(dls)和ζ电位。
[0164]
结果：在方法评估和开发期间，表明在使用通用itrqpcr进行载体定量之前添加酶——dna酶i和热衣壳开放步骤提高了准确性。使用tem确定所有衣壳的58％含有载体基因组。就转基因表达而言，调配物稳定性研究表明，储存在液体或冷冻状态下的样品表现优于冷冻干燥的样品。比较不同的缓冲系统，与柠檬酸钠缓冲液相比，当将载体储存在l-组氨酸或磷酸钠中时，转基因表达显著更高。另外，观察到表达在储存时以温度依赖性方式快速降低。与表达的变化相比，滴度在整个研究过程中保持恒定并且仅受搅拌应力的影响。此外，还表明在混合期间发生载体聚集。添加1％的人白蛋白防止聚集并且提高载体在表达方面的稳定性特性。
[0165]
结论：该项目的目的是提高和扩展与aav2调配物相关的认识。所述目的通过评估和开发几种用于表征aav2的分析方法以及后续调配物研究实现。示出aav2的转基因表达受调配物缓冲液、ph和储存条件的影响。如滴度变化等参数受影响较小。尽管如此，提供了策略以通过添加白蛋白来进一步提高调配物的稳定性并防止聚集。
[0166]
2引言
[0167]
最近，基因疗法因其在临床试验中的成功而获得了很多关注[2]。基因疗法有望解决如遗传性疾病等尚未满足的医疗需求[3]。治疗原理基于对引起疾病的缺陷基因的替代或作为治疗的治疗性基因的递送[4]。几种不同的载体用于促进基因转移。有病毒载体和非病毒载体，并且后者可以分为物理方法、机械方法和化学方法[5]。如激光照射、电穿孔和基因枪的使用等物理方法已经有了显著的提高，但是其使用仅限于局部施用[6]。如脂质体和阳离子聚合物等化学和合成方法是最成功和广泛使用的非病毒载体[7]。
[0168]
逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒是基因疗法中使用的病毒载体的代表[8]。参见表1。这些载体可以分为两组。第一组能够稳定地将其基因组整合到宿主细胞染色单体中。逆转录病毒、慢病毒和疱疹病毒是该组的成员。第二组将其病毒基因组保藏在染色体外的空间中。该组的代表是腺病毒和腺相关病毒[8]。逆转录病毒能够将其单链
rna转化为稳定地整合到宿主细胞基因组中的双链dna[9]。这种永久的整合使得能够实现持续且持久的表达。所有逆转录病毒都需要有丝分裂以实现稳定的整合[10]。尽管存在如致突变性和需要有丝分裂活性细胞等缺点，逆转录病毒基因疗法还是取得了一些成功。所述逆转录病毒基因疗法经常应用于t细胞的离体转导以表达针对癌细胞的嵌合t细胞受体(car-t)[11]。另一种应用由针对严重遗传性联合免疫缺陷的市售离体逆转录病毒疗法strimvelis表示[12]。
[0169]
最近，已经记录临床试验中逆转录病毒的使用有所减少并转向慢病毒[13]。慢病毒属于逆转录病毒家族，但具有感染非分裂细胞的特殊能力[14]。慢病毒的主要风险是损害安全性和效率特性的免疫应答的刺激[15]。
[0170]
正在研究单纯性疱疹病毒1型，用于治疗中枢神经系统内的疾病以及用于溶解癌细胞[16]。
[0171]
腺病毒表示染色体外递送其基因组的第二组病毒载体的成员。与慢病毒相似，所述腺病毒可以感染非分裂细胞。腺病毒含有双链dna[17]。腺病毒载体的优点是其高转导和表达效率。所述腺病毒载体的高免疫原性表示主要缺点[18]。
[0172]
然而，此类有希望的病毒疗法的开发道路是具有挑战性的。1999年，第一位患有鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症的患者接受了重组腺病毒治疗并且在经历了导致多器官衰竭的严重免疫应答之后去世[19]。在2000年的另一项研究中，四名患有严重联合免疫缺陷的儿童在用逆转录病毒对其cd34+细胞进行离体处理之后出现了白血病样t细胞增殖[20]。
[0173]
随着腺相关病毒(aav)的发现和开发，基因疗法领域经历了重大突破。所述腺相关病毒在不导致任何基因毒性或严重免疫应答的情况下感染分裂细胞和非分裂细胞并且引起稳定的体内蛋白表达的能力使其成为目前最有希望的病毒载体。许多aav疗法已经过渡到临床试验和市场[21]。
[0174]
2012年，首个名为阿利泼金(glybera)的基于aav的基因疗法获准上市。所述基因疗法被开发用于治疗遗传性家族性脂蛋白脂肪酶缺乏症。临床研究表明，该基于aav1的疗法显著降低血液中的甘油三酯浓度至多14周。这伴随着胰腺炎和腹痛发病率的降低[22]。2018年，由于长期效率不足和缺乏商业可行性，阿利泼金退出了市场[23]。随着luxturna在2017年获得批准，基因疗法取得了重大突破。所述基因疗法是递送缺失的基因以产生视网膜色素上皮蛋白的基于aav2的基因疗法[24]。疗法由星火治疗公司(spark therapeutics)开发以治疗视网膜营养不良[13]。最近，avexis的基因疗法zolgensma获得了fda的批准，这是针对脊髓性肌肉萎缩的单剂量治疗。疾病是由存活的运动神经元1基因的突变或缺失引起的。zolgensma利用aav9载体将缺失或有缺陷的基因递送到骨骼肌[25]。尽管其高昂的价格产生了许多负面的头条新闻，但该疗法的成功是证明其它病毒基因疗法概念的重要里程碑[26]。
[0175][0176]
表1：市售aav2疗法，阿利泼金于2018年退出市场
[0177]
2.1腺相关病毒
[0178]
由于aav载体的成功和有希望的性质，所述aav载体当前是病毒基因疗法研究的主题。尽管这些年来关于aav的知识显著增加，但是关于aav调配物开发的文献报道很少。在aav调配物开发领域所做的一些贡献以及其分子组合物和感染性途径将在下一节中进一步阐述。
[0179]
croyle和同事对该领域作出了最早的贡献之一。他们进行了aav和腺病毒稳定性研究并且鉴定了几个影响病毒载体稳定性的过程因子和赋形剂。他们观察到aav在冷冻干燥时相当稳定。当储存在25℃下至多三个月时没有观察到感染性滴度的损失。与冷冻到-20℃下相比，将aav调配物冷冻到-80℃下导致更大的感染性滴度损失。根据他们的说法，该损失与冷冻时ph下降有关。然而，当储存在-80℃、-20℃、2-8℃、25℃下超过五个月时，适当选择赋形剂和缓冲液产生稳定的aav感染性滴度[27]。
[0180]
另一个小组发表了关于重组aav(raav)的适当的运输和储存温度的第二项研究。他们研究了如-80℃、-20℃、2-8℃、25℃和37℃等不同储存温度对体外和体内转导效率的影响。储存在-80℃下的病毒储备在至多一个月的时间内保持稳定并且没有记录到转导效率的任何损失，即使aav储存在没有任何冷冻保护剂的情况下。随着温度的升高，转导效率下降。具体地在储存的第一天，与25℃的储存温度相比，如37℃等更高的温度导致更大的转导效率下降。此外，研究表明，尽管转导效率迅速下降，但即使储存在37℃下，病毒的一些部分仍保持感染性[28]。
[0181]
最近的研究测试了不同的aav储存温度、缓冲溶液和不同临床材料的相容性。他们使用载体拷贝数和转基因表达作为载体稳定性的标志物。只有在将aav加热到72℃20分钟或将其暴露于uv光10分钟之后才能观察到转基因表达的体内减少。如55℃等温度20分钟或四次冻融循环对转基因表达没有影响。他们还用含有补体蛋白的人血清暴露aav1载体。尽管超过70％的群体携带aav1免疫，但即使此类条件也不会导致转基因表达的任何损失。同时，对常用的临床材料和稀释剂进行了相容性研究。测试了不锈钢针和聚乙烯以及玻璃表面对转基因表达的影响。另外，他们研究了如磷酸盐缓冲液、乳酸林格溶液和钆等临床应用中不同的常用稀释剂。没有材料或稀释剂导致转基因表达降低。即使在5.5与8.5之间的不同ph对表达也没有影响[29]。
[0182]
所有上述研究仅监测了感染性滴度或转导效率。没有进行另外的物理化学表征。
[0183]
wright和同事发表了研究，在所述研究中，他们另外监测了载体聚集。对称的衣壳
结构和带相反电荷的衣壳袋之间的另外的离子相互作用导致低aav溶解度。因此，聚集经常发生在滴度》10
14
vg/ml的高滴度调配物中。然而，当暴露于冻融循环时，在低得多的滴度下也观察到聚集。他们表明，几种赋形剂，主要是盐，能够防止载体聚集。这种效应是由离子强度引起的并且不依赖于特定的离子种类。例如，带电荷的氨基酸只能在与某些盐相同的离子强度下才能防止聚集。另外，出版物表明，aav的纯化过程对载体聚集有至关重要的影响。在纯化之后的核酸酶处理显著减少了载体聚集。这一发现表明，残留宿主细胞蛋白和dna片段促进衣壳之间的离子键。高离子强度调配物对转导效率和转基因表达没有负面影响[30]。
[0184]
为了更好地理解影响aav稳定性的性质，有必要更深入地研究衣壳结构和特性。腺相关病毒是细小病毒家族的成员[31]。所述腺相关病毒具有由60种蛋白组成的二十面体形状的衣壳，直径为约25nm[32]。aav衣壳的等电点为约6.3。大多数血清型的三维结构已经通过低温电子显微镜阐明[33]。在aav2的情况下，分别命名为vp1、vp2、vp3的结构蛋白以1:1:10的比率组成衣壳。vp3不仅是最丰富的衣壳蛋白，而且在n末端比其它结构蛋白短65个氨基酸[34]。vp1和vp2似乎对成功感染细胞至关重要。在其n末端含有磷脂酶a2(pla2)和掩埋在衣壳内的核定位信号(nls)结构域。当删除vp1/2衣壳蛋白或突变其pla2结构域时，病毒失去其转导活性，即使衣壳结构保持完整[35]。为了成功的转导，掩埋的pla2和nls需要被外化。外化是通过五重对称轴上的通道来完成的。由于这个孔相当小，大体积vp2 n端不太可能被外化[36]。正好12个孔定位在aav2衣壳上。成孔氨基酸的突变或缺失表明没有或只有pla2活性和vp1n末端外化降低。此类突变对受体介导的衣壳摄取没有影响，但强烈影响病毒的感染性[37]。最近的研究表明，ph的变化可以诱导vp1 n末端的构象变化。ph从7.5降到5将导致可逆的构象变化和vp1 n末端的外化，这使得能够实现内体逃逸。当用巴弗洛霉素a1处理细胞时，没有发生内体逃逸，所述巴弗洛霉素a1是防止细胞保持其内体ph低的h+atpase抑制剂。这说明了低ph环境用于促进内体逃逸的必要性[33]。类似于ph诱导的构象变化，温度升高可以导致vp1外化。详细观察aav衣壳的热稳定性，表明最稳定与最不稳定的aav血清型之间的衣壳熔融温度相差超过20℃。与熔融温度为70℃的最不稳定的aav2相比，aav5是熔融温度为90℃的最稳定的血清型。实验表明，vp1对热稳定性没有贡献，掩埋表面积和一级氨基酸序列也没有贡献。衣壳的x射线晶体学揭示，与aav5相比，aav2血清型是更灵活的蛋白复合物，这可以解释较低的衣壳熔融温度。但是对于热稳定性的巨大差异的清楚解释仍然悬而未决。然而，这些发现为衣壳的表征增加了重要的价值[32]。
[0185]
衣壳不仅负责保护基因组，其对细胞病毒摄取也很重要。受体介导的网格蛋白内吞作用负责摄取[38]。在两小时之后，病毒基因组已经定位在细胞核中[39]。血清型与不同的特异性受体结合，这解释了其组织嗜性[21]。腺相关病毒2主要使用硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)进入细胞。已知如成纤维细胞生长因子(fgfr)、肝细胞生长因子(hgfr)、层粘连蛋白受体和整合素αvβ1/αvβ5等四种共受体支持摄取[40]。敲除hspg导致了对aav2的感染抗性[41]。同时，fgfr1受体的敲除对宿主细胞感染没有显著影响[42]。尽管aav4与aav5仅共享53％序列同源性，但两者都需要唾液酸才能进入细胞[21]。最近的研究表明新发现的受体kiaa0319l的重要性。kiaa0319l敲除细胞对所有aav感染都有抗性[42]。然而，血清型特异性受体相互作用负责aav组织嗜性[4]。
[0186]
aav的稳定性不仅受衣壳蛋白的影响，还受基因组长度、渗透压和环境ph的影响。
基因组较小的aav具有更高的dna释放温度。载体dna与衣壳的组氨酸残基之间不断增加的相互作用可能导致在较低ph下产生稳定作用。这些在低ph下的另外的相互作用可能会保护和稳定核内体中的病毒[43]。这说明不仅衣壳结构有助于病毒稳定性，而且衣壳-基因相互作用也是至关重要的。尤其值得观看aav的基因组结构。
[0187]
wtaav包装有4.7kb的单链dna[44]。基因组含有三个开放阅读框(orf)[45]。rep orf编码负责转录调控和病毒复制的四种蛋白。不同rep蛋白的表达受剪接控制。剪接的rna编码rep68和rep40，而未剪接的rna编码rep52和rep72[46]。cap orf编码三种结构衣壳蛋白vp1、vp2、vp3[47]。组装激活蛋白(aap)位于cap基因上并且表示第三orf，因为所述组装激活蛋白用不同的阅读框转录[45]。145碱基对长的t形发夹形成位于两个基因的两侧的反向末端重复序列(itr)[48]。itr对载体复制至关重要，因为其使得能够实现dna聚合酶结合[49]。除了这些序列之外，还有三个不同的启动子定位在dna上。p40负责诱导cap基因的转录。p5和p19产生rep蛋白转录物[50]。与wtaav相比，重组aav(raav)中的rep和cap基因被治疗性转基因和相应启动子替代。而itr序列被保留[51]。
[0188]
大多数递送的aav基因组以环状形式储存在染色体外[52]。至多99.5％的载体dna可以游离基因形式存在并且不整合到宿主染色体中[53]。一小部分整合在人染色体19的特定基因座中[54]。
[0189]
以下部分阐述了用于不同aav表征的分析方法。
[0190]
2.2分析方法
[0191]
2.2.1用定量聚合酶链反应(qpcr)确定强度和剂量
[0192]
递送的病毒基因组的数量通常与治疗效果相关[56]。因此，滴度测量结果是剂量评估的关键测定[57]。存在几种用于滴度确定的方法，包含定量实时pcr、southern印迹和紫外分光光度法[55]。尽管uv分光光度法是快速且经济的方法，但其准确性是缺点。宿主细胞杂质、缓冲液和赋形剂削弱了这项技术的准确性[58]。
[0193]
使用qpcr对dna扩增子进行定量需要与双链dna结合并开始发荧光的sybr-green染料或与ssdna结合并在被dna聚合酶去除后开始发荧光的标记的taqman探针[59]。尽管其价格昂贵，但taqman方法是最常用的定量方法。其高灵敏度和特异性使其成为非常可靠的策略。而且高再现性和与taqman策略的高可比性使其成为有吸引力的方法[62]。引物二聚体和二级结构的形成可能会损害sybr-green灵敏度[60]。然而，sybr-green由于其低廉的价格和简单性而经常被使用[61]。sybr-green另外需要熔融曲线步骤来确认特异性[63]。
[0194]
由于其快速、易于处理并且具有广泛的动态范围，用qpcr进行滴度定量发展成为最常用的病毒滴度定量方法[56]。qpcr通常低估了病毒滴度，因为itr片段形成发夹结构[49]。此类结构干扰引物退火并人为降低滴度。在定量前用核酸内切酶处理样品解决了低估的问题并且另外改进了测定间可变性。针对转基因中心内的扩增区的测定受itr发夹结构造成的不准确性的影响较小[64]。
[0195]
大多数开发的qpcr策略针对特异性转基因序列[65]。然而，如cmv启动子等常用的启动子也是有希望的扩增靶标，因为其提供了更广泛的应用范围[66]。此类启动子特异性或转基因特异性qpcr测量结果的实施受到限制，因为所述测量结果需要针对携带不同转基因或启动子的载体进行新的开发。
[0196]
aurnhammer和同事开发了可以应用于所有aav2的通用itr特异性qpcr方法。引物
和探针的位置在itr序列内[65]。尽管有这些优点，但实验表明itr qpcr测量结果经常高估病毒滴度并且另外具有高实验室间可变性。系统性高估是由单切线性化质粒标准品造成的。包埋在质粒中的itr的扩增效率降低可能是高估的原因。在itr序列两端切割的质粒标准品将解决该高估[67]。qpcr的缺点是商业上可获得的标准材料仅存在于aav2和8并且定量准确性受到扩增子二级结构的影响。
[0197]
最近，被称为液滴数字pcr(ddpcr)的新pcr方法成为aav滴度确定的非常合适的替代方案[68]。顾名思义，样品被分成约20 000个液滴。这些液滴经过传统的pcr循环并且相应地被染色并用流式细胞术进行分析。含有一个或多个dna扩增子的液滴被分类为阳性液滴并且而空液滴被分类为阴性液滴。在泊松统计的帮助下，可以在不需要dna标准的情况下计算dna分子的平均数[69]。结果表明，就稳健性和测定可变性而言，ddpcr比传统的qpcr进行更好的aav滴定[70]。
[0198]
然而，分析方法、扩增序列和荧光染料不仅影响aav滴定的准确性、灵敏度和稳健性，并且对样品制备也有影响。dobnik和同事已经证明，在定量之前，通过用dna酶i温育aav样品来去除宿主细胞dna残余物显著降低了滴度[70]。
[0199]
2.2.2用tem、aex-hplc和auc确定空衣壳和完整衣壳比率
[0200]
空衣壳在aav生物合成期间产生的所有衣壳中占很大一部分[71]。所有衣壳中的至多90％可以是空的[55]。空衣壳存在的原因是未知的。据推测，如ph、离子类型和浓度等细胞培养条件将影响比率[72]。然而，空衣壳是不期望的，因为所述空衣壳不介导治疗效果。通过与细胞受体结合，所述空衣壳甚至可以减少完整病毒载体的摄取并且可能触发免疫应答[73]。在下一节中，阐述了用于定量完整衣壳和空衣壳的比率的不同方法。
[0201]
透射电子显微镜(tem)是用于定义空衣壳和完整衣壳比率的广泛使用的技术。通过用乙酸铀酰进行所谓的“阴性染色”来可视化aav。完整颗粒排除了染料并且因此出现为白点。而空衣壳吸收染料并且在其衣壳中出现黑点[74]。tem具有如最少的样品消耗和直接可视化等几个优点。然而，其耗时、昂贵、随意并且依赖于样品制备[73]。
[0202]
含有dna的衣壳具有稍微不同的表面电荷，所述表面电荷允许用阴离子交换色谱法(aex)进行顺序洗脱。衣壳洗脱可以通过荧光或uv吸光度来检测。此类测量结果允许快速、简单且高度可重复地确定完整衣壳比率和空衣壳比率[75]。高通量、qc友好性、测量结果自动化和小样品体积是阴离子交换色谱法的最大优点[76]。通常，病毒调配物含有少量的蛋白浓度，所述少量的蛋白浓度导致低信噪比。通过使用荧光检测器，可以提高信噪比。尽管此类进步，aex策略只允许粗略估计完整衣壳比率和空衣壳比率[73]。
[0203]
定量完整衣壳比率和空衣壳比率的第三种方法是分析超速离心(auc)。auc被认为是用于定义空衣壳比率和完整衣壳比率的黄金标准[76]。载体基因组的存在增加了密度并且因此使得能够以超过沉降速度从空衣壳中分离出来[73]。该方法是用于定量空衣壳和完整衣壳的非常精确和可重复的工具[77]。传统上，氯化铯密度梯度auc应用于分离空衣壳和完整衣壳，然而该方法不可扩展[71]。超速离心和计算方法的最新进展使得能够使用uv检测系统实时监测沉降和后续定量aav衣壳[78]。其高灵敏度甚至使得能够分离和定量不同基因组大小的衣壳[78]。很大的限制，特别是对于研究目的，是需要至少400μl的高体积和约5
·
10
12
vg/ml的高滴度[73]。
[0204]
2.2.3使用衣壳-elisa和nta的总衣壳的数量
[0205]
先前所提及的策略主要集中在含dna载体的定量上。缺乏用于定量aav衣壳总数的方法。衣壳-elisa是直接定量aav衣壳总数的独特方法之一[79]。血清型1、4、5和6特异性抗体可以用于进行夹心elisa以定量相应衣壳总数[80]。elisa测定的主要缺点是其价格、高可变性和与游离蛋白非特异性结合的可能性[55]。
[0206]
kondratov和同事的最近出版物使用纳米颗粒跟踪分析(nta)来计数aav衣壳总数。为了获得可检测信号，衣壳用金纳米颗粒标记[81]。
[0207]
2.2.4使用基于细胞的表达测定的载体调配物的活性和效力
[0208]
aav能够转导分裂细胞和非分裂细胞[52]。通过测量转基因表达来鉴定aav载体的转导效率[82]。这是载体调配物的重要质量属性，因为载体不稳定性和降解会导致转导减少[27]。携带编码如绿色荧光蛋白(gfp)等荧光蛋白的转基因的载体主要用于转导测定[55]。基于细胞的测定中的载体浓度以感染复数(moi)表示。moi是添加到一个细胞中的含有载体的基因组的数量[83]。
[0209]
转导实验在体内、离体或体外进行[84]。在体外实验中，选择具有高转导效率的细胞系是至关重要的，因为aav血清型具有不同的组织嗜性[4]。许多体外研究使用hek293细胞进行转导实验。这是已建立的众所周知的细胞系并且也用于aav的生物合成[85]。
[0210]
ellis和同事进行了转导研究，在所述转导研究中，他们筛选了各种不同的细胞和血清型。实验表明，许多祖细胞没有被很好地转导并且不适合于体外aav转导测定。而许多永生化人细胞系是高度转导的，具体地由aav1和6转导[84]。
[0211]
当更仔细地观察常用的血清型2(aav2)时，若干个出版物描述了u2os细胞的成功转导实验。这些骨肉瘤细胞非常容易受到aav2感染的影响。然而，仍然不知道这是由其突变还是其骨细胞样性质引起的[86]。由于其由aav2高度转导，细胞系用于鉴定早先所提及的kiaa0319l受体的实验中[42]。ellis和同事在u2os细胞中测量到98％的aav2转导效率，这与在上文所提及的其它出版物中观察到的转导效率相对应[84]。
[0212]
大多数引用的文献使用流式细胞术来定量转导效率。流式细胞术非常适合于对载体介导的基因转移进行快速且稳健的质量评估[87]。
[0213]
2.2.5用dls和nta进行颗粒大小评估
[0214]
动态光散射(dls)测量布朗运动下颗粒的光散射。由于较大的颗粒比较小的颗粒运动更慢，因此相关性更高并且反之亦然[88]。在此基础上，dls计算相应颗粒的扩散系数，从而使得能够计算流体动力学半径[89]。
[0215]
纳米跟踪分析是更新颖的方法并且基于与dls相同的原理。激光使布朗运动下的光散射可视化。数码相机跟踪、计数和测量颗粒大小。nta比dls具有更高的分辨率并且不太适合样品杂质[90]。尽管nta比dls有优势，但nta很少用于确定aav的大小。
[0216]
dls是高度灵敏的并且需要低样品体积[30]。因此，dls开始流行于病毒载体的大小和聚集测量[89]。载体聚集可能发生在纯化期间并且因此损害病毒疗法的安全性和效力特性[91]。因此，dls可以用作在载体纯化之后的质量控制工具[92]。大多数研究使用dls进行载体大小和聚集分析[90]。例如，wang和同事用dls研究了aav衣壳修改对其大小的影响[34]。其它研究使用dls研究抗体如何可以介导影响组织相互作用的载体聚集[93]。聚集也可能发生在病毒载体的储存期间。因此，至关重要的是，不仅要改进纯化策略，还要关注新的创新调配物方法以保持载体是稳定的[91]。对于该应用，dls用于评估不同赋形剂对aav2
聚集的影响。聚集测量结果揭示，当向调配物中添加足够的离子强度时，aav2聚集体的大小减小[30]。
[0217]
2.2.6用ζ电位评估胶体稳定性
[0218]
ζ电位测量颗粒的表面电位并且是用于表征纳米颗粒的胶体稳定性的重要工具[94]。ζ电位主要受ph的影响。如病毒等纳米颗粒显示出当ph接近其等电点时胶体稳定性降低。然而，离子强度以及颗粒浓度也会影响ζ电位[95]。表面电位测量可以应用于腺相关病毒的调配物开发期间。根据文献，aav2具有-9.4mv的表面电位[96]。胶体稳定性通过ζ电位的振幅来反映。低于-30mv或高于+30mv的值表示高度稳定性。大于-25mv或小于+25mv的ζ电位由于范德华、疏水相互作用以及氢键合的形成而趋向于聚集、絮凝或凝结[97]。
[0219]
2.2.7差示扫描荧光测定法作为调配物开发中的有用工具
[0220]
差示扫描荧光测定法(dsf)是能够确定蛋白的热稳定性的基于荧光的测定。分析方法检测内在或外在荧光变化。内在荧光是由如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸引起的。在温度诱导的蛋白解折叠时，氨基酸改变其位置，这导致荧光光谱的变化。同时，外在荧光是由添加的外部染料引起的[98]。由于其良好的信噪比，sypro-orange是dsf最常用的染料[99]。因此，大多数关于aav的热稳定性的实验都使用sypro-orange。所述sypro-orange与衣壳解折叠后变得可接近的疏水区结合。限制其在调配物开发中的使用的sypro-orange的缺点是其与常用表面活性剂的亲和力。与这些表面活性剂的疏水区结合导致高背景荧光[100]。因此，较新的方法利用aav衣壳的内在荧光作为sypro orange dsf的简单而精确的替代方案[101]。除了这些改进之外，低样品消耗、快速、稳健且经济高效的测量结果是dsf的主要优势[4]。
[0221]
dsf证明了自身是非常有价值的调配物开发方法。如先前所提及的，dsf能够通过测量其衣壳熔融温度来鉴定血清型[32]。最近的研究表明，dsf应用可以超越aav血清型的鉴定。例如，蛋白杂质显著影响dsf指纹并且使其能够评估aav批次纯度。同样，荧光信号强度与衣壳浓度成正比。所提及的两种应用均可以用于评估aav制备的批次间一致性[102]。
[0222]
bennett和同事进行了缓冲液筛选并且因此说明了dsf的另一种调配物相关的实施。他们测量了缓冲液如何影响aav的热稳定性。结果表明缓冲液选择以血清型特异性的方式影响衣壳的熔融温度。在aav2的情况下，与磷酸盐缓冲液相比，tris缓冲液将熔融温度升高了15℃[103]。不仅缓冲液，而且其ph也以血清型特异性的方式影响热稳定性。aav5的热稳定性随着ph的降低而成比例降低。而aav2在ph为五时具有最高热稳定性[102]。上文所提及的出版物强调了与新调配物相关的dsf应用。
[0223]
2.3项目结构和调配物研究
[0224]
项目分为两部分。在最初的几个月里，重点是aav2表征的分析方法的评估和开发。首先，修改qpcr方法以进行剂量估计。同时，开发了基于细胞的转基因测定以测试由调配物诱导的表达。进行颗粒分析并且集中于ζ电位测量结果、光遮蔽下的亚可见颗粒形成以及动态光散射。另外，建立了dsf技术并将其应用于aav2调配物。
[0225]
在项目的第二部分，在为期三个月的稳定性研究中评估了八种不同的调配物。文献中的调配物以及aav供应商提供的调配物和如luxturna等市售调配物使用补充有0.001％p188的磷酸盐缓冲液。该缓冲液用作调配物开发的起点。通过仅改变每种调配物的一个变量，开发了另外的调配物。这允许对改变的参数的影响做出结论。不同的缓冲液、ph
和赋形剂用于评估其对aav2稳定性的影响。bennett和同事已经证明ph直接影响热稳定性。因此，测试了不同的ph范围并且选择了ph为5.5、6.8和7.5。最低的ph为5.5不仅导致最高aav2热稳定性，还模拟了内体环境[103]。随后，选择了三种流行且良好确立的调配物缓冲液，所述调配物缓冲液在选定的ph范围内缓冲并适合于冷冻干燥。选择同一缓冲液浓度以允许进行头对头比较。选择20mm l-组氨酸、柠檬酸钠和磷酸钠作为aav2稳定性研究的调配物缓冲液。后者是流行的aav储存和运输缓冲液，而l-组氨酸缓冲液通常用于生物制剂的调配物。最后，选择柠檬酸钠缓冲液是因为，除其它方面外，其对aav稳定性的影响在文献中没有描述。所有调配物都补充有290mm蔗糖。需要蔗糖作为冷冻干燥的填充剂。研究测试了两种不同的表面活性剂。一方面，测试kolliphor p188作为aav调配物中常用的表面活性剂，并且另一方面，测试聚山梨醇酯80。使用的kolliphor p188和ps80浓度分别为0.001％和0.02％。这些是文献中描述的由aav供应商和市售aav调配物使用的标准表面活性剂浓度。此类低表面活性剂浓度表明足以防止与玻璃或塑料表面的非特异性结合[104]。
[0226]
该项目的主要目标是评估冷冻干燥对aav2载体的稳定性的影响。冷冻干燥将呈现当前aav储存和运输温度-80℃的有吸引力的替代方案。由于aav载体价格高，决定对四种调配物进行冷冻干燥。尽管已知aav是稳定的，但其趋向于聚集。
[0227]
wright和同事提出了负责聚集的不同机制。在滴度大于10
14
vg/ml的高滴度调配物中，对称的衣壳结构和带相反电荷的衣壳袋之间的相互作用降低了aav溶解度。由于在用核酸酶处理的aav2样品中观察到较少的载体聚集，他们提出残留宿主细胞dna片段通过静电相互作用与aav2衣壳结合并介导聚集。描述了离子强度以防止此类载体聚集体[30]。因为该研究的重点是冷冻干燥新颖的基于非盐的赋形剂解决了聚集的问题并且同时对可冷冻干燥进行评估。
[0228]
一种调配物含有0.2mg/ml的透明质酸钠。文献中尚未描述透明质酸在aav调配物开发中的用途。另一种调配物使用1％人血清白蛋白。白蛋白可能与aav衣壳相互作用并增加其转导效率[105]。选择这些赋形剂是因为其不干扰冷冻干燥。表2总结了所有调配物组合物。因为aav2载体价格非常高，所以决定使用最小的滴度，所述最小的滴度仍然使得能够实施在本公开的第一部分中评估的所有选择的分析方法。因此，用1
·
10
11
vg/ml的aav2滴度进行调配物研究。
[0229][0230]
表2：用于调配物稳定性研究的调配物组合物，所有调配物针对1
·
10
11
vg/ml的滴度。(*)另外冷冻干燥的调配物。
[0231]
进行实验以比较不同温度暴露对aav2的稳定性的影响。因此，研究中添加了宽温
biomedical))、人白蛋白(西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich))、ph计780(瑞士万通公司(metrohm))、2r/13mm肖特小瓶sl/nbb管状fiolax透明i型(肖特公司(schott))、13mm血清灰色fluorotec活塞wes(龙沙公司(lonza)dps)、13mm冻干灰色flurotec活塞wes(龙沙公司dps)、whatman pursdisc pvdf注射器过滤器，0.2μm，13mm(通用电气医疗集团(ge healthcare))
[0244]
冻干和卡尔-费歇尔滴定(karl-fisher titration)：
[0245]
lyostar 3(sp科技公司(sp scientific))、安全柜(a1安全技术)、卡尔-费歇尔滴定仪(metrohm 3.0)
[0246]
qpcr：
[0247]
1000x aav标准品(virovek公司(virovek inc))、aav2-cmv-gfp(virovek公司)、正向引物100μm(西格玛-奥德里奇公司)、反向引物100μm(西格玛-奥德里奇公司)、powerup sybr green master mix(应用生物系统公司(appliedbiosystems))、无核酸酶的水(赛默飞世尔公司(thermofisher))、dna酶i、无rnase(赛默飞世尔公司)、10xdna酶i缓冲液+用于dna酶i的mgcl2(赛默飞世尔公司)、50mm edta(赛默飞世尔公司)、thermoblock(艾本德公司(eppendorf))、quantstudio 5(应用生物系统公司)、microamp enduraplate光学96孔板(应用生物系统公司)、光学粘性盖膜(应用生物系统公司)、rnase away(分子生物学产物)
[0248]
tem：
[0249]
透射电子显微镜飞利浦cm100(飞利浦(philips))、2％乙酸铀酰(科学服务)、铜网格(光栅光学)、aav2-cmv-gfp(virovek公司)
[0250]
dls/madls和ζ电位：
[0251]
zetasizer ultra(马尔文仪器公司(malvern instruments))、高精度石英单元10
×
10mm光路(豪玛分析公司(hellma analytics))、纳米球大小标准品50nm(赛默科技公司(thermoscientific))、纳米球大小标准品60nm(赛默科技公司)、纳米球大小标准品100nm(赛默科技公司)、dts 1070比色皿(马尔文仪器公司)、ζ电位转移标准品dts1235(马尔文帕纳科公司(malvern panalytical))
[0252]
dsf：
[0253]
optim unit(非链实验室(unchained labs))、sybr-gold核酸染色剂(应用生物系统公司)、sypro-orange(西格玛-奥德里奇公司)
[0254]
u2os细胞的扩增和传代培养：
[0255]
u2os-htb-96(atcc)、mccoy的5a培养基(吉博科公司(gibco))、胎牛血清(吉博科公司)、青霉素-链霉素(吉博科公司)、pbs(吉博科公司)、nunc easy烧瓶75、175和225cm
2 nuclon deta表面(赛默科技公司)、0.25％胰蛋白酶-edta(1x)(吉博科公司)、co2温育箱(binder公司(binder))、via1-cassette(chemometec公司(chemometec))、nucleocounter nc-200(chemometec公司)、等温v1500-ab系列(蓝铂公司(labtec))、振荡水浴gfl 1086(faust)、离心机5920r(艾本德公司)
[0256]
细胞活力测定：
[0257]
alamarblue细胞活力试剂(英杰公司(invitrogen))、nunc f96微孔黑色(赛默科技公司)、via1-cassette(chemometec公司)、nucleocounter nc-200(chemometec公司)、spectramax id3(分子装置公司(molecular devices))、mccoy的5a培养基(吉博科公司)、
co2温育箱(binder公司)
[0258]
转基因表达测定：
[0259]
rgfp 1mg/ml(罗氏公司(roche))、nunc f96微孔黑色(赛默科技公司)、via1-cassette(chemometec公司)、nucleocounter nc-200(chemometec公司)、spectramax id3(分子装置公司)、mccoy的5a培养基(吉博科公司)、co2温育箱(binder公司)、u2os-htb-96(atcc)、aav2-cmv-gfp(virovek公司)、pbs(吉博科公司)
[0260]
过滤实验：
[0261]
13mm puradisc注射器过滤器，0.2μm，pvdf(通用电气医疗集团)、10mm anotop注射器过滤器，0.2μm pvdf(通用电气医疗集团)、13mm millex注射器过滤器，0.2μm，pvdf(默克密理博(merck millipore))、quantstudio 5(应用生物系统公司)和所有上文所提及的qpcr设备。
[0262]
4方法
[0263]
4.1 aav2表征的分析方法的评估和开发
[0264]
大多数方法在应用于调配物研究之前都经过了测试。在分析方法的评估和开发期间，应该评估方法是否适用于aav2以及是否需要修改。在该研究期间，对如qpcr等一些方法进行充分修改并且对如gfp表达测定等其它方法进行最近开发。作为分析方法评估和开发的一部分进行的实验将在下一节中进一步阐述。
[0265]
4.1.1用定量聚合酶链反应(qpcr)对aav2反向末端重复序列(itr)进行定量
[0266]
使用这种通用的itr定量方法是因为其在文献中有很好的描述并被aav2供应商频繁使用。这种通用的aav2方法的优化和建立允许进行转基因非依赖性aav2滴定，所述滴定可以应用于各种不同的aav2项目。为了滴度定量，最初由aurnhammer和同事开发的通用的aav2 itr qpcr被进一步修改[65]。通过用更方便和更具成本效益的sybr-green方法替代taqman方法对qpcr方法进行修改。这种修改基于来自addgene的可公开访问的方案。基于sybr-green的aav2-itr qpcr进一步补充有dna酶i消化步骤，以及衣壳开放步骤。进行了有和没有这些消化步骤和开放步骤的实验以评估这些处理的影响。
[0267]
以下序列用作引物[65]：
[0268]
正向引物(fw)：5'-ggaacccctagtgatggagtt-3'
[0269]
反向引物(rw)：5'-cggcctcagtgagcga-3'
[0270]
4.1.2 aav2滴定程序
[0271]
最初，用购买的线性化质粒标准品制备稀释系列。所得标准曲线在滴定期间用作定量工具。用无核酸酶的水进行五次稀释。将获得的浓度为1.0
·
108个dna扩增子/μl的1000x标准品稀释到所需浓度(1
·
107个、1
·
106个、1
·
105个、1
·
104个、1
·
103个dna扩增子/μl)。在所有qpcr实验中，标准曲线以这种方式制备。
[0272]
随后，用或不用dna酶i消化和衣壳开放步骤制备aav样品。在调配物研究1和2期间的所有拉点分析都含有此类消化和开放步骤。在这些实验之前，用经处理的样品制备未经处理的样品以检测此类处理的影响。通过将5μl滴度为1
·
10
11
vg/ml的样品与38μl无核酸酶的水、5μl含mgcl2的10x dnase反应缓冲液和2μl dna酶i(1u/μl)混合来制备包含此类处理的样品。将混合物在37℃下温育40分钟。在温育之后，向混合物中掺入10μl 50mm edta溶液并且将样品加热到65℃10分钟以灭活dna酶i。然后在95℃下打开衣壳30分钟并相应地进行
稀释。然后，将这些样品在无核酸酶的水中稀释(1:10、1:200、1:1000和1:5000)。没有开放也没有用dna酶i消化的样品与消化和开放的样品相同直接稀释。qpcr板用5μl每种样品和一式两份的标准稀释液填充。另外，用5μl无核酸酶的水填充两个孔作为无模板对照(ntc)。密封板并制备主混合物。用于一个孔的主混合物配方由4.7μl无核酸酶的水、10μl加电sybr-green主混合物和0.15μl 100μm正向和反向引物组成。多通道移液管用于向每个孔中添加15μl主混合物。用光学粘性盖膜密封板，以3000rpm离心两分钟并转移到quantstudio 5。调整pcr运行特性以满足使用的主混合物的要求(50℃2分钟，98℃3分钟，40x 98℃15秒，然后58℃30秒)。用三步熔融曲线(95℃15秒，60℃1分钟和95℃15秒)完成分析。quantstudio设计和分析软件用于数据分析。
[0273]
4.1.3 qpcr的aav2样品处理的评估
[0274]
第一实验表征了衣壳开放和dna酶i消化步骤的影响。首先，制备含有0.001％p188的20mm磷酸盐缓冲液。该缓冲液用于制造1.2
·
10
11
vg/ml aav2悬浮液。三个艾本德管各自提供有5μl该悬浮液。将45μl无核酸酶的水加入到第一等分试样中。其它等分试样各自提供有38μl无核酸酶的水、5μl含mgcl2的10x dnase反应缓冲液和2μl dna酶i(1u/μl)。之后，如上文所描述的开放两个等分试样的衣壳。对仅用无核酸酶的水稀释的等分试样和含有dna酶i的两个等分试样之一应用开放程序。不开放含有dna酶i的另一个等分试样的衣壳。在开放之后，根据上文所提及的qpcr程序稀释并扩增样品。
[0275]
4.1.4 aav2对艾本德管的粘附
[0276]
因为所有的系列稀释在艾本德管中进行的并且许多实验在中间步骤中使用艾本德管，所以进行了粘附实验。制备在含有0.001％p188的ph 7.4磷酸盐缓冲液中滴度为1
·
10
10
vg/ml的aav2调配物。制备500μl该调配物并分成两个等分试样。将每个等分试样储存在1.5ml艾本德管中24小时。在24小时之后，通过用100μl的体积上下移液十次来充分混合一个等分试样，而另一个等分试样根本不混合。对两个等分试样进行qpcr，包含消化和衣壳开放步骤。
[0277]
4.1.5用tem对完整衣壳和空衣壳进行定量
[0278]
决定使用tem来确定完整衣壳和空衣壳比率。与auc和aex-hplc相比，tem需要更小的体积和滴度。尽管auc被认为是用于定量完整衣壳和空衣壳的黄金标准，但是若干个出版物已经表明用tem的定量与用auc获得的结果直接相关。由于只对aav2储备悬浮液的完整衣壳和空衣壳进行了定量，因此不需要大量时间来实施如aex-hplc等高通量方法。透射电子显微镜(tem)和相关的样品制备在巴塞尔大学(university of basel)的纳米成像实验室中在飞利浦cm100上进行。用2％乙酸铀酰进行阴性染色使得能够区分空aav衣壳和完整aav衣壳。在铜网格上添加病毒之前，需要对网格进行辉光放电。铜网格被放置在放电室中。在铜网格上安装圆顶，小心地关闭针阀并开启真空泵。随后，将电源调到50伏并且将铜网格辉光放电30秒。随后在铜网格上对样品进行温育、洗涤和染色。在该项目期间，测试了两种不同的样品制备。在第一实验中，应用了纳米成像实验室的aav阴性染色的标准方案。因此，将铜网格与10μl 1
·
10
10
vg/ml样品一起温育一分钟。在温育之后，用50μl ddh2o洗涤网格三次。在每个洗涤步骤之后，使用滤纸去除水。阴性染色是通过将铜网格与5μl 2％乙酸铀酰溶液一起温育十秒钟两次来实现的。使用该样品制备仅检测到少数衣壳。这就是修改和重复样品制备程序的原因。在第二次染色尝试中，与第一次相同地进行辉光放电。然后将放电
的铜网格与15μl 1
·
10
11
vg/ml样品一起温育。此后，仅进行一次用50μl ddh2o的洗涤步骤。用2％乙酸铀酰的染色步骤的数量保持与上述相同。为了定量空衣壳和完整衣壳比率，随机拍摄了11张照片。一张照片在20kv的电压下拍摄并且另一张照片在37kv的电压下拍摄。另外九张照片在11kv的电压下拍摄。
[0279]
4.1.6用dls和madls进行颗粒和聚集分析
[0280]
dls用于监测纳米范围内的颗粒大小分布。这是用于测量和定量病毒载体聚集的现有技术。其小样品消耗使其成为有吸引力的方法。如先前所描述的，使用的滴度为1
·
10
11
vg/ml。该滴度与约0.62μg/ml的非常低的蛋白浓度相对应。在方法评估期间，研究了是否可以检测到这些浓度。所有的dls测量在来自马尔文仪器公司的zetasizer ultra上的小体积、高精度的zen 2112石英比色皿中进行。首先，用乳胶珠进行系统合适性测试(sst)。制备10mm nacl溶液，对其进行无菌过滤并等分到四个无菌15ml管中。每个管提供有两滴50、61或100nm的乳胶珠标准品。通过轻轻倒置烧瓶来小心地将悬浮液均匀化。高精度zen2112石英比色皿中提供有50μl每种标准品。选择折射率为1.59并且吸收率为0.01的聚苯乙烯乳胶珠进行sst。选择水作为分散剂，所述分散剂的折射率为1.33并且粘度为0.8872mpas。50nm乳胶珠标准品的z平均值的可接受标准是48nm
±
3nm。对于61nm标准品，所述可接受标准是61nm
±
4nm并且对于100nm标准品，所述可接受标准是
±
8nm。在将样品装载到zen2112型低体积石英比色皿中之前，用水和乙醇冲洗。加压的无颗粒空气用于干燥比色皿。然后将aav2载体在补充有0.001％p188的ph 7.4的pbs中稀释到1
·
10
11
vg/ml的滴度。用50μl的样品填充比色皿。使用aav2设置进行测量。这种测量方法包括1.45的折射率和0.001的吸收率。选择水作为分散剂，所述分散剂的折射率为1.33并且粘度为0.8872mpas。将温度设置为25℃并且将平衡时间设置为120秒。将分散剂散射设置为75kcps。每个样品通过三次反向散射表征。对所有调配物进行三次madls测量。在储存在冻融循环、搅拌应力、40℃下两周并且储存在2-8℃下的冷冻干燥的样品一个月之后，也对t0时的安慰剂进行madls测量。在分析之后，将样品转移到艾本德管中并储存在2-8℃下用于进一步分析。
[0281]
4.1.7ζ电位测量结果
[0282]
在来自马尔文仪器公司的zetasizer ultra上用扩散屏障法在dts 1070比色皿中测量ζ电位。通过用-42mv
±
4.2mvζ电位转移标准品填充dts 1070聚苯乙烯比色皿来进行系统合适性测试(sst)。将两个热接触板附接到比色皿上。标准品用聚苯乙烯乳胶珠的仪器设置测量，用1.59的折射率和0.01的吸收率测量。选择水作为分散剂。在通过系统合适性测试之后，用水冲洗比色皿并用补充有0.001％p188的ph 7.4的pbs填充。使用扩散屏障法(dbm)将样品添加到比色皿中。该方法专为低样品体积开发。借助凝胶电泳加载头，将130μl样品加载到比色皿底部。使用的aav2调配物是在补充有0.001％p188的ph 7.4的pbs中制备的并且滴度为1
·
10
11
vg/ml。将导热板附接到比色皿上。用蛋白仪器设置测量样品，所述蛋白的折射率为1.45并且吸收率为0.001。选择水作为分散剂。所有测量重复三次。之后，用水和乙醇冲洗比色皿并重复使用至少两次。
[0283]
4.1.8细胞系扩增
[0284]
接收细胞系后制备细胞培养基。mccoy的5a培养基提供有胎牛血清(fbs)和青霉素-链霉素(pen/strep)以获得含有10％fbs和1％pen/strep的mccoy的5a培养基的最终浓度。
[0285]
从atcc获得了一个含有约1
·
106个u2os-htb-96细胞的冷冻管。将细胞解冻并悬浮于9ml预热的培养基中。将管在136rcf下离心5分钟，并抽吸培养基。之后，将细胞沉淀重悬于16ml预热的培养基中并接种于75cm2的培养烧瓶中。在约90％汇合之后，悬浮贴壁细胞并提供8ml预热的培养基。在136rcf下离心5分钟之后，抽吸上清液并将沉淀重悬于4ml培养基中。两个含有48ml预热的培养基的225cm2的培养烧瓶各提供有2ml悬浮液并储存在37℃、5％co2下。在达到90％汇合之后，悬浮来自一个培养烧瓶的细胞并对其进行计数。在洗涤细胞之后，在补充有5％(v/v)dmso的培养基中制备1.2
·
106个细胞/ml的细胞悬浮液(传代2)。七个冷冻管提供有1ml悬浮液(传代2)并在液态氮中冷冻。通过将来自另一个烧瓶的细胞悬浮于4ml培养基中并将1ml悬浮液转移到四个175cm2的培养烧瓶中来进一步扩增所述细胞。在90％汇合时，采集细胞，对所述细胞进行计数并将其重悬于补充有5％(v/v)dmso的培养基中。将另外30个u2os浓度为1.6
·
106个细胞/ml(传代3)的冷冻管在液态氮中冷冻。
[0286]
4.1.9传代培养程序：
[0287]
传代培养总是在75cm2烧瓶中进行。抽吸旧培养基并用12ml预热的pbs洗涤贴壁细胞。在抽吸磷酸盐缓冲液之后，向烧瓶中添加2ml 0.25％胰蛋白酶、0.03％edta溶液并将烧瓶在37℃下温育三分钟直到细胞分离。将分离的细胞悬浮于8ml培养基中并在136rcf下离心五分钟。抽吸上清液并且将细胞沉淀重悬于5ml培养基中。然后填充有16ml预热的培养基的新的75cm2细胞培养烧瓶提供有1ml该悬浮液并储存在37℃和5％co2下的温育箱中。如果细胞达到90％汇合，那么开始传代培养。将每个细胞系传代培养直到其达到传代30。
[0288]
4.1.10细胞系建立和细胞活力测定：
[0289]
在基于细胞的转基因表达测定之前，通过进行alamarblue细胞活力测定来建立细胞系。进行该测定以获得关于理想接种密度、所得生长率和细胞活力的信息。采集并悬浮u2os细胞。制备浓度为8.2
·
106个细胞/ml的储备悬浮液。用不同的细胞浓度(4.1
·
105、2.0
·
105、1.0
·
105、5.0
·
104、2.5
·
104和1.25
·
104个细胞/ml)制备稀释系列。将精确的100μl每种悬浮液添加到96孔板中以获得4.0
·
104、2.0
·
104、1.0
·
104、5000、2500和1250个细胞/孔(3906、7813、1.56
·
104、3.13
·
104、6.25
·
104、1.3
·
105、2.63
·
105个细胞/cm2)的细胞密度。对八个复制品的每种密度进行电镀。将板储存在37℃、5％co2下过夜。在温育24小时之后，通过抽吸旧培养基并用180μl新鲜培养基替代来进行第一次细胞活力测定。添加20μl alamarblue试剂以获得10％(v/v)alamarblue-培养基溶液。将板在37℃和5％co2下温育两小时45分钟。在温育之后，将来自每个孔的100ul上清液转移到黑色96孔板中。在550nm激发和590nm发射下测量荧光。为了获得可比较的结果，将spectramax id3内的光电倍增管(pmt)设置为低。在该测量之后，抽吸残留上清液并用150μl培养基替代。连续七天重复细胞活力测定。在第八天，通过用70％异丙醇替代培养基来杀伤细胞。在温育五分钟之后，再次用培养基替代异丙醇并如上文所描述的进行测定。该测量作为阴性对照以表明只有用活细胞才能获得荧光。
[0290]
4.1.11转基因表达测定开发
[0291]
大多数公开的文献使用荧光激活的细胞分选(facs)装置或共聚焦显微镜来定量经转导的细胞和转基因表达细胞。因为facs分选仪和共聚焦显微镜都不可用，所以开发了使用读板仪的基于细胞的表达测定。该测定的缺点是不能定量表达gfp的细胞的准确数量。因为主要关注的是与t0时的起始表达相比，调配物诱导的转基因表达如何表现，所以这些
限制是可接受的。该读板仪测定提供了高通量、成本效益和内部可用性。
[0292]
在深入的文献检索之后，贴壁u2os-htb-96细胞(bsl-1)被提名为用于开发gfp表达测定的细胞系。尽管文献主要描述了用于此类实验的hek293细胞，但有意不使用所述细胞，因为所述细胞不能被aav2很好地转导并且不是强粘附的。两个特性对于成功的读板仪测定是必需的并且由u2os细胞实现。因为担心信号强度过低，所以在对细胞活力不产生负面影响的情况下将每个孔电镀尽可能多的细胞。10 000个细胞/孔的初始细胞密度似乎适合于测定，因为在细胞活力下降之前可以监测gfp表达四天。该细胞数也使得工作能够在复制品中进行。
[0293]
首先，四个孔各自提供有100μl 1.0
·
105个细胞/ml细胞悬浮液(1.0
·
104个细胞/孔)。在接种之后，直接将100μl 1
·
10
10
vg/ml病毒悬浮液添加到一个孔中，使得感染复数(moi)为105并将100μl 1
·
10
11
vg/ml病毒悬浮液添加到另一个孔中，使得moi为105。另外两个孔用作空白并且因此提供有100μl pbs。将该板在37℃、5％co2下温育。在24、48、72、96小时之后，分别用488nm和520nm的激发和发射波长测量荧光。四天内没有更新或更换培养基。在96小时测量之后，抽吸培养基并用100μl pbs替代并且重复荧光测量。在解释先前实验的结果之后，进行波长扫描以确定gfp的激发和发射波长。在pbs(10μg/ml、1μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml)中以系列稀释制备1mg/ml重组gfp溶液。在黑色96孔板中进行波长扫描。每个孔提供有100μl相应稀释液。在确定理想的激发和发射波长并优化程序之后，进行moi筛选。进行该筛选以获得关于如何在调配物研究内设计gfp表达测定的信息。目标是定义导致最低可检测荧光的moi以及表征读板仪检测由不同moi引起的荧光差异的能力。实验应另外强调温育时间对gfp表达的影响。用不同的滴度制备四种不同的病毒样品。样品的滴度为1
·
10
11
vg/ml、1
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10
10
vg/ml、1
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109vg/ml、1
·
108vg/ml。所有稀释液用含有0.001％p188的20mm磷酸钠缓冲液，ph 7.4制成。采集并悬浮u2os-htb-96细胞。将悬浮液稀释到1
·
105vg/ml的浓度。将100μl细胞悬浮液接种到孔中以达到1
·
104个细胞/孔的细胞密度。新鲜接种的细胞立即补充100μl相应病毒稀释液，这使得moi分别为106、105、104和103vg/ml。测量五个复制品的每种病毒浓度。对于每个复制品孔，还准备了对照孔。用100μl细胞悬浮液填充对照孔。替代添加病毒，添加100μl含有0.001％p188的20mm磷酸钠缓冲液，ph 7.4。在感染之后，将板储存在37℃、5％co2的温育箱中。在24、48、72、96小时的每次荧光测量之前，抽吸培养基并用100μl磷酸盐缓冲液替代。在spectramax id3上在460nm激发和515nm发射下进行测量。在测量之后，再次用150μl培养基替代磷酸盐缓冲液。在调配物研究1和调配物研究2期间的拉点分析以105vg/细胞的moi进行并比较在72小时之后的读数。
[0294]
4.2调配物研究1
[0295]
缓冲液缓冲液稳定剂表面活性剂ph缓冲液120mm l-组氨酸290mm蔗糖0.02％ps805.5缓冲液220mm l-组氨酸290mm蔗糖0.02％ps806.8缓冲液320mm柠檬酸钠290mm蔗糖0.02％ps806.8缓冲液420mm磷酸钠290mm蔗糖0.02％ps806.8缓冲液520mm磷酸钠290mm蔗糖0.02％ps807.5缓冲液620mm磷酸钠290mm蔗糖-6.8缓冲液720mm磷酸钠290mm蔗糖-6.8
9703+对所有样品进行分析。
[0302]
4.4另外的实验
[0303]
进行了另外的实验以评估aav2载体在调配物研究1中混合之后显示低回收率的原因。设计实验以观察载体聚集或对无菌过滤膜的亲和力是否是载体损失的原因。
[0304]
还通过使用sypro-orange或sybr-gold测试了dsf是否可以应用于滴度为1.0
·
10
11
vg/ml的低浓度调配物。
[0305]
4.4.1 150mm nacl对aav2无菌过滤的影响
[0306]
为了查明在调配物研究1期间的滴度损失是否是过滤器特有的，将13mm puradisc0.2μm pvdf与13mm millex 0.2μm pvdf和10mm anotop 0.2μm pvdf过滤器进行比较。在联系通用电气医疗集团之后，建议使用anotop过滤器过滤病毒材料。这两种不同大小的过滤器允许比较在过滤之后过滤器表面积对滴度回收率的影响。首先，制备100ml 20mm l-组氨酸，290mm蔗糖，0.02％ps80，ph 6.8的溶液。取两份10ml等分试样并将88mg氯化钠(nacl)添加到一份等分试样中，使得最终nacl浓度为150mm。将2985μl从每个等分试样转移到两个艾本德管中。同时，将购买的滴度为2.19
·
10
13
vg/ml的病毒储备解冻。每个缓冲液等分试样提供有15μl aav2储备。通过上下移液充分混合样品。之后，过滤不含任何氯化钠的调配物。通过puradisc、anotop和millex无菌过滤器进行过滤。通过每个过滤器过滤1ml不含任何氯化钠的调配物。将同一程序应用于含有150mm氯化钠的调配物。之后，使用上文所描述的标准qpcr方案确定病毒滴度。另外，对不同样品进行dls测量。
[0307]
4.4.2用sypro-orange和sybr-gold进行热偏移测定
[0308]
在来自非链实验室的optim系统上进行差示扫描荧光测定法(dsf)测量。实验利用sypro-orange和sybr-gold来增强信号强度。在该实验中比较sypro-orange和sybr-gold染料以及不同的浓度。sypro-orange和sybr-gold的购买浓度分别为5000x和10 000x。对于实验，将染料在20mm l-组氨酸、290mm蔗糖、0.02％聚山梨醇酯80、ph 6.8中稀释。为sypro-orange以及为sybr-gold制备了三种染料储备。生产了三μl 10x、50x和100x储备并将其掺入到27μl 1.0
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11
vg/ml aav2样品中。这使得最终染料浓度为1x、5x或10x。对于每种染料浓度，制备相同浓度的缓冲液对照。将9μl染色的aav2样品添加到dsf毛细管中。使用sypro-orange optim设置对每个样品进行三次测量。将开始温度和结束温度分别设置为15℃和95℃。将加热速率设置为0.33℃/分钟。
[0309]
5结果
[0310]
5.1 aav2表征的分析方法的评估和开发的结果
[0311]
5.1.1 dna酶i消化和热衣壳开放步骤对病毒滴度的影响
[0312]
qpcr方法评估和修改的目标是获得关于dna酶i消化和热衣壳开放对滴度定量的影响的信息。图1展示了通过三种不同处理获得的滴度。当样品在定量之前开放时，获得最高滴度。添加此类热衣壳开放步骤产生1.66
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11
vg/ml的滴度。执行该程序导致高估供应商给出的滴度。添加dna酶i消化步骤导致滴度下降到1.07
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10
11
vg/ml。当仅进行dna酶i消化步骤，而随后不进行任何热衣壳开放时，滴度甚至下降到7.74
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10
10
vg/ml。从未消化的样品中减去在消化之后产生的滴度表明，在aav样品中存在约5.9
·
109个宿主细胞dna片段/每ml。该实验表明，在定量之前的dna酶i处理显著降低了滴度，而衣壳开放步骤增加了滴度。两种样品处理的组合使得精确的滴度确定与供应商给出的滴度相比只有很小的偏差。
基于这一结果，在调配物研究期间的滴度定量应用了dna酶i消化和热衣壳开放步骤。参见图1。
[0313]
5.1.2 aav2对艾本德管的粘附
[0314]
在拉点分析期间，aav2调配物经常储存在艾本德管中。因此，进行实验以确定储存24小时后aav2对艾本德管的粘附。图2展示了在艾本德管中储存24小时之后混合样品与非混合样品的aav2滴度。在定量之前的样品混合产生2.9
·
109vg/ml的滴度并且是非混合样品的两倍，测得所述非混合样品的滴度为1.5
·
109vg/ml。数据表明充分混合能够增加滴度。两种测量低估了aav2供应商给出的滴度。基于这些结果，在以下实验中使用低结合管并且在使用之前将样品充分混合。参见图2。
[0315]
5.1.3用透射电子显微镜观察完整衣壳和空衣壳比率
[0316]
透射电子显微镜用于确定完整aav2衣壳和空aav2衣壳的比率。第一衣壳可视化利用了巴塞尔大学的纳米成像实验室的标准方案和滴度为1.0
·
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vg/ml的样品。如图(3a)所示，可见衣壳数量不足。此类少量衣壳不允许对完整衣壳和空衣壳进行定量。基于该结果，修改了样品制备并使用1.0
·
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11
vg/ml的更高滴度。如图(3b)所示，该方法产生了更多数量的染色的衣壳。完整衣壳看起来像白点，因为乙酸铀酰不能进入衣壳。然而，空衣壳在衣壳的中间含有黑点，这是由染料进入衣壳引起的。手动计数11张照片上的所有衣壳(参见图25)使得能够估计完整衣壳和空衣壳的数量。样品含有58.3％的完整衣壳和41.6％的空衣壳。两个实验的比较揭示了需要至少1.0
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vg/ml的滴度和仅具有一个洗涤步骤的修改的染色方案来使足够的衣壳可视化用于定量。
[0317]
5.1.4 aav2样品的dls和madls
[0318]
aav2的大小为20-25nm。由于dls测量了流体动力学半径，预计峰在20-30nm之间。如图4所示，反向散射测量结果(4a)示出存在两种颗粒物质。获得了预计大小范围内的一种颗粒大小分布以及一种约640nm的大得多的物质(参见附录表7)。643nm的z平均值证实了存在较大颗粒物质。多分散性指数测量结果也表明样品是多分散的。作为方法评估的一部分，进行了另外的madls以测试是否也可以用该测量获得结果。如(4c)所示，反向散射能够检测两种颗粒物质。侧向散射(4d)证实了通过反向散射获得的颗粒分布。然而，前向散射(4e)仅检测到500nm处的一个峰。madls(4f)内的反向散射和侧向散射重合，同时，前向散射不能检测约20-30nm左右的颗粒物质。基于检测20-30nm之间的颗粒物质的能力，在调配物研究期间使用反向散射来表征aav2调配物。
[0319]
5.1.5 aav2的ζ电位测量结果
[0320]
在方法评估期间，测试了当实施扩散屏障法并使用130μl滴度为1.0
·
10
11
vg/ml的aav2样品时是否可能获得ζ电位。图(5a)中作为数据质量指标呈现的相位图测量结果揭示，参考频率与测量的节拍频率之间的相位随时间的变化存在明显差异。这表明当储存在补充有0.001％p188的ph 7.4的pbs中时，可以测量aav2载体的ζ电位。在方法评估期间进行的测量重复三次并且所得平均ζ电位为-9.46mv。
[0321]
5.1.6用alamarblue进行u2os-htb-96细胞活力测定
[0322]
该活力测定测试了不同的接种密度如何影响生长率和细胞活力。如图6所示，测定表明生长率是细胞密度依赖性的。10 000个细胞/孔的细胞接种密度用红色突出，因为该密度后来用于转基因测定的开发。荧光强度表明生长率依赖于电镀的细胞密度。较小的接种
密度导致较小的初始荧光强度。1.3
·
105个细胞/cm2的最高初始密度在四至五天后达到最大细胞密度。6.25
·
104个细胞/cm2和3.13
·
104个细胞/cm2的较小密度在同一时间量之后达到同一密度。该结果说明，具有最高接种细胞密度的生长率与较低密度相比较小。7813和1.56
·
104个细胞/cm2的接种密度在五天之后达到平台期并且最小接种密度在六天之后达到最大细胞密度。然而，在达到最大细胞密度之后，所有孔在7天之后记录了细胞活力的下降。为了确定荧光是由细胞引起的，而不是由培养基的组分引起的，在八天之后杀伤细胞并作为阴性对照。添加alamarblue没有产生荧光，表明需要活细胞来获得荧光信号。
[0323]
5.1.7基于u2os细胞的gfp表达测定的开发
[0324]
首次开发的转基因表达测定的结果在图7中呈现。图示的荧光强度已经减去了仅含有细胞、培养基和pbs的空白。如图7所示，结果表明两种moi在36小时之后已经产生可检测的荧光信号。荧光信号随时间增加并在72小时之后达到其最大值。信号强度不仅是时间依赖性的，而且也是moi依赖性的。在本公开的过程期间，术语moi总是用作添加到一个细胞中的病毒基因组的数量。106vg/细胞的moi产生比105vg/细胞的moi更高的荧光。在72小时之后，由106vg/细胞的moi引起的荧光是由105vg/细胞的moi引起的荧光的两倍。在96小时之后，荧光减弱。在96小时用pbs替代培养基引起荧光信号的扩增。与用培养基温育的96小时的荧光强度相比，用106vg/细胞的moi温育的孔的pbs荧光几乎增加了四倍，而用105vg/细胞的moi温育的孔的荧光几乎增加了12倍。基于该结果，用于确定gfp表达的荧光测量随后以pbs形式进行测量。
[0325]
5.1.7.1重组gfp的波长扫描和moi滴定
[0326]
当使用460nm的激发波长和515nm的发射波长时，rgfp波长扫描揭示rgfp的最大荧光强度。之后，进行不同moi的滴定以找出读板仪是否能够区分由不同moi引起的表达以及检测限值的位置。图8展示了moi筛选的结果。清楚地示出了转导的u2os细胞的moi依赖性荧光强度。moi越高，表达越高。此外，gfp表达随时间增加。最大荧光增加出现在48小时与72小时之间。同时，在72与96小时之间仅观察到少量荧光增加。在七天之后的荧光读数揭示表达显著下降。103vg/细胞的moi在48小时之后产生可测量的荧光强度，但是没有产生显著的表达变化。基于这些结果，在调配物研究期间，以105vg/细胞的moi进行转基因表达测定并且在72小时之后的读数用于比较。
[0327]
5.2调配物研究1
[0328]
5.2.1 t0时调配物的aav2滴度确定
[0329]
在第一调配物研究中，进行了t0分析，包括用qpcr进行aav2滴定以及gfp转基因表达测定。在混合期间，目标滴度为1
·
10
11
vg/ml。图9中展示了qpcr aav2滴定结果并揭示所有八种调配物的滴度比目标滴度小得多。尽管调配物之间的滴度存在可变性，但所有滴度在9.86
·
107vg/ml至8.13
·
108vg/ml的范围内。
[0330]
5.2.2调配物在t0时的gfp表达
[0331]
图10总结了来自gfp转基因测定的数据。显示的数据已经减去了空白，这解释了一些阴性荧光信号。这些结果展示调配物6和7诱导了高gfp表达。同时，所有其它调配物甚至在72小时之后也没有产生可测量的gfp表达。调配物3、4、5、8的荧光强度仅达到5.7
·
105或更低的荧光。此后，调配物一和二没有显示出可检测的荧光。当添加从aav2滴定获得的数据时，结果表明在所有调配物中，gfp表达是在moi为约103vg/细胞的情况下完成的。尽管调配
物6引起高得多的荧光强度，但moi与其它调配物相比甚至更小。基于低转基因表达和低aav2滴度，决定终止该研究。
[0332]
5.3调配物研究2的结果
[0333]
5.3.1冷冻干燥和残留水分含量
[0334]
冻干饼的视觉检查表明32个饼中的五个在冻干饼中表现出较小的裂纹。图11中示出了冻干饼的照片。用卡尔费歇尔滴定确定三个安慰剂小瓶中的残留水分含量。分析揭示残留水分含量为1.11％、1.13％和1.23％。
[0335]
5.3.2调配物研究2中所有aav2滴度确定的总结
[0336]
在每个拉点期间，使用qpcr确定所有调配物的滴度。图12中展示了所有qpcr结果的总结。在混合期间，所有调配物的目标滴度为1
·
10
11
vg/ml。定量表明，调配物1、2、4和5在不同拉点测量结果之间具有低滴度可变性并且所述调配物几乎达到1
·
10
11
vg/ml的目标滴度。暴露于搅拌应力导致调配物1、3、5和8的滴度下降。在调配物6中观察到拉点测量结果之间的大滴度可变性和大多数测量结果的大标准偏差。调配物6暴露于-80℃冻融循环导致滴度下降近两个对数。同样，调配物6的所有滴度与其它调配物相比小得多，并且从未超过1
·
10
10
vg/ml。尽管调配物7在所有测量结果之间没有显示出大的可变性，但是大多数滴度测量结果低估了约一个对数的滴度。值得注意的是，调配物2、4、6和7在搅拌模型之后没有出现滴度下降。除了所提及的滴度下降之外，在调配物研究过程中，调配物显示出恒定的病毒滴度。
[0337]
5.3.3调配物研究2中所有gfp表达测定的总结
[0338]
以下部分呈现了来自基于细胞的gfp转基因表达测定的结果。用八种不同的aav2-cmv-gfp调配物转导细胞。成功转导后，细胞表达gfp。通过用读板仪测量荧光，可以直接对gfp表达进行定量。
[0339]
5.3.3.1在用储存在2-8℃下的调配物转导之后的u2os细胞中的gfp转基因表达
[0340]
图13显示了从暴露于2-8℃不同时间的所有调配物的gfp转基因测定中获得的结果。每种调配物在t0时引发不同的荧光强度。尽管在t0时调配物特异性gfp表达，但当冷冻三个月时，大多数调配物表达出显著的荧光下降，与冷冻温度无关。调配物6和8在冷冻后没有显示出表达下降并且调配物7仅显示出少量下降。与储存在-20℃或-80℃下三个月相比，调配物8暴露于2-8℃下一个月和三个月导致更少的表达。储存在2-8℃下的其它调配物与冷冻调配物相比展示出相似的表达。当储存在2-8℃下时，在储存的一个月与三个月之间没有观察到表达差异。与液体调配物相比，冷冻干燥调配物3和4，然后储存在2-8℃下一个月显示出类似表现。而调配物6和7在冷冻干燥时产生显著更小的荧光强度。在所有拉点期间，用调配物3转导与其它调配物相比产生小得多的绝对荧光强度。调配物1与调配物2相比在整个研究期间在t0时已经揭示较小的表达。
[0341]
在所有拉点期间的绝对gfp表达在调配物6中最高。moi应用于gfp表达测定(参见附录表9)。
[0342]
5.3.3.2在用储存在25℃下的调配物转导之后的u2os细胞中的gfp转基因表达
[0343]
图14中的结果表明，在储存在25℃下两周之后，gfp表达显著下降。尽管在储存在25℃下两周之后荧光下降很大，但是在储存一个月之后没有观察到进一步的下降。但是在储存在25℃下三个月之后，所有调配物中的表达进一步下降。调配物1和2在储存在25℃下
两周和四周之后显示出最大的表达下降。同样，调配物6产生最高绝对gfp表达。除了调配物3之外，所有冷冻干燥的调配物在转导时产生的gfp表达比未冷冻干燥的调配物更少。冷冻干燥后储存在25℃下三个月与储存一个月相比产生甚至更低的表达。
[0344]
5.3.3.3在暴露于40℃、冻融循环和搅拌应力之后的gfp转基因表达
[0345]
图15展示了在调配物暴露于40℃或如冻融和搅拌应力等应力条件之后的gfp表达。调配物6和8在到-20℃或-80℃的冻融循环之后没有记录任何gfp表达下降。所有其它调配物在冻融后显示出表达下降。到-20℃的循环与到-80℃的循环相比导致调配物3、4和5中的表达更明显下降。所有其它调配物与到-80℃的循环相比揭示类似的表达。呈现的数据表明，在2-8℃下水平摇动五天导致gfp表达比冻融循环甚至更低。没有调配物对摇动应力有抗性，但是调配物6与其它调配物相比显示出最小的表达下降。在调配物1、2、5和7中，搅拌应力导致gfp表达的下降与暴露于-20℃冻融循环类似。其它调配物导致较低的表达。在摇动五天之后，调配物8中的gfp表达显著降低。暴露于40℃两周阻止了所有调配物中的任何gfp表达。
[0346]
5.3.4用调配物研究2中的dls测量的所有z平均值和颗粒大小分布的总结
[0347]
图17(a)展示了所有调配物在所有测量的拉点期间的z平均值。对于没有显示任何聚集的调配物，预计z平均值在20-30nm之间。数据表明，调配物6在所有不超过31nm的拉点期间具有最小的z平均值，相比之下，所有其它调配物在t0时已经具有显著更高的z平均值。调配物1在t0时已经显示出约1500nm的最高z平均值。同时，调配物2、3在t0时具有约400nm的最小的z平均值。另外，调配物2、3和7与其它调配物相比显示出低z平均值。暴露于25℃两周或一个月后使得几种调配物的z平均值显著增加。调配物1、4、5、7和八记录了此类增加。调配物2和3在暴露于25℃两周或一个月后没有显示出任何z平均值增加。在暴露于搅拌应力之后的最高z平均值见于调配物8。该调配物不仅在摇动之后显示最高z平均值，而且在到-20℃的冻融循环之后也具有最高值。
[0348]
当观察图16中显示的t0时每个调配物的颗粒分布时，只有调配物7在30nm处显示小的颗粒大小分布。
[0349]
所有其它调配物在该范围内没有显示出任何大小分布。含有1％白蛋白的调配物6具有非常显著的约10nm的颗粒大小分布。含有0.02％ps80的调配物1、2、3、4和5也在10nm处揭示峰。所有调配物显示出在更高纳米范围内的特定颗粒大小分布，如在方法评估实验期间已经检测到的。在调配物1中，该峰为约1000nm，而在调配物2中，该峰在566nm处。类似地，调配物4在1074nm处显示出大小分布并且调配物3在522nm处显示出大小分布。调配物5和6分别在1292nm和1561nm处揭示峰。在调配物7和8中，分别在957nm和1320nm处发现颗粒大小分布。在该研究过程期间，t0时描述的颗粒大小分布特性保持恒定。特别是在所有条件和拉点下，在1、10、30nm附近描述的峰在相应调配物中保持不变。在研究过程期间，只有在更高纳米范围处描述的峰记录了一些偏移。在调配物2的情况下，在暴露于25℃四周之后，在t0时约100nm处观察到的大麦分布强度增加。在t0时，也用安慰剂进行dls。在储存期间没有观察到峰偏移。在所有调配物中，安慰剂的z平均值在3.2与8.5nm之间。除了含有1％白蛋白的安慰剂6之外，所有安慰剂在1nm处显示峰。安慰剂与调配物相比在高纳米范围处没有显示任何峰。图29和30中示出了暴露于25℃一个月的调配物和t0时的安慰剂的大小分布。
[0350]
图17(b)中展示了多分散性测量结果。根据文献，单分散aav调配物的pdi值为约
0.2或更小。因此，调配物6是单分散的并且当冷冻干燥并储存在2-8℃以及25℃下时变成多分散的。在t0时，调配物五也揭示单分散性，但储存后变成多分散的。所有其它调配物从t0开始是多分散的并且保持是多分散的。调配物8与其它调配物相比不仅在摇动时具有最高z平均值，而且多分散性也更高。
[0351]
5.3.5调配物研究2中亚可见颗粒测量结果的总结
[0352]
由于所有样品被稀释用于确定亚可见颗粒，因此接收到的颗粒计数乘以稀释因子。在计数之后，软件根据颗粒大小将其分为四组。测量结果揭示所有调配物中的颗粒计数非常低。将所有计数与相应安慰剂进行比较。如图18b、18d、18f和18h所示，许多安慰剂测量结果与调配物中的颗粒计数相比显示了更高的颗粒计数。安慰剂1与其它安慰剂相比在所有时间点显示出最高颗粒计数。同时，调配物1与其它调配物相比在t0时、在储存在40℃下、冻融循环之后和在搅拌应力之后仅具有更高的颗粒计数。暴露于-80℃冻融循环后，调配物2与安慰剂相比具有显著更高的2、5和10μm颗粒计数。类似地，调配物3在暴露于25℃两周时具有更高的2、5、10和25μm颗粒计数。所有其它调配物的颗粒计数与安慰剂相比没有显著增加。在调配物和安慰剂1中检测到大多数亚可见颗粒。参见图18-21。
[0353]
5.3.6调配物研究2中ζ电位测量结果的总结
[0354]
图19示出了所有调配物的ζ电位。所有调配物具有负ζ电位。观察到拉点之间有很大的可变性，具体地在调配物7中。调配物1和8的ζ电位在拉点分析之间显示出较小的可变性。调配物1在所有拉点期间具有最小ζ电位。在调配物7中，暴露于40℃两周以及在2-8℃下冷冻干燥和储存导致约-31mv的高ζ电位，同时到-20℃的十次冻融循环导致-2mv的ζ电位。暴露于搅拌应力仅导致调配物6的ζ电位增加。如在方法评估期间已经显示的，调配物8在t0时的ζ电位总计为-9.46mv，所述电位与文献中描述的aav2表面电位一致。在搅拌之后的ζ电位在调配物8中最小。
[0355]
5.3.7调配物研究2中ph测量结果的总结
[0356]
在调配物稳定性研究过程中，大多数调配物显示出恒定的ph值。在-20℃冻融循环之后，在调配物1和2以及安慰剂1和2中观察到ph的小幅增加。类似地，在储存在2-8℃和25℃下一个月之后，调配物1显示ph从5.5增加到5.8。参见图20(a)和20(b)。
[0357]
5.4另外的结果
[0358]
5.4.1含有150mm氯化钠的调配物与不含氯化钠的调配物相比的过滤
[0359]
基于从第一调配物研究中获得的结果，进行了另外的实验来研究在无菌过滤之后滴度损失的原因。这些实验在调配物研究2的拉点分析之间进行。图21展示了氯化钠对aav2调配物的过滤能力的影响。补充有150mm氯化钠的调配物在无菌过滤之后显示出完全的滴度回收率。在无菌过滤过程中，少量病毒基因组损失。而不含任何氯化钠的调配物在所有三个过滤器中表达出超过1.5个对数单位的滴度损失。通过puradisc pvdf过滤器的过滤与分别产生3.87
·
109vg/ml和3.53
·
109vg/ml的滴度的millex和anotop过滤器相比产生2.27
·
109vg/ml的稍小滴度。
[0360]
5.4.2 150mm氯化钠对用dls测量的颗粒大小分布的影响
[0361][0362]
表6：补充有150mm nacl的调配物与不含nacl的调配物相比的dls原始数据。使用13mm 0.2μm millex pvdf注射器过滤器进行无菌过滤。
[0363]
如图22和表6所示，含有150mm氯化钠的调配物之间的颗粒大小分布与不含任何盐的调配物相比不同。两种调配物由同一缓冲液、同一赋形剂和蔗糖浓度组成。结果表明不含任何nacl的调配物的z平均值为587nm。向调配物中补充氯化钠将z平均值降低到83nm。z平均值在调配物通过0.2μm millex pvdf过滤器无菌过滤时进一步下降。含有nacl的调配物的多分散性与不含nacl的调配物相比几乎是两倍。补充有150mm nacl的调配物揭示约20-30nm的大小分布，而不含nacl的调配物没有显示出该范围内的任何颗粒大小分布。相反，检测到约780nm的颗粒物质。nacl的添加极大地改变了该大小分布特性。无菌过滤的调配物与未经无菌过滤的样品相比显示出小得多的标准偏差。
[0364]
5.4.3用sypro-orange和sybr-gold进行热偏移测定
[0365]
如引言中所描述的，dsf是用于研究赋形剂、缓冲系统和ph范围对衣壳热稳定性的影响的有吸引力的工具。方法评估在调配物研究2的拉点分析之间进行。用滴度为1.0
·
10
11
vg/ml的样品进行差示扫描荧光测定法。因为这些滴度与非常低的浓度相对应，所以添加sypro-orange和sybr-gold以增强信号强度。目标是观察由衣壳变性引起的热偏移并确定熔融温度。图23中的结果表明，在任何样品中都没有观察到热偏移。尽管观察不到热偏移，图24(a)和(b)表明含有染料样品的激发引起可检测的和浓度依赖性荧光信号。没有对更高aav2浓度进行进一步的测量。
[0366]
6讨论
[0367]
6.1 aav2表征的分析方法的评估和开发
[0368]
如所预计的，dna酶i样品处理降低了滴度，因为在样品中存在残留宿主细胞杂质。如果没有该消化步骤，滴度将被高估，因为宿主细胞dna干扰病毒滴度定量。dobnik和同事观察并描述了用两个单位的dna酶i的dna酶i处理后类似的滴度下降[70]。此类杂质的存在不仅突出了dna酶i消化步骤的需要，也是潜在聚集的危险信号。如wright和同事所提出的，尽管浓度很低，但残留宿主细胞dna可以介导聚集[30]。
[0369]
热衣壳开放增加了aav2滴度并指示在qpcr循环开始时短衣壳开放时间不足以在分析之前释放所有病毒基因组。两种处理的组合使得能够精确确定供应商给出的滴度。
[0370]
在艾本德粘附实验中，表明aav2滴度在样品在艾本德管中储存24小时之后混合时增加。然而，不能断定增加是由于从管壁上分离aav还是由于均质化样品。然而，这一知识得到了应用并且储存在艾本德管中的样品总是通过用其一半体积上下移液至少十次来混合。
[0371]
对于tem测量，表明需要修改标准阴性染色方案和增加滴度，以便在铜网格上可视化足够的衣壳。更高的滴度可能产生网格上更高数量的aav衣壳，然而文献表明10
9-10
10
vg/ml的滴度已经产生网格上大量的衣壳。因此，可以假设样品制备中的主要修改使得衣壳数量增加。具体地载体悬浮液在铜网格上的延长的温育时间使得更多的衣壳粘附并且因此在随后的洗涤步骤中不能被洗掉。结果表明，样品中含有的完整衣壳略多于空衣壳。这是aav2供应商充分纯化aav的指标，因为未纯化的aav样品通常具有更多的空衣壳。
[0372]
表明ζ电位测量可以用扩散屏障法进行并且1
·
10
11
vg/ml的滴度足以获得读数。ζ电位方法评估的结果表明在ph 7.5时aav2表面电位为-9.46mv，所述表面电位与在ph为7.5时测量的aav2的文献值相对应。
[0373]
在开发gfp表达测定期间，表明浓度依赖性gfp荧光可以用读板仪测量。荧光强度在荧光测量之前用pbs替代孔中的培养基时增加。对该结果的解释是含有酚红的培养基作为gfp的淬灭剂。酚红在细胞培养物ph偏移时会产生另外的干扰并且因此改变酚红吸光度光谱。为了防止此类混杂因子，决定在测量期间用pbs替代培养基以在一侧和另一侧获得信号强度，从而保证随时间获得一致的结果。
[0374]
首先用文献中描述的488nm的激发波长和520nm的发射波长进行表达实验。因为信号强度非常低，所以决定用rgfp对照进行波长扫描。使用该对照，鉴定理想的激发波长和发射波长(即分别为460nm和515nm)。使用这些波长进一步增加了信号强度。
[0375]
在下一步骤中，表明读板仪能够区分由不同moi引起的gfp表达。如所预计的，该结果突出了浓度依赖性表达。同样，在24小时之后已经检测到gfp表达，但随时间进一步增加。此类快速的荧光启动表明，一方面，人巨细胞病毒(cmv)启动子是高效且有效的启动子，适用于监测u2os细胞中的gfp表达，并且另一方面，aav转导发生在与细胞温育后几个小时内。bartlett和同事支持该发现，他们表明aav感染和基因组转导进入细胞核发生在三至四个小时内[39]。
[0376]
在所有moi中，在三至四天后达到最大表达。通过观察细胞活力测定，很明显这与细胞密度和细胞活力相关。在四天之后，在孔板中观察到最高细胞密度，这指示细胞不能进一步增加其密度。细胞密度在另外两天内保持恒定，这表明细胞处于平衡状态。在七天之后，细胞活力显著下降，这也可以在gfp表达测定中观察到。由于gfp表达细胞已经死亡，观察到gfp表达并且因此观察到在七天之后的荧光下降。细胞活力丧失的原因是孔内细胞密度过高并且缺乏足够的营养来维持细胞稳态。
[0377]
尽管103vg/细胞的moi产生可测量的gfp表达，但是没有检测到表达随时间的变化。因此，该moi被定义为最低检测限值。104vg/细胞的更高moi已经产生时间依赖性gfp表达。基于这些结果，决定以105vg/细胞的moi进行调配物研究。此类moi导致强烈的gfp表达和荧光。同样，可以在不直接达到检测的最低限值的情况下监测表达的下降。与106的更高moi相比的另一个优点是可以在五个复制品中而不是仅一个复制品中定量gfp表达。细胞活力测定表明，该密度使得能够在不损失细胞和表达的情况下在四天内监测gfp表达。更高密度不能保证此类长观察，这可能暴露表达时间不足的风险。而较低密度可能过小而不能产生可测量的信号。
[0378]
在评估dls作为监测aav2颗粒大小分布的方法期间，表明可以检测到滴度为10
11
vg/ml的aav2衣壳。简单的反向散射分析能够揭示分配给aav2的约20-30nm的大小分布。
虽然dls能够检测aav2，但是另一个峰出现在约600nm处。后来的实验已经表明，聚集体造成这些大小分布。由于信号强度非常低，因此关于aav的检测的最低限值联系了装置制造商。根据装置供应商，使用的衣壳量等于检测的最低限值。进行madls测量以确认从反向散射测量结果获得的结果。因为前向散射不如反向散射和侧向散射灵敏，所以不能检测20-30nm之间的预计范围处的大小分布。因此，决定在调配物研究中仅应用反向散射测量结果。
[0379]
如引言中所描述的，用dsf的热偏移测定可以在调配物研究内添加有价值的数据。尽管添加了染料，但是没有检测到热偏移。染料的激发显示了浓度依赖性信号强度，这证明了在样品中存在足够的染料。因此，缺失的热偏移是由过小的aav2浓度造成的而不是由不足的染料浓度造成的。因为需要更高的滴度，所以没有进行进一步的实验。根据文献，可测量的热偏移在使用约6
·
10
11
–1·
10
12
vg/ml的滴度时是预计的[102]。
[0380]
6.2调配物研究1
[0381]
在调配物研究1中，在t0时进行qpcr表达测定之后，很明显所有调配物含有比目标滴度更低的滴度。gfp表达测定证实了该发现。尽管滴度很低，但是在含有白蛋白和透明质酸的调配物中观察到显著的gfp表达。尽管观察到显著的表达，但是qpcr测量结果显示了与其它调配物相比类似的滴度。基于该结果，假设白蛋白以及透明质酸可能干扰qpcr方法并人为降低载体滴度。
[0382]
在所有调配物中观察到的滴度损失可以用aav聚集或过滤器吸附来解释。在方法评估期间的dls结果可能支持第一假设，因为所述结果揭示643nm的z平均值。因此，在调配物研究2的拉点之间设计了另外的实验以阐明该问题的原因和解决方案。
[0383]
如另外的实验所示，可以在提供有150mm nacl而不依赖于pvdf过滤器品牌时对aav2调配物进行无菌过滤。根据文献，此类盐浓度防止aav2聚集，然而，不能完全排除吸附[30]。
[0384]
通过另外的dls测量，表明氯化钠防止聚集并且产生更低的z平均值。更仔细地观察颗粒大小分布，表明在补充150mm nacl后，出现20-30nm处的颗粒分布，指示存在未聚集的aav2。在不提供任何nacl的调配物中没有识别出该分布。相反，此类调配物仅揭示782nm处的峰，指示载体聚集。
[0385]
与未经无菌过滤的样品的测量结果相比，含有150mm nacl的调配物的无菌过滤产生较低的标准偏差。有趣的是，仍然出现了约273nm的大小分布。多分散性指数证实，尽管无菌过滤，样品仍是多分散的。这可能是由于aav载体在过滤形成聚集体之后重新平衡造成的。
[0386]
值得一提的是，dls在两种情况下(具有和不具有nacl)都观察到了聚集体的存在。只有无菌过滤随后用qpcr进行aav2滴度定量才能够可靠地表明，当调配物提供有150mm nacl时，聚集减少并且无菌过滤没有造成任何滴度损失。
[0387]
由于调配物研究旨在评估调配物在冻干之后的稳定性，因此选定的调配物不含nacl。这是因为使用此类高水平的nacl会导致凝固点降低，因此需要开发极长的冷冻干燥循环。同时，白蛋白和透明质酸被研究为潜在的替代品，所述潜在的替代品可能具有防止aav聚集的潜力并且同时可以冷冻干燥。
[0388]
在调配物研究1期间，在调配物6和7中观察到gfp表达。该发现表明较少的聚集发生并且更多的载体通过无菌过滤器。具有白蛋白的调配物显示出比具有透明质酸的调配物
更多的表达，这很可能是由更高效地防止聚集造成的。然而，gfp表达与在方法开发期间测量的表达相比较低，指示聚集没有被完全阻止。
[0389]
6.3调配物研究2
[0390]
所有调配物成功地冷冻干燥。一些冻干饼揭示微小的裂纹，这可以通过在含有蔗糖的调配物中通常观察到的饼收缩率和使用的小调配物体积来解释。
[0391]
虽然第二调配物稳定性研究与研究1相比显示了通常更高的滴度，但是含有白蛋白和透明质酸的调配物表明相对较低的滴度，尽管其gfp表达很高。这可能指出两种赋形剂对qpcr的潜在干扰，这是需要进一步研究的假设，因为没有文献描述此类现象。除了在f/t循环到-80℃之后的一个大纲视图离群点之外，滴度在研究过程期间保持一致。
[0392]
表明在整个研究过程中，滴度保持恒定，与其缓冲液和ph无关。值得注意的是，搅拌应力作为唯一的应力条件在几种调配物中导致滴度显著下降。假设搅拌应力打破了一些衣壳并导致其基因组的释放。在dna酶i消化步骤中，该dna然后被消化并去除。含有白蛋白、透明质酸的样品在摇动之后没有记录到滴度下降。
[0393]
然而，ph为6.8的l-组氨酸和磷酸钠对搅拌应力有抗性。几个因子可能是原因。首先得出的结论是，ph影响衣壳的稳定性，因为l-组氨酸ph 5.5调配物与对滴度下降有抗性的l-组氨酸ph 6.8调配物相比记录了滴度下降。更高的ph 7.5似乎也降低了针对摇动应力的稳定性。因此，约6.8的ph显示出对衣壳稳定性是有利的。
[0394]
成功地进行了冷冻干燥并且没有导致任何滴度下降。另外，在没有观察到滴度的任何损失的情况下对aav进行冷冻干燥。
[0395]
与滴度测量结果相比，转基因表达告知疗法的效力。尽管滴度基本保持恒定，但在不同的温度和应力下，表达快速下降。暴露于不同应力表明，到-80℃的冻融循环与到-20℃的冻融循环相比产生类似的表达并且在一些情况下产生更高的表达。该发现与croyle和同事的观点相矛盾，他们提出-80℃冻融循环与到-20℃冻融循环相比对转基因表达的负面影响更大[27]。向ph 6.8的磷酸盐缓冲液中添加白蛋白或p188与t0时的gfp表达相比产生对两种温度下冻融循环的抗性。白蛋白似乎保护衣壳，防止任何导致转导效率受损的主要衣壳变化。在gfp表达中也观察到了搅拌应力和所得滴度下降。具体地，含有p188的调配物8与t0相比在暴露于搅拌应力时仅表达出其gfp表达的一半。得出的结论是，p188与ps80相比针对搅拌应力对衣壳的保护作用更差。该发现通过滴度测量结果得到了证实。令人惊讶的是，在调配物4与5之间没有观察到表达差异，尽管测量了滴度差异。在摇动之后l-组氨酸ph 5.5与ph 6.8相比之间的表达差异可以通过qpcr研究中观察到的滴度下降来解释。最有可能的是，ph 5.5的衣壳不太稳定并且因此更容易受到搅拌应力和温度应力的影响。然而，所有调配物在摇动时导致表达丧失，同样的调配物也没有表达出滴度下降。这些结果指示，摇动应力导致衣壳断裂或者导致衣壳变化，从而导致载体的转导效率降低。
[0396]
l-组氨酸或向磷酸盐缓冲液中添加白蛋白表现良好并且在所有提及的应力中仅显示少量gfp表达降低。虽然aav2的熔融温度为约70℃，但是暴露于40℃足以消除任何表达。假设暴露于此类温度会导致不可逆的衣壳变化并且使载体失去感染性。
[0397]
在整个研究中，观察到含有柠檬酸钠的调配物与t0时的所有其它调配物相比观察到小得多的gfp表达。柠檬酸盐被认为用作螯合剂。这种螯合能力是否导致了观察到的表达/效力的降低还有待评估。
[0398]
5.5的酸性ph与具有更高ph的调配物相比在t0时已经产生低得多的表达。如引言中所描述的，较低的ph产生孔开放和vp1蛋白n末端的外化。此类构象变化允许内体逃逸，但可能干扰受体介导的摄取，损害衣壳稳定性或随后阻止成功的内体逃逸。
[0399]
将所有调配物冷冻到-20℃或-80℃，然后储存三个月，导致大多数调配物中的gfp表达大幅下降。同样，含有p188或白蛋白的磷酸钠缓冲液对任何表达的抗性下降并且显示出与t0时类似的表达。两种调配物已经显示出对冻融循环的抗性。此类性质的表现使得补充有p188或白蛋白的磷酸钠缓冲液成为极好的储存和运输缓冲液。此类有利的特性解释了aav制造商经常使用该p188的原因。在含有白蛋白的调配物中储存在-20℃和-80℃下三个月也非常成功，另外，还在储存在2-8℃下期间稳定表达。同时，含有p188的调配物在储存在2-8℃下时记录了显著的表达下降。因此，其主要用途应限于长期储存在-20℃或-80℃下。由于这个原因，白蛋白的添加呈现了优于p188的新的有吸引力的替代性储存赋形剂。
[0400]
所有其它调配物与储存在2-8℃下一个月或三个月相比在冷冻时显示出类似的表达。没有调配物在储存在2-8℃下一个月与三个月相比时显示出表达变化。该结果对未来稳定性研究的设计是有价值的。具体地表明，导致gfp表达减少的不稳定性发生在储存在2-8℃下一个月之前。在储存在2-8℃下一个月之后达到最大下降并且当储存三个月时不再下降。尽管若干个出版物以及aav供应商的建议不建议将载体储存在-20℃下，但储存在-20℃下时与储存在-80℃下三个月相比对表达不产生有害影响。长期储存的影响有待评估。
[0401]
本文的结果表明，储存在25℃下仅两周与储存在2-8℃下相比产生小得多的gfp表达并且没有调配物能够防止表达的下降。有趣的是，在四周之后的表达与两周相比是类似的，但在储存三个月时进一步下降。aav2在此类温度下显然是不稳定的。
[0402]
研究的主要目标是评估aav2调配物的冷冻干燥。表明储存在2-8℃下的冷冻干燥的调配物与储存在2-8℃下的液体调配物产生类似的表达。唯一的差异是，当储存三个月时与液体调配物相比观察到表达进一步下降。作为赋形剂的透明质酸钠具有提高玻璃化转变温度的特征并且因此适用于冷冻干燥。尽管具有有利的性质，但含有透明质酸钠的调配物与其它调配物相比显示出较低的gfp表达。本文的结果表明，液体调配物与冷冻干燥的调配物相比在储存在2-8℃或25℃下一个月或两个月时呈现出类似或更高的gfp表达。结果与croyle和同事的结果相矛盾，他们表明在冷冻干燥的样品中，感染性滴度在90天内保持恒定[27]。
[0403]
在aav2载体调配物中添加白蛋白与其它调配物相比产生整个研究中最高gfp表达。一个原因可能是白蛋白与衣壳结合并且形成另外的层。由于白蛋白与衣壳结合，病毒的摄取另外由白蛋白特异性受体介导并且不仅仅是hspg受体依赖性的[105]。需要进行进一步的研究来研究白蛋白是否另外保护病毒衣壳免受温度和压力依赖性结构变化的影响。
[0404]
通常，gfp表达测量结果强调，表达与滴度相比更受不同调配物、赋形剂、暴露的应力和温度的影响。表明滴度测量结果不是可靠的稳定性预测因子。相反，搅拌后滴度下降与gfp表达下降相关。尽管滴度测量结果使得能够对aav2稳定性进行较小的预测并且对剂量估计至关重要，但所述滴度测量结果不应仅用于稳定性预测。所述滴度测量结果不表示对治疗效果重要的转基因表达，显示所述治疗效果与滴度相比更容易受到应力的影响。
[0405]
预计未聚集的aav2调配物的z平均值为约25nm。dls测量揭示，添加白蛋白产生低z平均值，指示没有阻止聚集。同时，所有其它aav2调配物在t0时已经揭示聚集。多分散性测
量结果证实了这些结论并表明调配物6是单分散的。假设白蛋白与衣壳结合并阻止了衣壳-衣壳相互作用的发生。尽管冷冻干燥没有显著增加z平均值，但含有白蛋白的调配物变得多分散。在调配物之间观察到大的z平均值差异。调配物2、3和7与调配物1、4、5和8相比具有小得多的z平均值。根据当前的知识，如果这些调配物关于载体聚集具有有利的特性，那么不可能得出任何结论。只能得出的结论是，除了调配物6之外，所有调配物聚集。
[0406]
在光遮蔽下的亚可见颗粒测量结果中存在浓度问题。该方法使用800-1000μl的体积。如引言中所描述的，调配物体积量仅为245μl。因此，将样品稀释到1
·
10
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vg/ml的滴度。虽然样品稀释肯定会损害数据质量并且有时也不是良好的做法，但这是进行此类测量的唯一方法。表明调配物小瓶中的颗粒计数没有安慰剂小瓶中的多。颗粒计数不超过1000个颗粒/ml。调配物和安慰剂1中更高的颗粒计数可能是由聚山梨醇酯80的自氧化和水解引起的。ζ电位测量结果的方法评估表明，此类测量结果可以应用于aav2表征。在方法评估期间测量的表面电位与文献中描述的值相关。具体地含有透明质酸钠的调配物揭示ζ电位内的波动。尽管有波动，透明质酸钠在t0时产生最低ζ电位。带负电荷的透明质酸与衣壳的结合可以解释该发现。ζ电位是胶体稳定性的指标。ζ电位越负或越正，颗粒之间的排斥就越大并且其聚集行为就越小。根据文献，所有测试的调配物的ζ电位揭示初期不稳定性和趋向于聚集[97]。即使调配物6没有显示出聚集，也没有观察到ζ电位的显著变化。表明用aav2只能获得接近于零的小的衣壳电位，指示衣壳在电位上没有揭示大的差异。将值与未聚集的aav2载体的文献值进行比较，可以注意到表面电位没有受到影响并且因此不能可靠地揭示此类载体的胶体稳定性。该结果质疑了ζ电位测量结果在aav2调配物开发中的用途和益处。ζ电位受ph的影响，这可以在揭示最大ζ电位的调配物1中观察到。低ph调配物的酸性环境使pi为约6.4的衣壳质子化，导致表面电位增加。
[0407]
值得一提的是，三个月的时间点没有得到完全分析，因为实验室设施在全球covid-19爆发期间关闭。基于先前获得的结果，在三个月的稳定性之后，优先实施gfp表达测定，并且数据在上文中显示和讨论。不幸的是，没有时间进行滴度分析以及颗粒和ζ电位测量。
[0408]
7结论
[0409]
在该项目的第一部分，评估和开发了用于表征aav2的分析方法。首先，通过用sybr-green方法替换taqman方法成功地优化了通用itr qpcr。添加2个单位的dna酶i以及实施热衣壳开放步骤提高了方法的准确性。为了监测转基因表达，开发了读板仪测定并且表明u2os细胞是非常适合用于对aav2诱导的表达进行定量的细胞系。使用tem，表明约60％的衣壳含有病毒dna。尽管成功地确定了完整衣壳和空衣壳比例，但测量结果突出了需要耗时更少且可扩展的方法。使用具有dls的颗粒分析，表明可以检测到1
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vg/ml的滴度，但是所述滴度是检测的最低限值。ζ电位测量结果证实了文献值为-9.46mv。
[0410]
在第二步骤中，在为期三个月的aav2调配物稳定性研究中应用并开发分析方法。在混合之后观察到大量滴度损失之后，第一调配物研究终止。这些研究表明，aav2在混合期间迅速聚集并且因此被过滤掉。添加150mm nacl防止聚集并实现无菌过滤。只有无菌过滤与qpcr滴定组合可靠地表明150mm nacl显著降低了聚集。
[0411]
在第二调配物研究中，表明在该研究过程期间添加1％白蛋白防止聚集。而所有其它调配物在t0时已经聚集。调配物6和8在冷冻和冻融循环后没有显示出表达下降并且因此
适合作为储存缓冲液。转基因表达在储存时以温度依赖性方式快速降低(40℃》25℃》2-8℃≥-20/-80℃)。冷冻干燥后储存在25℃下与储存在25℃下的相应液体调配物相比产生较低的表达。该研究表明，在储存一个月之后，储存在2-8℃下已经达到最低表达。这说明需要在研究早期添加更多拉点。
[0412]
在该研究过程期间，滴度保持恒定并且仅受搅拌应力的影响。添加聚山梨醇酯80保护调配物在摇动时不发生显著的滴度下降，同时p188不能揭示保护作用。本文表明，补充白蛋白和透明质酸可能干扰qpcr滴度定量。
[0413]
通过对分析方法的评估和开发以及调配物研究中那些分析方法的应用，获得了aav2载体调配物开发领域的有价值的见解。
[0414]
8参考文献
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[30]wright,j.f.等人鉴定有助于重组aav2颗粒聚集的因子以及在载体纯化和调配物期间防止其发生的方法(identification of factors that contribute to recombinant aav2particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation.)《分子疗法(mol.ther.)》12,171-178(2005)。
[0445]
[31]walters,r.w.等人基因转移需要腺相关病毒5型与2,3-连接的唾液酸结合(binding of adeno-associated virus type 5to 2,3-linked sialic acid is required for gene transfer.)《生物化学杂志(j.biol.chem.)》276,20610-20616(2001)。
[0446]
[32]rayaprolu,v.等人腺相关病毒衣壳稳定性和动态性的比较分析(comparative analysis of adeno-associated virus capsid stability and dynamics.)《病毒学杂志(j.virol.)》87,13150-13160(2013)。
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[33]venkatakrishnan,b.等人腺相关病毒血清型1vp1独特n端结构域的结构和动力学及其在衣壳转运中的作用(structure and dynamics of adeno-associated virus serotype 1vp1-unique n-terminal domain and its role in capsid trafficking.)
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[0449]
[35]johnson,j.s.等人腺相关病毒2型衣壳蛋白vp1的诱变揭示了碱性氨基酸在转运和细胞特异性转导中的新作用(mutagenesis of adeno-associated virus type 2capsid protein vp1 uncovers new roles for basic amino acids in trafficking and cell-specific transduction.)《病毒学杂志》84,8888-8902(2010)。
[0450]
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[0484]
[70]dobnik,d.等人腺相关病毒载体的精确定量和表征(accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.)《微生物学前沿(front.microbiol.)》10,(2019)。
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[0486]
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[0488]
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[0489]
[75]lock,m.,alvira,m.r.和wilson,j.m.用离子交换色谱法分析重组腺相关病毒血清型8载体的颗粒含量(analysis of particle content of recombinant adeno-associated virus serotype 8vectors by ion-exchange chromatography.)《人类基因疗法方法》23,56-64(2012)。
[0490]
[76]wang,c.等人开发阴离子交换色谱法测定，用于确定aav6.2中的空衣壳和完整衣壳含量(developing an anion exchange chromatography assay for determining empty and full capsid contents in aav6.2.)《分子疗法-方法与临床开发》15,257-263(2019)。
[0491]
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[0514]
[100]ablinger,e.,leitgeb,s.&zimmer,a.使用荧光分子转子的差示扫描荧光方法检测含表面活性剂调配物中蛋白的热稳定性(differential scanning fluorescence approach using a fluorescent molecular rotor to detect thermostability of proteins in surfactant-containing formulations.)《国际药剂学杂志(int.j.pharm.)》441,255-260(2013)。
[0515]
[101]rieser,r.等人快速且简便鉴定腺相关病毒血清型的内在差示扫描荧光测定法(intrinsic differential scanning fluorimetry for fast and easy identification of adeno-associated virus serotypes.)《药学科学杂志(j.pharm.sci.)》109,854-862(2020)。
[0516]
[102]pacouret,s.等人aav-id：用于aav调配物的批次间一致性评估的快速且稳健的测定(aav-id:a rapid and robust assay for batch-to-batch consistency evaluation of aav preparations.)《分子疗法》25,1375-1386(2017)。
[0517]
[103]bennett,a.等人热稳定性作为aav血清型鉴定的决定因素(thermal stability as a determinant of aav serotype identity.)《分子疗法-方法与临床开发》6,171-182(2017)。
[0518]
[104]wright,j.f.,qu,g.,tang,c.和sommer,j.m.重组腺相关病毒：基因疗法载体的调配物挑战和策略(recombinant adeno-associated virus:formulation challenges and strategies for a gene therapy vector.)《药物发现与开发的最新观点(curr.opin.drug discov.dev.)》6,174-178(2003)。
[0519]
[105]wang,m.等人人血清蛋白与aav病毒体的直接相互作用增强aav转导：对临床应用的直接影响(direct interaction of human serum proteins with aav virions to enhance aav transduction:immediate impact on clinical applications.)《基因疗法》24,49-59(2017)。
[0520]
9附录
[0521][0522]
表7：方法评估期间的dls反向散射测量结果
[0523][0524]
表8：调配物研究2中用于实施gfp表达测定的所有接种密度、传代和细胞活力的总结
[0525][0526][0527]
表9：在调配物研究2期间使用的所有moi的总结
[0528]
拉点f1stdf2stdf3stdf4std12周-80℃1.4e+062.0e+053.3e+063.3e+051.1e+061.3e+053.3e+064.5e+0512周-20℃1.3e+061.1e+053.7e+063.1e+051.2e+061.8e+053.2e+064.0e+05t03.7e+061.8e+055.4e+064.2e+051.4e+061.4e+055.8e+062.6e+054周1.8e+064.0e+053.5e+061.8e+054.1e+051.2e+053.4e+061.8e+0512周1.1e+067.5e+043.2e+061.2e+054.3e+051.0e+053.3e+069.9e+044周冻干
‑‑‑‑
5.1e+051.1e+053.0e+062.7e+0512周冻干
‑‑‑‑
6.1e+051.1e+052.1e+065.2e+05
[0529]
拉点f5stdf6stdf7stdf8std12周-80℃3.7e+063.1e+054.7e+062.5e+054.3e+062.6e+054.8e+061.1e+0512周-204.2e+062.8e+055.0e+061.4e+054.3e+061.4e+054.5e+062.9e+05t05.7e+064.1e+055.6e+068.8e+055.0e+061.6e+054.5e+061.2e+05
4周3.6e+063.4e+054.4e+063.8e+053.3e+061.7e+052.6e+061.7e+0512周3.8e+061.1e+054.6e+062.8e+053.5e+061.1e+053.1e+062.3e+054周冻干
‑‑
3.7e+061.9e+051.8e+068.5e+04
‑‑
12周冻干
‑‑
3.2e+061.8e+052.3e+062.3e+05
‑‑
[0530]
表10：储存在2-8℃下的调配物的gfp表达
[0531]
拉点f1stdf2stdf3stdf4std12周-80℃1.4e+062.0e+053.3e+063.3e+051.1e+061.3e+053.3e+064.5e+0512周-201.3e+061.1e+053.7e+063.1e+051.2e+061.8e+053.2e+064.0e+05t03.7e+061.8e+055.4e+064.2e+051.4e+061.4e+055.8e+062.6e+052周5.0e+051.7e+049.4e+051.1e+052.9e+055.6e+042.0e+062.7e+054周1.7e+055.4e+049.5e+059.1e+042.9e+057.7e+042.3e+061.6e+0512周7.1e+041.2e+043.0e+052.2e+042.9e+055.4e+049.4e+051.1e+054周冻干
‑‑‑‑
2.3e+055.9e+041.2e+061.4e+0512周冻干
‑‑‑‑
2.1e+054.4e+046.9e+055.6e+04
[0532][0533][0534]
表11：储存在25℃下的调配物的gfp表达
[0535][0536]
拉点f5stdf6stdf7stdf8stdt05.7e+064.1e+055.6e+068.8e+055.0e+061.6e+054.5e+061.2e+05f/t-80℃4.1e+063.6e+055.1e+063.8e+052.9e+062.6e+054.9e+062.2e+05f/t-20℃2.5e+062.8e+054.8e+066.2e+052.7e+064.1e+054.5e+062.2e+055d，200rpm2.4e+062.8e+053.9e+066.2e+053.2e+064.1e+052.2e+062.2e+052周40℃3.2e+054.0e+042.1e+051.9e+049.5e+042.4e+041.2e+051.6e+04
[0537]
表12：在暴露于不同应力之后的gfp表达
[0538][0539]
表13：所有测量的z平均值的总结(以nm为单位)
[0540] f1stdf2stdf3stdf4stdf5stdf6stdf7stdf8t00.790.020.720.070.630.000.850.010.270.080.300.030.930.130.72t2w 40℃0.940.290.630.120.750.060.720.060.790.050.250.010.890.210.59t2w 25℃0.900.010.560.170.520.041.040.100.950.110.260.020.780.050.39t1m 2-8℃0.990.050.510.070.660.090.440.220.830.050.260.010.880.040.72t1m 25℃1.000.110.640.070.720.081.230.060.740.180.230.010.800.081.01f/t-80℃0.470.060.630.190.610.220.810.120.660.010.300.030.560.030.45f/t-20℃0.600.050.530.030.710.050.570.050.530.190.330.021.290.240.59t1m冻干2-8℃
‑‑‑‑
0.540.031.030.23
‑‑
0.590.030.600.00-t1m冻干25℃
‑‑‑‑
0.530.041.430.02
‑‑
0.520.060.660.07-5d，200rpm0.780.050.750.130.670.010.780.180.870.080.230.030.690.051.05
[0541]
表14：所有多分散性指数的总结
[0542] p1p2p3p4p5p6p7p8z平均值(nm)4.398.117.514.173.188.543.673.24多分散性指数0.400.690.640.390.310.150.360.32峰1(nm)1.191.161.141.251.2310.001.201.27峰2(nm)20.3012.6012.5026.3021.50-72.60285.00峰3(nm)245.30242.00219.00
‑‑‑‑‑
[0543]
表15：t0时所有安慰剂的反向散射dls结果
[0544][0545][0546]
表16：在调配物研究2期间测量的所有ζ电位的总结
[0547][0548]
表17：调配物研究2的所有ph测量结果的总结

技术特征：
1.一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及球状蛋白。2.根据权利要求1所述的调配物，其中所述球状蛋白是白蛋白、甲胎蛋白、维生素d结合蛋白、阿法敏(afamin)、珠蛋白、α球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白或其组合。3.根据权利要求1或2所述的调配物，其中所述调配物是液体。4.根据权利要求3所述的调配物，其中所述调配物包括约0.1％至约5.0％的球状蛋白。5.根据权利要求3所述的调配物，其中所述调配物包括约0.5％至约2.0％的球状蛋白。6.根据权利要求3所述的调配物，其中所述调配物包括约0.75％至约1.5％的球状蛋白。7.根据权利要求3所述的调配物，其中所述调配物包括约0.8％至约1.2％的球状蛋白。8.根据权利要求3所述的调配物，其中所述调配物包括约1.0％的球状蛋白。9.一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及白蛋白。10.根据权利要求1所述的调配物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或乳清蛋白。11.根据权利要求9或10所述的调配物，其中所述调配物是液体。12.根据权利要求11所述的调配物，其中所述调配物包括约0.1％至约5.0％的白蛋白。13.根据权利要求11所述的调配物，其中所述调配物包括约0.5％至约2.0％的白蛋白。14.根据权利要求11所述的调配物，其中所述调配物包括约0.75％至约1.5％的白蛋白。15.根据权利要求11所述的调配物，其中所述调配物包括约0.8％至约1.2％的白蛋白。16.根据权利要求11所述的调配物，其中所述调配物包括约1.0％的白蛋白。17.一种调配物，其包括：病毒载体；缓冲液；以及多糖。18.根据权利要求17所述的调配物，其中所述多糖是透明质酸钠、乙酰肝素、硫酸乙酰肝素、肝素、软骨素、硫酸软骨素、皮肤素、硫酸皮肤素、角质素、硫酸角质素、褐藻胶、壳聚糖、壳聚糖硫酸盐、葡聚糖、硫酸葡聚糖或其组合。19.根据权利要求17所述的调配物，其中所述多糖是透明质酸钠。20.根据权利要求17至19中任一项所述的调配物，其中所述调配物是液体。21.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.01ng/ml至约1mg/ml的多糖。22.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.05ng/ml至约0.5mg/ml的多糖。
23.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.1ng/ml至约0.3mg/ml的多糖。24.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.15ng/ml至约0.25mg/ml的多糖。25.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.2ng/ml的多糖。26.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.01ng/ml至约1mg/ml的透明质酸钠。27.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.05ng/ml至约0.5mg/ml的透明质酸钠。28.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.1ng/ml至约0.3mg/ml的透明质酸钠。29.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.15ng/ml至约0.25mg/ml的透明质酸钠。30.根据权利要求20所述的调配物，其中所述调配物包括约0.2ng/ml的透明质酸钠。31.根据权利要求1至8和17至30中任一项所述的调配物，其中所述调配物包括球状蛋白和多糖两者。32.根据权利要求9至30中任一项所述的调配物，其中所述调配物包括白蛋白和多糖两者。33.根据权利要求31或32所述的调配物，其中所述多糖是透明质酸钠。34.根据权利要求1至33中任一项所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约2mm至约100mm的缓冲液。35.根据权利要求1至33中任一项所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约5mm至约50mm的缓冲液。36.根据权利要求1至33中任一项所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约15mm至约25mm的缓冲液。37.根据权利要求1至33中任一项所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约20mm的缓冲液。38.根据权利要求1至37中任一项所述的调配物，其中所述缓冲液是磷酸钠、l-组氨酸、柠檬酸钠或其组合。39.根据权利要求1至38中任一项所述的调配物，其进一步包括糖。40.根据权利要求18所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约50mm至约500mm的糖。41.根据权利要求18所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约100mm至约400mm的糖。42.根据权利要求18所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约250mm至约350mm的糖。43.根据权利要求18所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约290mm的糖。44.根据权利要求39至43中任一项所述的调配物，其中所述糖是蔗糖、乳糖、葡萄糖、海
藻糖或其组合。45.根据权利要求39至43中任一项所述的调配物，其中所述糖是蔗糖。46.根据权利要求1至45中任一项所述的调配物，其进一步包括表面活性剂。47.根据权利要求46所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约0.01％至约0.1％的表面活性剂。48.根据权利要求25所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约0.015％至约0.025％的表面活性剂。49.根据权利要求25所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约0.02％的表面活性剂。50.根据权利要求46至49中任一项所述的调配物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20或kolliphor p188。51.根据权利要求1至49中任一项所述的调配物，其进一步包括氯化钠。52.根据权利要求51所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约10mm至约500mm的氯化钠。53.根据权利要求51所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约50mm至约300mm的氯化钠。54.根据权利要求51所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约100mm至约200mm的氯化钠。55.根据权利要求51所述的调配物，其中所述调配物是液体，并且其中所述调配物包括约150mm的氯化钠。56.根据权利要求1、2、9、10或17至19中任一项所述的调配物，其中所述调配物是冷冻干燥的固体。57.根据权利要求56所述的调配物，其中所述缓冲液是磷酸钠、l-组氨酸、tris、琥珀酸盐、柠檬酸钠或其组合。58.根据权利要求56或57所述的调配物，其进一步包括糖。59.根据权利要求58所述的调配物，其中所述糖是蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖或其组合。60.根据权利要求58所述的调配物，其中所述糖是蔗糖。61.根据权利要求56至60中任一项所述的调配物，其进一步包括表面活性剂。62.根据权利要求61所述的调配物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20或kolliphor p188。63.根据权利要求56至62中任一项所述的调配物，其进一步包括氯化钠。64.根据权利要求1至63中任一项所述的调配物，其中所述调配物的z平均值小于或等于约50nm。65.根据权利要求1至63中任一项所述的调配物，其中所述调配物的z平均值小于或等于约40nm。66.根据权利要求1至63中任一项所述的调配物，其中所述调配物的z平均值小于或等于约31nm。67.根据权利要求1至63中任一项所述的调配物，其中所述调配物的z平均值小于或等
于约25nm。68.根据权利要求1至63中任一项所述的调配物，其中所述调配物的z平均值小于或等于约20nm。69.根据权利要求1至68中任一项所述的调配物，其中所述调配物的多分散性指数小于或等于约0.5。70.根据权利要求1至68中任一项所述的调配物，其中所述调配物的多分散性指数小于或等于约0.35。71.根据权利要求1至68中任一项所述的调配物，其中所述调配物的多分散性指数小于或等于约0.3。72.根据权利要求1至71中任一项所述的调配物，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或杂交载体。73.根据权利要求1至72中任一项所述的调配物，其中所述病毒载体是腺病毒载体。74.根据权利要求1至73中任一项所述的调配物，其中所述调配物被调配用于向人施用。75.一种调配物，其包括：约10
×
108vg/ml至约10
×
10
13
vg/ml的病毒载体；约5mm至约40mm的磷酸钠；约200mm至约400mm的蔗糖；以及约0.1％至约5.0％的白蛋白。76.根据权利要求75所述的调配物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其组合。77.根据权利要求75或76所述的调配物，其包括约10
×
109vg/ml至约10
×
10
11
vg/ml的所述病毒载体。78.根据权利要求75至77中任一项所述的调配物，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体或杂交载体。79.一种调配物，其包括：约10
×
108vg/ml至约10
×
10
13
vg/ml的病毒载体；约5mm至约40mm的磷酸钠；约200mm至约400mm的蔗糖；以及约0.05mg/ml至约0.4mg/ml的透明质酸钠。80.根据权利要求79所述的调配物，其包括约10
×
109vg/ml至约10
×
10
11
vg/ml的所述病毒载体。81.根据权利要求79或80所述的调配物，其中所述病毒载体是腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或杂交载体。82.根据权利要求1至81中任一项所述的调配物，其中所述病毒载体在病毒颗粒中。83.根据权利要求82所述的调配物，其中所述病毒颗粒是感染性病毒颗粒。84.一种用于减少调配物中病毒载体聚集的方法，所述方法包括将所述病毒载体调配成根据权利要求1至83中任一项所述的调配物。83.一种制备病毒载体调配物的方法，所述方法包括：
a.获得包括病毒载体的组合物；b.向(a)的所述组合物中添加球状蛋白或多糖以形成所述调配物，其中所述球状蛋白或多糖以足以提供小于或等于约50nm的z平均值的量添加。84.根据权利要求83所述的方法，其中所述球状蛋白是白蛋白。85.根据权利要求84所述的方法，其中所述白蛋白是所述调配物的约0.1％至约5.0％。86.根据权利要求83所述的方法，其中所述多糖是透明质酸钠。87.根据权利要求86所述的方法，其中所述透明质酸钠是所述调配物的约0.05mg/ml至约0.4mg/ml的透明质酸钠。88.根据权利要求83至87中任一项所述的方法，其进一步包括将所述调配物储存一周或更长时间。89.根据权利要求88所述的方法，其包括将所述调配物储存超过一个月。90.根据权利要求83至89中任一项所述的方法，其中所述病毒载体在病毒颗粒中。91.一种制备病毒载体调配物的方法，所述方法包括：a.获得包括病毒载体的组合物；b.向(a)的所述组合物中添加球状蛋白或多糖以形成所述调配物，其中所述球状蛋白或多糖以足以提供小于或等于约0.5的多分散性指数的量添加。92.根据权利要求91所述的方法，其中所述球状蛋白是白蛋白。93.根据权利要求92所述的方法，其中所述白蛋白是所述调配物的约0.1％至约5.0％。94.根据权利要求91所述的方法，其中所述多糖是透明质酸钠。95.根据权利要求94所述的方法，其中所述透明质酸钠是所述调配物的约0.05mg/ml至约0.4mg/ml的透明质酸钠。96.根据权利要求91至95中任一项所述的方法，其进一步包括将所述调配物储存一周或更长时间。97.根据权利要求96所述的方法，其包括将所述调配物储存超过一个月。98.根据权利要求91至97中任一项所述的方法，其中所述病毒载体在病毒颗粒中。99.一种稳定病毒载体调配物以进行长期储存的方法，所述方法包括：a.获得包括病毒载体的组合物；b.向(a)的所述组合物中添加球状蛋白或多糖以形成所述调配物，其中所述球状蛋白或多糖以足以提供小于或等于约0.5的多分散性指数的量添加；c.将所述调配物储存超过一周。100.根据权利要求99所述的方法，其中将所述调配物储存超过一个月。101.根据权利要求99所述的方法，其中在向(a)的所述组合物中添加所述球状蛋白或多糖之后，将所述调配物冷冻干燥。

技术总结
提供了包括如白蛋白等球状蛋白的病毒载体调配物。还提供了包括如透明质酸等多糖的病毒载体调配物。所提供的病毒载体调配物具有增加的稳定性和减少的病毒载体聚集。加的稳定性和减少的病毒载体聚集。加的稳定性和减少的病毒载体聚集。


技术研发人员：艾哈迈德
受保护的技术使用者：隆萨有限公司
技术研发日：2021.05.28
技术公布日：2023/8/24