靶细胞限制性、共刺激性、双特异性二价抗CD28抗体的制作方法

靶细胞限制性、共刺激性、双特异性二价抗cd28抗体
技术领域
1.本发明提供了一种新的双特异性抗cd28抗体形式，其是二价的并且包含两个cd28结合位点和至少一个靶标结合位点。本发明的双特异性抗cd28抗体由于其严格的靶细胞限制性的共刺激活性而具有令人惊讶的优势。本发明的双特异性cd28抗体被提供用于单独或与诱导cd3/t细胞受体信号的另一双特异性抗体组合来治疗疾病。
2.描述
3.t细胞的活化是抗原特异性免疫反应启动的核心。在过去的几十年里，已经鉴定出许多塑造这一过程的t细胞表面受体。最重要的是抗原特异性t细胞受体(tcr)/cd3复合体。当mhc分子呈递的抗原肽与tcr结合时，通过复合体的cd3部分的信号(也称为“信号一”)，启动t细胞活化[1]。重要的是，为了获得有效和持续的反应，需要通过cd28、4-1bb或ox40等受体的另外的共刺激信号(“第二信号”)[2,3]。事实上，在缺乏此类信号的情况下，分离的tcr/cd3刺激可能最终导致t细胞无反应性或甚至死亡，因此共刺激信号似乎是有效的t细胞反应的核心先决条件[4,5]。
[0004]
参与t细胞活化的表面受体的鉴定是两种功能非常相似的策略的基础，这两种策略旨在招募对抗肿瘤细胞的t细胞[6]：
[0005]
·
用嵌合受体转染car t细胞，所述嵌合受体包含结合肿瘤相关抗原(taa)的抗体部分和cd3分子的细胞内信号基序[7]
[0006]
·
类似地，已经构建了与taa以及cd3分子结合的双特异性抗体(bsab)，这里称为bsabcd3[8]。
[0007]
这两种类型的试剂都能够独立于t细胞的抗原特异性将t细胞重定向至肿瘤细胞，并且已经在80年代末提出[9-13]。它们配备了针对cd19的抗体部分，如今已被稳固地建立用于b细胞衍生的白血病和淋巴瘤的治疗。然而，这两种试剂类型也有一个共同的主要副作用：过度的全身性t细胞活化导致——通常是严重的——剂量限制性细胞因子释放综合征[14]。然而，也有显著的区别：“第一代”car t细胞仅含有cd3衍生的信号基序，具有有限的治疗效率。只有当“第二代”car构建体配备有来自共刺激分子cd28和/或4-1bb的额外基序时，它们才能够发挥持久的治疗作用[15]。值得注意的是，在80年代末已经提出了具有taa
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cd3-和taa
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cd28的双特异性抗体的组合应用[16]，但尚未发展到监管批准阶段。这是由于实现这种方法所需的大量技术努力，但也由于2006年所谓的tegenero事件的负面影响，当时六名健康志愿者在超拮抗cd28抗体的输注期间经历了严重的细胞因子释放综合征，需要立即对所有参与者进行重症监护[17]。这显著地表明，刺激t细胞的抗体的激动活性将受到靶细胞的限制，也就是说，依赖于与相应靶抗原的结合，以避免临床应用中不可耐受的副作用。在实践中，这可以通过(i)选择合适的fc耗尽的抗体形式来防止t细胞被表达fcr的细胞而不是靶细胞活化，以及(ii)通过刺激性抗体的亲和力和/或价的仔细设计来实现。
[0008]
重组抗体技术为基于双功能和多功能抗体的分子的构建提供了多种形式[18]。基准bsab博纳吐单抗(blinatumomab)是一种具有cd19
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cd3特异性的抗体，具有所谓的双特异性t细胞衔接器(bite)形式，由两个由甘氨酸丝氨酸接头融合的单链抗体组成。由于fc部
分的缺乏以及cd3结合部分的单价性和相当低的亲和力，这种形式支持靶细胞限制性。然而，bite分子具有低分子量，导致相应的约1小时的低血清半衰期。这需要繁琐的连续输注方案。通过ch2结构域中的选定突变而fc减弱的基于全长igg的形式提供了相当大的半衰期的优点，但需要仔细设计，特别是如果t细胞刺激部分是二价的并且针对cd28而不是cd3。这是因为一般来说，二价形式的cd3抗体不会活化t细胞[19]。它们需要固定化，例如通过与表达fcr的细胞结合。相反，cd28抗体可以作为可溶性二价抗体递送有效的共刺激[20]。因此，原则上，似乎很难用含有二价cd28结合部分的taa
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cd28抗体实现靶细胞限制性活性。
[0009]
在本技术中，本发明描述了具有二价cd28结合部分的双特异性taa
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cd28抗体，该二价cd28结合部分为完全靶细胞限制性的，以避免在这些试剂的临床应用期间的系统性t细胞活化。
[0010]
即使实现了靶细胞限制，在几乎所有情况下，只要选定的靶抗原在正常健康组织上表达，特异性问题仍然存在。这导致了t细胞不理想的“肿瘤脱靶(off-tumor on target)”活化。这个问题的例子是众所周知的博纳吐单抗的副作用，博纳吐单抗是一种靶向cd19的bsabcd3，cd19是一种在正常b细胞和脑壁细胞上表达的抗原[21]。这导致脑组织中的系统性t细胞活化以及相应的剂量限制性副作用。为了解决这里举例说明的特异性问题，我们还建议在本技术中使用靶细胞限制性bicos与针对b7h3的taa
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tcr/cd3bsab的组合，b7h3是一种在肿瘤细胞和肿瘤血管系统上表达的taa。这些bsabcd3本身只诱导微弱的亚促有丝分裂(submitogenic)t细胞活化，因此在很大程度上依赖于bicos的存在。或者，亚促有丝分裂cd3刺激可以通过合适的低剂量促有丝分裂bsabcd3来实现。在任何情况下，如果这两种成分针对两种不同的靶标抗原，则这种bsab组合的特异性将大大增加，因为它们的活性取决于这两种不同靶标抗原的同时存在。
[0011]
综上所述，需要进一步的治疗选择，其允许肿瘤块的有效靶向，这可以通过靶向存在于肿瘤血管系统上的这种肿瘤相关抗原来实现。因此，本发明试图鉴定可用于癌症病症的治疗的抗体。
[0012]
发明简述
[0013]
通常，通过简要描述，本发明的主要方面可以描述如下：
[0014]
在第一方面，本发明涉及结合分子，其至少是双特异性的，包括至少两个第一抗原结合位点和至少一个第二抗原结合位点，用于受试者的疾病的治疗，其中
[0015]
·
所述至少两个第一抗原结合位点能够特异性结合t细胞特异性表面糖蛋白cd28的表位；和
[0016]
·
所述至少一个第二抗原结合位点能够结合在受试者中与疾病相关的细胞上或细胞中表达的抗原靶蛋白的表位；
[0017]
其中所述治疗包括向所述受试者施用所述结合分子。
[0018]
在备选的方面，本发明还涉及内皮糖蛋白结合分子，其包含至少具有序列rnyvtgfdy(seq id no:16)的重链互补决定区(cdr)3，或与该序列相比具有不超过3、2，优选不超过1个氨基酸突变的序列；和具有序列hqylssyt(seq id no:20)的轻链cdr3，或与该序列相比具有不超过3、2，优选不超过1个氨基酸突变的序列。
[0019]
在第二方面，本发明涉及分离的核酸，其包含编码第一方面中任一项的结合分子、或结合分子的抗原结合片段或单体(例如重链或轻链)的序列。
[0020]
在第三方面，本发明涉及核酸构建体(nac)，其包含第二方面的核酸和一个或多个另外的序列特征，所述序列特征允许编码的结合分子或所述结合分子的组分或(例如抗体重链或轻链)在(宿主)细胞中的表达。
[0021]
在第四方面，本发明涉及包含根据第二方面或第三方面的核酸或nac的重组宿主细胞。
[0022]
在第五方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包括：(i)第一方面的结合分子，或(ii)第二方面或第三方面的核酸或nac，或(iii)根据第四方面的重组宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稳定剂和/或赋形剂。
[0023]
在第六方面，本发明涉及包装或药物组合物的试剂盒，所述试剂盒在单独的容器中包含：(i)前述任一方面中所述的分离的结合分子、编码所述分离的结合分子的分离的核酸、和/或包含这样的核酸或分离的结合分子的重组宿主细胞；和(ii)前述任一方面中所述的分离的另外的结合分子、编码所述分离的另外的结合分子的分离的核酸、和/或包含这样的核酸或分离的另外的结合分子的重组宿主细胞。
[0024]
在第七方面，本发明涉及用于药物的组分，其中所述组分选自由以下组成的列表：(i)第一方面的结合分子，或(ii)第二方面或第三方面的核酸或nac，或(iii)根据第四方面的重组宿主细胞和(iv)根据第五方面或第六方面的药物组合物或试剂盒。
[0025]
发明详述
[0026]
在下文中，将描述本发明的元件。这些元件与特定的实施方案一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建另外的实施方案。多方面描述的实施例和优选的实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应理解为支持并涵盖将两个或多个明确描述的实施方案相结合的实施方案，或将一个或多个明确描述的实施方案与任何数量的公开的和/或优选的元件相结合的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则本技术中所有描述的元件的任何排列和组合都应被认为是由本技术的描述所公开的。
[0027]
在第一方面，本发明涉及结合分子，其至少是双特异性的，包括至少两个第一抗原结合位点和至少一个第二抗原结合位点，其中
[0028]
·
所述至少两个第一抗原结合位点能够特异性结合t细胞特异性表面糖蛋白cd28的表位；和
[0029]
·
所述至少一个第二抗原结合位点能够结合在与疾病相关的细胞上或细胞中表达的抗原靶蛋白的表位。
[0030]
本发明的结合分子优选用于受试者疾病的治疗，其中所述治疗包括向受试者施用所述结合分子。
[0031]
在一些具体实施方案中，所述至少两个第一和/或所述至少一个第二抗原结合位点衍生自抗体或抗体样分子，并且其中所述至少两个第一抗原结合位点各自提供为抗体的抗原结合片段，所述抗体的抗原结合片段不是f(ab')2或fab，并且优选为单链构建体，最优选为单链fv(scfv)。
[0032]
在本发明的一些实施方案中，当在不存在表达抗原靶蛋白的第二细胞的情况下与为cd28阳性免疫细胞的第一细胞(例如t细胞)接触时，结合分子不诱导cd28信号传导，并且优选不活化免疫细胞(t细胞)。
[0033]
在本发明的一些优选实施方案中，抗原靶蛋白选自在与增殖性病症相关的细胞上表达的蛋白、与病原生物(如寄生虫、病毒或细菌)相关的蛋白或其他分子。例如，抗原靶蛋白可以选自内皮糖蛋白、cd105、psma、flt3、b7h3或fab。
[0034]
在一些实施方案中，所述至少两个第一抗原结合位点中的每一个可以与所述至少一个第二抗原结合位点直接连接，例如共价或非共价连接。
[0035]
结合分子的优选实施方案包括至少两个第二抗原结合位点。
[0036]
在本发明的一个优选实施方案中，本文公开的结合分子包含精确且不超过两个第一抗原结合位点和精确且不超过一个或两个第二抗原结合位点。
[0037]
本发明的其他优选实施方案涉及第一方面的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点结合cd28上的相同表位，优选其中所述至少两个抗原结合位点是相同的。
[0038]
在一些实施方案中，优选的是，所述至少两个第一抗原结合位点和所述至少一个第二抗原结合位点中的至少一个通过包含一个或多个抗体衍生的人恒定结构域(优选igg的恒定结构域)的蛋白接头彼此连接，例如它们通过人igg衍生的铰链ch1、ch2和/或ch3连接。
[0039]
在本发明的优选实施方案中，所述至少两个第一抗原结合位点包含抗体重链序列和抗体轻链序列(优选至少cdr1至cdr3)，各自衍生自包含在seq id no:2，3，4，或5所示的抗体序列中的c末端结合位点(scfv)(或包含在seq id no:7/8和9所示的抗体序列中的n末端结合位点)，并竞争性结合至与包含在seq id no:2，3，4，或5所示的抗体序列中的c末端结合位点(scfv)(或包含在seq id no:7/8和9所示的抗体序列中的n末端结合位点)相同的抗原。
[0040]
在优选的实施方案中，本发明涉及结合分子，其中所述至少一个第二抗原结合位点包含抗体重链序列和抗体轻链序列，它们各自衍生自包含在seq id no:1和2/3组成的抗体中的n末端结合位点(或包含在seq id no:7/8和9所示的抗体序列中的c末端结合位点)，并竞争性结合至与包含在seq id no:1和2/3组成的抗体中的n末端结合位点(或包含在seq id no:7/8和9所示的抗体序列中的n末端结合位点)相同的抗原(表位)。
[0041]
在本发明的优选实施方案中，结合分子特异性结合免疫细胞和与疾病相关的细胞，优选其中所述免疫细胞是参与细胞介导的免疫应答的免疫细胞，例如细胞毒性免疫应答或辅助细胞介导的免疫应答。这种免疫细胞是细胞毒性或辅助细胞，例如表达cd28和cd3(以及tcr)的细胞，并且优选是t细胞。
[0042]
用于本发明的双特异性抗体并介导与cd28结合的抗体可变重链和轻链序列优选在一些实施方案中衍生自cd28抗体克隆hu9.3.8.v1。特别优选在重链和轻链序列中具有氨基酸修饰的抗cd28 scfv构建体，如图12或seq id no:24所示。优选地，在本发明的上下文中使用的抗cd28 scfv应包含与seq id no:24具有至少90％序列同一性的序列，优选地，其中这样的抗cd28 scfv或序列变体至少包含seq id no:24中所示的位置3处的氨基酸q，并包含seq id no:24中所示的位置16处的氨基酸q；并且包含seq id no:24中所示的位置64处的氨基酸q；并且包含seq idno:24中所示的位置67处的氨基酸f；并且包含seq id no:24中所示的位置160处的氨基酸t。
[0043]
在本发明的某些备选方面，还提供了抗cd28 scfv，其在重链和轻链序列(不包括接头)中包含与seq id no:24中所示序列具有至少90％序列同一性、优选95％序列同一性、
最优选100％序列同一性的氨基酸序列，任选地，其中所述接头序列可以是可变长度的4gs接头，优选其中这样的抗cd28 scfv具有seq id no:24中所示的序列。
[0044]
对于根据本发明的医疗用途，受试者的特征优选在于cd3/tcr信号传导通过治疗被激活，或内源性地响应于疾病相关抗原，例如抗原蛋白。在本上下文中，优选的是，所述治疗进一步包括针对与疾病相关的细胞进行免疫细胞的刺激和/或活化，例如t细胞的活化和/或刺激。
[0045]
在一个另外的实施方案中，本发明的结合分子是优选的，其中所述结合分子包括相等数量的第一和第二抗原结合位点，并且其中所述至少两个第一抗原结合位点中的一个末端连接(通过肽键)至所述至少两个第二抗原结合位点中的一个的轻链(或备选地重链)，并且其中所述至少两个第一抗原结合位点中的另一个末端连接(通过肽键)至所述至少两个第二抗原结合位点中的另一个的轻链(或备选地重链)。本实施方案中的末端连接是指如本文其他地方所述的直接或通过肽接头序列与氨基酸链的连接。
[0046]
在进一步优选的实施方案中，本发明的结合分子包括两个抗体重链序列和两个抗体轻链序列，并且其中
[0047]
·
所述至少两个第一抗原结合位点中的一个与所述两条抗体轻链序列中的一条的c末端共价连接，并且所述至少两个第一抗原结合位点中的另一个与两条抗体轻链序列中的另一条的c末端共价连接；或
[0048]
·
所述至少两个第一抗原结合位点中的一个共价连接至所述两条抗体重链序列中的一条的c末端，并且所述至少两个第一抗原结合位点中的另一个共价连接至两个抗体重链序列中的另一条的c末端。
[0049]
本发明提供了新的cd28双特异性抗体形式，其包括基于igg的抗原结合位点和(更柔性的)scfv抗cd28结合位点。在本上下文中，在优选的实施方案中，本发明涉及结合分子，其中所述结合位点在没有肽接头的情况下或通过具有不超过5个氨基酸的短肽接头，或通过具有至少6个、优选最多50个氨基酸的长肽接头连接，其中进一步优选所述肽接头是(ggggs)n接头，并且n大于或等于2，例如n＝2-40、2-30或2-20。
[0050]
在本发明的另一个实施方案中，接头可以具有上式序列，且n＝3至6，优选4，并且在序列末端具有另外的-ggs-。
[0051]
因此，本发明的结合分子是优选的，其中所述至少一个第二抗原结合位点包含fab、f(ab')2或最优选igg。
[0052]
在本发明的另一个具体实施方案中，将针对cd28的结合分子与介导未活化t细胞中cd3/tcr信号传导轴活化的另一结合分子组合使用。因此，优选的治疗包括顺序或伴随施用(i)另一结合分子，其是双特异性的并且能够特异性结合(和活化)t细胞，例如通过结合cd3和/或t细胞受体(tcr)；或能够提供或增强t细胞活化信号的任何其他试剂，如(ii)表达抗原受体(如嵌合抗原受体(car))的遗传修饰的免疫细胞(异源或自体t细胞)，该受体能够特异性结合抗原靶蛋白，或(iii)提供来自传染剂或癌细胞的抗原结构(taa或tsa)的疫苗，或(iv)通过检查点分子如pd1、pdl1、ctla4等阻断抑制性“第二信号”的试剂。这些试剂称为检查点抑制剂。
[0053]
这种另外的结合分子是至少双特异性的，并且包括至少一个第三抗原结合位点和至少一个第四抗原结合位点，其中
[0054]
·
所述至少一个第三抗原结合位点能够特异性结合cd3和/或t细胞受体(tcr)(cd3/tcr)；和
[0055]
·
所述至少一个第四抗原结合位点能够特异性结合在与受试者的疾病相关的细胞上或细胞中表达的另一抗原靶蛋白的表位。
[0056]
在本发明涉及结合分子和另外的结合分子组合的用途的上下文中，抗原靶蛋白和另外的抗原靶蛋白是(i)相同或(ii)不同，但在空间上彼此非常接近，例如在与疾病相关的同一细胞上表达或位于同一疾病组织中，例如在同一肿瘤环境中表达。在该实施方案中，备选方案(ii)是优选的，因为为两种结合分子选择两种不同的抗原蛋白允许更严格的靶细胞限制性和更严格的t细胞活化的调节用于治疗。
[0057]
通过本发明的化合物/组合物和方法治疗的疾病优选增殖性疾病，优选选自癌症疾病，例如癌症，例如肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨髓瘤、肾癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌或前列腺癌，特别是从由以下项组成的列表中选择的一种：黑色素瘤、肺癌(例如非小细胞肺癌)、膀胱癌(例如尿路上皮癌)、肾癌(例如肾细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)和霍奇金淋巴瘤。优选地，增殖性疾病是黑色素瘤或肺癌(例如非小细胞肺癌)，优选是靶抗原蛋白表达阳性的癌症。
[0058]
包含靶向cd28的抗原结合蛋白的结合分子
[0059]
本文所用的“抗原结合蛋白”(“abp”)是指本发明结合分子的一个或多个结合位点由特异性结合靶抗原的蛋白提供，例如靶抗原展示或存在于靶抗原上的一个或多个表位。本发明的abp的一个中心抗原是cd28或其直系同源物(或旁系同源物)或其其他变体；并且abp可以任选地结合所述cd28或变体的一个或多个结构域(例如所述表位可以由所述28或变体中的一个或者多个胞外结构域展示或者存在于所述胞外结构域上)。通常，抗原结合蛋白是抗体(或其片段)，然而本发明也设想了其他形式的抗原结合蛋白。例如，abp可以是衍生自小型且稳健的非免疫球蛋白“支架”的另一种(非抗体)受体蛋白，例如通过使用组合蛋白设计方法配备有结合功能的支架(gebauer&skerra,2009；curr opin chem biol,13:245)。这种非抗体abp的具体实例包括：基于蛋白质a的z结构域的亲和体(affibody)分子(nygren,2008；febs j 275:2668)；基于γ-b结晶和/或泛素的affilin(ebersbach et al,2007；j mo biol,372:172)；基于半胱氨酸蛋白酶抑制剂的affimer(johnson et al,2012；anal chem 84:6553)；基于来自嗜酸热硫化叶菌(sulfolobus acidcaldarius)的sac7d的affitin(krehenbrink et al,2008；j mol biol 383:1058)；基于三螺旋卷曲螺旋的alphabodies(desmet et al,2014；nature comms 5:5237)；基于脂质运载蛋白的抗运载蛋白(anticalin)(skerra，2008；febs j 275:2677)；基于各种膜受体的a结构域的avimers(silverman et al,2005；nat biotechnol 23:1556)；基于锚蛋白重复基序的darpins(strumpp et al,2008；drug discov today,13:695)；基于fyn的sh3结构域的fynomers(grabulovski et al,2007；j biol chem 282:3196)；基于各种蛋白酶抑制剂的kunitz结构域的kunitz结构域肽(nixon et al,curr opin drug discov devel,9:261)和基于纤连蛋白第10个iii型结构域的centyrins和monobodys(diem et al.,2014；protein eng des sel 27:419doi:10.1093/protein/gzu016；koide&koide,2007；methods mol biol 352:95)。
[0060]
术语“表位”包括能够被抗原结合蛋白例如抗体结合的任何决定簇。表位是抗原的
一个区域，其由靶向该抗原的抗原结合蛋白结合，并且当抗原是蛋白质时，其包括结合抗原结合蛋白的特异性氨基酸(例如通过所述蛋白的抗原结合结构域)。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。通常，对特定靶抗原特异的抗原结合蛋白将优先识别蛋白质和/或大分子复杂混合物中靶抗原上的表位。
[0061]
当抗原结合蛋白与一种抗原(例如cd28、cd3、内皮糖蛋白等；如人cd28)的结合比其与第二种抗原的结合更优先(如更强烈或更广泛)时，它是“特异性的”。本文在abp的上下文中使用的术语“特异性结合(specifically binds)”(或“特异性结合(binds specifically)”等)是指所述abp将优先与所需抗原结合，而不是与其他蛋白质(或其他分子)结合，例如与一种或多种其他免疫球蛋白(ig)超家族基因相比优先与所需抗原结合。因此，优选地，abp对一种抗原(例如cd28)的结合亲和力是其与其他靶标(例如不相关的蛋白质如小鼠或人fc结构域或链霉亲和素)的亲和力的至少2倍、5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少2000倍、至少5000倍、至少10000倍、至少105倍或甚至至少106倍，最优选至少2倍。
[0062]
术语“同一性”是指两个或多个多肽分子或两个或多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列确定的。“同一性百分比”是指被比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并根据被比较的分子的最小大小计算。对于这些计算，比对中的空位(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在computational molecular biology,(lesk,a.m.,ed.),1988,new york:oxford university press；biocomputing informatics and genome projects,(smith,d.w.,ed.),1993,new york:academic press；computer analysis of sequence data,part i,(griffin,a.m.,and griffin,h.g.,eds.),1994,new jersey:humana press；von heinje,g.,1987,sequence analysis in molecular biology,new york:academic press；sequence analysis primer,(gribskov,m.和devereux,j.,eds.),1991,new york:m.stockton press和carillo et al.,1988,siam j.applied math.48:1073中描述的那些。
[0063]
在计算同一性百分比时，被比较的序列通常以在序列之间给出最大匹配的方式比对。可用于确定同一性百分比的计算机程序的一个例子是gcg程序包，其包括gap(devereux et al.,1984,nucl.acid res.12:387；genetics computer group,university of wisconsin,madison,wi)。计算机算法gap用于比对待确定其序列同一性百分比的两种多肽或多核苷酸。对序列进行比对，以实现各自氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨度”，如通过算法确定的)。空位开放罚分(其被计算为平均对角线的3倍，其中“平均对角线”是所用比较矩阵对角线的平均值；“对角线”是特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的分数或数字)和空位扩展罚分(其通常是空位开放罚分的1/10倍)，以及诸如pam 250或blosum 62之类的比较矩阵与该算法一起使用。
[0064]
算法也可以使用标准比较矩阵(参见dayhoff et al.,1978,atlas of protein sequence and structure 5:345-352，用于pam250比较矩阵；henikoff et al.,1992,proc.natl.acad.sci.u.s.a.89:10915-10919，用于blosum 62比较矩阵)。
[0065]
可用于使用gap程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分比的参数的实例如下：
(i)算法：needleman et al.,1970,j.mol.biol.48:443-453；(ii)比较矩阵：henikoff et al.,1992，同上的blosum 62；(iii)空位罚分：12(但末端空位不罚分)；(iv)空位长度罚分：4；(v)相似性阈值：0。
[0066]
确定蛋白质或核酸与(或)人cd28或本发明的结合分子之间的相似性的优选方法是由uniprot supra(例如,http://www.uniprot.org/uniprot)支持的blast搜索提供的方法；特别是对于氨基酸同一性，那些使用以下参数：程序：blastp；矩阵：blosum62；阈值：10；过滤：false；空位的：true；报告的最大命中数：250。
[0067]
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可能导致两个序列中仅短区域的匹配，并且即使两个全长序列之间没有显著关系，这个小的、比对的区域也可能具有非常高的序列同一性。因此，如果需要，可以调整所选择的比对方法(gap程序)，以产生跨越靶多肽或其区域的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50或其他数量的连续氨基酸的比对。
[0068]
在特定实施方案中，本发明的abp可以优选地包含至少一个互补决定区(cdr)，例如来自抗体(特别是来自人抗体)的互补决定区，并且在特定实施方式中，abp可以包含具有与seq id no:1-11所示的抗体序列中包含的cdr序列相比具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性(优选至少90％序列同一性)或具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列的cdr。
[0069]
本文中使用的术语“互补决定区”(或“cdr”或“高变区”)泛指在抗体轻链或重链的可变区中发现的一个或多个高变或互补决定区(cdr)。参见，例如：“imgt”,lefranc et al,20003,dev comp immunol 27:55；honegger&pl
ü
ckthun,2001,j mol biol 309:657,abhinandan&martin,2008,mol immunol 45:3832,kabat,et al.(1987):sequences of proteins of immunological interest national institutes ofhealth,bethesda,md。这些表达包括由kabat et al(1983)sequences of proteins of immunological interest,us dept of health and human services定义的高变区，或抗体的三维结构中的高变环(chothia和lesk,1987；j mol biol 196:901)。每条链中的cdr被框架区保持在接近的位置，并且与来自另一条链的cdr一起，有助于抗原结合位点的形成。在cdr中，存在被描述为选择性决定区(sdr)的选择性氨基酸，其代表在抗体-抗原相互作用中cdr使用的关键接触残基。(kashmiri,2005；methods 36:25)。
[0070]
本发明的abp可备选地或与cdr3序列一起包含至少一个cdr1和/或至少一个cdr2(例如来自抗体的，特别是来自人抗体的)。优选地，并且本发明的abp包括至少一个这样的cdr3，以及至少一个这样的cdr1和至少一个这样的cdr2，更优选地，其中每一个这样的cdr具有与选自seq id no:1至12中所示的任何序列中包含的相应(重链和轻链)cdr1、cdr2和cdr3序列的序列相比具有至少80％、85％、90％或95％(优选至少90％)序列同一性或具有不超过三个或两个，优选不超过一个氨基酸取代、缺失或插入的氨基酸序列。
[0071]
在特定实施方案中，本发明的abp可以是抗体或其抗原结合片段。
[0072]
如本文所用，术语“抗体”在最广义上可以理解为能够与其表位结合的任何免疫球蛋白(ig)。抗体本身就是一种abp。全长“抗体”或“免疫球蛋白”通常是约150kda的异源四聚糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数量不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫桥。每条重链具有一个氨基末端可变结构域(vh)，随后是三个羧基末端恒
定结构域(ch)。每条轻链具有可变的n末端结构域(vl)和单个的c末端恒定结构域(cl)。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，中间散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：fr1,cdr1,fr2,cdr2,fr3,cdr3,fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与细胞或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。其他形式的抗体包括重链抗体，重链抗体仅由两条重链组成，缺乏通常在抗体中发现的两条轻链。重链抗体包括骆驼科动物(如单峰骆驼、骆驼、美洲驼和羊驼)的hcigg(igg样)抗体，以及软骨鱼类(例如鲨鱼)的ignar抗体。还有其他形式的抗体包括单域抗体(sdab，开发者ablynx称之为纳米抗体(nanobody))，它是一种由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单域抗体通常由重链抗体产生，但也可能衍生自常规抗体。
[0073]
抗体(或可从中分离其片段的抗体)可包括，例如，具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合、人源化、(完全)人或杂合抗体、抗体片段和抗体亚片段，例如fab、fab’或f(ab')2片段、单链抗体(scfv)等(如下所述)，包括任何免疫球蛋白或任何天然、合成或基因工程蛋白的杂合片段，其通过与特定抗原结合形成复合体而像抗体一样发挥作用。
[0074]
因此，在某些实施方案中，本发明的abp可以包含抗体重链或其抗原结合片段，和/或抗体轻链或其抗原结合片段。
[0075]
在进一步的实施方案中，本发明的abp可包含抗体重链可变区或其抗原结合片段，和/或抗体轻链可变区，或其抗原结合片段，并且在又进一步的实施方案中，本发明的abp可包括抗体重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，和/或抗体轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3。
[0076]
本发明涉及“双特异性”或“双功能”的结合分子，并且优选是具有两个不同表位/抗原结合结构域(或“位点”)的abp，并且因此对两个不同的靶表位具有结合特异性。这两个表位可以是同一抗原的表位，或者，如本发明中优选的，是不同抗原，例如不同抗原内皮糖蛋白和cd3/tcr的表位。
[0077]“双特异性abp”可以是将一个抗原或表位与两个或多个结合臂中的一个结合的abp，所述两个或多个结合臂由第一对重链和轻链或主链和短链/小链定义，并且结合第二臂上不同的抗原或表位，所述第二臂由第二对重链或轻链或主链和小链定义。这种双特异性abp的实施方案在特异性和cdr序列中都具有两个不同的抗原结合臂。通常，双特异性abp对于与其结合的每个抗原都是单价的，也就是说，它仅用一个臂与相应的抗原或表位结合。然而，双特异性抗体也可以被二聚化或多聚化，这在本发明的上下文中是优选的。例如，在本文所述的二聚体iggsc形式中，抗体对每种抗原具有两个结合位点(图3a-f)。双特异性抗体可以是杂合abp，其可以具有由第一轻链可变区和第一重链可变区定义的第一结合区，以及由第二轻链可变区和第二重链可变区定义的第二结合区。本发明设想，这些结合区中的一个可以由重链/轻链对定义。在本发明的上下文中，双特异性结合分子可以具有由主链和小链的可变区定义的第二抗原结合位点和由结合分子主链中包含的scfv片段的可变区定义的第一个不同的结合位点。
[0078]
制备双特异性abp的方法是本领域已知的，例如两种不同单克隆抗体的化学缀合，或者例如两种抗体片段的化学缀合，例如两种fab片段的化学缀合。备选地，双特异性abp是通过四源杂交瘤(quadroma)技术制造的，即通过产生亲本抗体的杂交瘤的融合。由于h链和
l链的随机分配，产生了十种不同抗体结构的潜在混合物，其中只有一种具有所需的结合特异性。
[0079]
本发明的双特异性abp可以作为针对每种靶标的单克隆抗体(mab)。在一些实施方案中，抗体是嵌合的、人源化的或完全人的。双特异性abp可以例如是双特异性串联单链fv、双特异性fab2或双特异性双抗体。
[0080]
基于包括在本发明的abp中的结构域，本发明的双特异性abp可以包含fab片段，其通常包括铰链区、ch2结构域和单链fv片段。这种双特异性abp被称为“fabsc
”‑
abp，并在国际专利申请wo 2013/092001中首次进行了描述。更具体地，本文使用的“fabsc”形式abp通常是指具有fab片段的本发明的双特异性abp，该fab片段通常包括铰链区，该铰链区位于连接到ch2结构域的n末端的fab片段的c末端，ch2结构域的c末端又连接到scfv片段的n末端。这样的“fabsc”不包含或基本上不包含ch3结构域。在该上下文况下，“不包含”或“基本上不包含”意味着abp不包含全长ch3结构域。这优选地意味着abp包含ch3结构域的10个或更少、优选5个或更少，优选3个或甚至更少的氨基酸。
[0081]
根据coloma和morrison的出版物(nat biotechnol 15:159-63,1997)，本发明的双特异性abp可以具有fab片段，fab片段通常可以包括铰链区、ch2结构域、ch3结构域(通常布置在ch2结构域的c末端)和单链fv片段。这种分子在本文中也被称为“iggsc”形式的abp，并且是指具有fab片段的本发明的双特异性abp，该fab片段通常包括铰链区，该铰链区位于通常连接到ch2结构域的n末端的fab片段的c末端，ch2结构域的c末端又通常连接到ch3结构域的n末端，ch3结构域的c末端又通常连接到scfv片段的n末端。iggsc形式abp的示例如图3所示。在本发明的上下文中，这样的双特异性abp形式是优选的。
[0082]
此外，或备选地，本发明的“iggsc”abp也可以具有“fc减弱的”ch2结构域(其包括铰链区)。这种“fc减弱”是通过缺失和/或取代(突变)ch2结构域中至少一个能够介导与fc受体的结合的选定氨基酸残基来实现的。在说明性实施方案中，能够介导与fc受体结合并且缺乏或突变的铰链区或ch2结构域的至少一个氨基酸残基选自由序列位置228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327和330(根据eu索引对序列位置进行编号)组成的组。在说明性的实例中，这种fc减弱的abp可以包含至少一个突变，所述突变选自由以下项组成的组：氨基酸228的缺失、氨基酸229的缺失、氨基酸230的缺失、氨基酸231的缺失、氨基酸232的缺失、氨基酸233的缺失、取代glu233
→
pro、取代leu234
→
val、氨基酸234的缺失、取代leu235
→
ala、氨基酸235的缺失、氨基酸236的缺失、氨基酸237的缺失、氨基酸238的缺失、取代asp265
→
gly、取代asn297
→
gln、取代ala327
→
gln，和取代ala330
→
ser(根据eu索引对序列位置进行编号，例如也参见国际专利申请wo 2013/092001的图1o和图1p)。在激活t细胞(例如针对肿瘤细胞)的双特异性抗体的情况下，可能需要fc减弱以防止抗体与携带fc受体的细胞的结合，其可能导致t细胞的不期望的脱靶激活。
[0083]
在本发明的一个优选实施方案中，cd28共刺激抗体是fc沉默的，并通过组合所谓的lala-fc突变体和yte突变体进行半衰期优化。这两种修饰在本领域中是众所周知的，并且例如在saunders ko.conceptual approaches to modulating antibody effector functions and circulation half-life.front immunol.2019；10:1296.published 2019jun 7.doi:10.3389/fimmu.2019.01296中进行了详细解释，其全部内容纳入本文。通常，这些突变是在人类ch结构域中发现的。yte的特征是突变met252tyr/ser254thr/
thr256glu(还参见dall'acqua wf,woods rm,ward es,palaszynski sr,patel nk,brewah ya,et al..increasing the affinity of ahuman igg1 for the neonatal fc receptor:biological consequences.j immunol.(2002)169:5171-80.10.4049/jimmunol.169.9.5171)。lala修饰为leu234ala/leu235ala(还参见hezareh m,hessell aj,jensen rc,van de winkel jg,parren pw.effector function activities of a panel of mutants of abroadly neutralizing antibody against human immunodeficiency virus type 1.jvirol.2001；75(24):12161-12168.doi:10.1128/jvi.75.24.12161-12168.2001)。
[0084]
因此，在优选实施方案中，本发明的abp包括lala和yte修饰两者的组合，并且因此包括分别在seq id no:12和13中示出的ch结构域的序列。
[0085]
本发明的cd28共刺激抗体的iggsc形式令人惊讶地有效，因为与通常已知的较小的仅基于scfv的双特异性抗体(如bite抗体)不同，由于它们的半衰期缩短和通常观察到的多聚化能力，显示出对cd28的使用不太有利。后者控制起来很复杂，可能承受诱导超激动作用的风险。另一方面，cd28的基于igg的形式具有使细胞限制性成为不可能的超激动活性。本文提出使用iggsc作为cd28双特异性形式，如果cd28结合位点作为iggsc中的scfv提供的话，则其在以靶细胞限制性的方式活化t细胞方面令人惊讶地有效，同时仍然只是共刺激而不是超激动的。
[0086]
抗体形式iggsc具有两个共同点，即n末端靶向部分分别由“生理”fab-或fab2区组成，从而避免在分子的这一部分使用单链部分。如果这些形式用于靶细胞限制性t细胞活化，则可以使用fc受体(fcr)结合的减弱(如果想要或需要)来防止fcr介导的活化。这可以例如通过在分子的ch2结构域中引入如上文以及国际专利申请wo 2013/092001和armour et al.eur j immunol 1999；29:2613中所述的定义的和众所周知的突变来实现。因此，本发明的iggsc abp也可以具有ch2结构域(包括铰链区)，其中能够介导与fc受体的结合的铰链区或ch2结构域的至少一个氨基酸残基缺乏或突变。如上所述，ch2和铰链区中的该残基可以分别选自由以下项组成的组：序列位置228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327和330(根据eu索引对序列位置进行编号)。然而，由于iggsc分子中ch3结构域的存在，两个单独的分子将(自发地)通过ch3结构域同型二聚体化，形成四价分子(在这方面，再次见图1b)。因此，不需要缺失或突变铰链区的序列位置226和/或序列位置229处的半胱氨酸残基。因此，根据kabat编号[eu索引]，本发明的这种四聚体iggsc abp可以在相应铰链结构域之一的序列位置226和/或序列位置229处具有半胱氨酸残基。
[0087]
在优选的实施方案中，本发明涉及分离的结合分子，其为abp：
[0088]
·
包含seq id no:4或5所示的两个抗体重链序列，或与这些序列中的任一项具有至少80％、85％、90％或95％(优选至少90％)序列同一性的序列，和seq id no:6所示的两个抗体轻链序列，或与该序列具有至少80％、85％、90％或95％(优选至少90％)序列同一性的序列；在每种情况下，与这些序列相比，独立地、任选地具有不超过十个、九个、优选地不超过八个、七个、六个、五个、四个或三个或两个、优选不超过一个氨基酸取代、插入或缺失；或
[0089]
·
包含seq id no:1所示的两个抗体重链序列，或与该序列具有至少80％、85％、90％或95％(优选至少90％)序列同一性的序列，和seq id no:2或3所示的两个抗体轻链序
列，或与这些序列具有至少80％、85％、90％或95％(优选至少90％)序列同一性的序列；在每种情况下，与这些序列相比，独立地、任选地具有不超过十个、九个、优选地不超过八个、七个、六个、五个、四个或三个或两个、优选不超过一个氨基酸取代、插入或缺失；或
[0090]
·
包含seq id no:7或8所示的两个抗体重链序列，或与这些序列中的任一项列具有至少80％、85％、90％或95％(优选至少90％)序列同一性的序列，和seq id no:9所示的两个抗体轻链序列，或与该序列具有至少80％、85％、90％或95％(优选至少90％)序列同一性的序列；在每种情况下，与这些序列相比，独立地、任选地具有不超过十个、九个、优选地不超过八个、七个、六个、五个、四个或三个或两个、优选不超过一个氨基酸取代、插入或缺失；或
[0091]
在备选的方面，本发明涉及分离的结合分子，其是特异性结合内皮糖蛋白的abp，其中abp：
[0092]
·
包含seq id no:1所示的两个抗体重链序列，或与该序列具有至少80％、85％、90％或95％(优选至少90％)序列同一性的序列，和seq id no:6所示的两个抗体轻链序列，或与该序列具有至少80％、85％、90％或95％(优选至少90％)序列同一性的序列；在每种情况下，与这些序列相比，独立地、任选地具有不超过十个、九个、优选地不超过八个、七个、六个、五个、四个或三个或两个、优选不超过一个氨基酸取代、插入或缺失。
[0093]
在上述基于abp的结合分子的优选实施方案中，cdr区与参考seq id no的相应cdr序列相同。
[0094]
根据双特异性abp的公开，本发明进一步提出使用具有抗原结合位点的另外(进一步)的结合分子，所述抗原结合位点特异性结合免疫细胞(如t细胞或nk细胞)上的另一受体以及靶细胞上的抗原。存在于免疫细胞上的这种受体可以是能够活化免疫细胞或刺激免疫细胞的免疫应答的受体。诱发的免疫应答可以优选地是细胞毒性免疫应答。这种合适的受体例如可以是cd3、抗原特异性t细胞受体(tcr)、cd16、nkg2d、ox40、4-1bb、cd2、cd5、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)和cd95。特别优选的是其中第二结合位点与cd3、tcr或cd16结合的abp。
[0095]
本文中所用的术语“分离的”在蛋白质(如abp(其实例可以是抗体))的上下文中是指蛋白质，该蛋白质从会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白质或多肽或其他污染物中纯化出来。根据本发明的分离的abp可以是重组的、合成的或修饰的(非天然的)abp。本文中使用的术语“分离的”在核酸或细胞的上下文中是指核酸或细胞，所述核酸或细胞从会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的dna、rna、蛋白质或多肽或其他污染物(如其他细胞)中纯化出来，或者它指重组、合成或修饰的(非天然)核酸。优选地，分离的abp或核酸或细胞基本上是纯的。在这种情况下，“重组”蛋白质或核酸是使用重组技术制成的。生产重组核酸和蛋白质的方法和技术是本领域众所周知的。
[0096]
本文中使用的术语“分离的”在结合分子如abp(其实例可以是抗体)的上下文中是指从蛋白质或多肽或其他污染物中纯化的蛋白质，这些污染物会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途。根据本发明的分离的abp可以是重组的、合成的或修饰的(非天然的)abp。本文中使用的术语“分离的”在核酸或细胞的上下文中是指从dna、rna、蛋白质或多肽或其他污染物(如其他细胞)中纯化的核酸或细胞，这些污染物会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途，或者它指重组、合成或修饰的(非天然)核酸。优选地，分离的abp或核酸或细胞
基本上是纯的。在这种情况下，“重组”蛋白质或核酸是使用重组技术制成的。生产重组核酸和蛋白质的方法和技术是本领域众所周知的。
[0097]
在一个实施方案中，本发明的abp是多克隆抗体(混合物)，或者抗原结合片段是多克隆抗体的片段(混合物)。
[0098]
在本发明的所有abp的备选且优选的实施方案中，所述abp是抗体或其抗原结合片段，并且所述抗体是单克隆抗体，或其中所述抗原结合片段是单克隆抗体的片段。
[0099]
本文中使用的术语“单克隆抗体”或“mab”是指从基于其氨基酸序列的基本相同的抗体群体中获得的抗体。单克隆抗体通常具有高度特异性。此外，与通常包括针对抗原的不同决定簇(例如表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种mab通常针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，mab的优势在于它们可以通过未被其他免疫球蛋白污染的细胞培养物(杂交瘤、重组细胞等)合成。本文中的mab包括例如嵌合、人源化或人抗体或抗体片段。
[0100]
根据本发明的单克隆抗体可以通过本领域技术人员熟知的方法制备。例如，可以用目标抗原和佐剂一起免疫小鼠、大鼠或兔子。从动物身上采集脾细胞作为一个池，这些动物每隔一定时间进行几次免疫接种，并进行测试出血以评估血清抗体滴度。制备脾细胞，其要么立即用于融合实验，要么储存在液氮中用于将来的融合。然后根据stewart&fuller,j.immunol.methods 1989,123:45-53的程序进行融合实验。通过酶联免疫吸附测定(elisa)筛选来自具有生长杂合体的孔的上清液中的mab分泌物。elisa阳性培养物通过限制稀释或荧光激活细胞分选进行克隆，通常从单个菌落建立杂交瘤。抗体(包括抗体片段或亚片段)与特定抗原结合的能力可以通过本领域已知的结合测定来确定，例如，使用目标抗原作为结合伴侣。
[0101]
在进一步优选的实施方案中，本发明的abp是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合人抗体，或者其中所述抗原结合片段是人抗体、人源化抗体或嵌合人抗体的片段。
[0102]
人抗体也可以通过体外方法获得。合适的实例包括但不限于噬菌体展示(cat、morphosys、dyax、biosite/medarex、xoma、yumab、symphogen、alexion、affimed)等。在噬菌体展示中，编码单个fab或fv抗体片段的多核苷酸在噬菌体颗粒的表面上表达(参见例如hoogenboom et al.,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks et al.,j mol biol 222:581(1991)；美国专利号5,885,793)。噬菌体被“筛选”以鉴定那些对靶标具有亲和力的抗体片段。因此，某些这样的过程通过在丝状噬菌体表面展示抗体片段库来模拟免疫选择，并随后通过与靶标结合来选择噬菌体。在某些这样的程序中，分离出高亲和力的功能性中和抗体片段。因此，可以通过从外周血淋巴细胞克隆天然重排的人v基因(参见例如mullinax et al.,proc natl acad sci(usa),87:8095-8099(1990))或通过产生具有人抗体序列的全合成或半合成噬菌体展示文库(参见knappik et al 2000；j mol biol 296:57；de kruif et al,1995；j mol biol 248):97)来创建完整的人抗体基因库。
[0103]
本文所述的抗体也可以备选地通过利用技术制备。这种小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体，并且缺乏鼠免疫球蛋白分子和抗体的产生。特别地，在1996年12月3日提交的美国专利申请号08/759,620、1998年6月11日公开的国际专利申请号wo 98/24893和2000年12月21日公开的wo 00/76310中公开了转基因生产小鼠和抗体的优选实
施方案。还参见mendez et al.,nature genetics,15:146-156(1997)。通过使用这种技术，已经产生了针对各种抗原的全人单克隆抗体。从本质上讲，小鼠系是用目标抗原例如cd28、内皮糖蛋白等免疫的，从超免疫小鼠中回收淋巴细胞(如b细胞)，并将回收的淋巴细胞与髓细胞型细胞系融合以制备永生的杂交瘤细胞系。筛选和选择这些杂交瘤细胞系以鉴定产生对目标抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。其他“人源化”小鼠也可商购：例如，medarex-humab小鼠、kymab-kymouse、regeneron-velocimmune小鼠、kirin-tc小鼠、trianni-trianni小鼠、omniab-omnimouse、harbour抗体-h2l2小鼠、merus-memo小鼠。还可用“人源化”的其他物种：大鼠：omniab
–
omnirat，omt
–
unirat.鸡：omniab
–
omnichicken。
[0104]
根据本发明的术语“人源化抗体”是指免疫球蛋白链或其片段(如fab、fab’、f(ab')2、fv或抗体的其他抗原结合亚序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列(但通常仍然至少一部分)。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体的cdr残基被来自具有所需特异性、亲和力和容量(capacity)的非人种类例如小鼠、大鼠或兔子的免疫球蛋白(供体抗体)的cdr残基所取代。因此，所述抗体或其片段的框架序列的至少一部分可以是人共有框架序列。在某些情况下，人免疫球蛋白的fv框架残基需要被相应的非人残基取代，以增加特异性或亲和力。此外，人源化抗体可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于引入的cdr或框架序列中的残基。进行这些修饰以进一步完善和最大化抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个，通常至少两个可变结构域，其中所有或基本上所有cdr区对应于非人免疫球蛋白的cdr区，并且所有或基本所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的框架区。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分，该(例如人)免疫球蛋白恒定区可以被修饰(例如通过突变或糖工程化)以优化这样的区域的一个或多个性质和/或改善(例如治疗性)抗体的功能，例如增加或减少fc效应子功能或增加血清半衰期。示例性的这种fc修饰(例如，fc工程化或fc增强)在本文其他地方描述。
[0105]
根据本发明的术语“嵌合抗体”是指其轻链和/或重链基因通常通过基因工程由免疫球蛋白可变区和恒定区构建的抗体，所述免疫球蛋白可变区和恒定区与不同物种(例如小鼠和人)的相应序列相同或同源。备选地，可变区基因源自特定的抗体类别或亚类，而链的其余部分源自相同或不同物种的另一抗体类别或亚类。它也涵盖了这种抗体的片段。例如，典型的治疗性嵌合抗体是由来自小鼠抗体的可变或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定或效应子结构域组成的杂合蛋白，尽管也可以使用其他哺乳动物物种。
[0106]
特别是在这样的实施方案中，本发明的abp包括抗体的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构区是人抗体的。优选地，abp包含抗体的抗原结合结构域或其抗原结合片段，其为人抗原结合结构域；(ii)所述抗体是单克隆抗体，或者其中所述抗原结合片段是单克隆抗体的片段；和(iii)所述抗体是人抗体或人源化抗体，或其中所述抗原结合片段是人抗体、人源化或嵌合人抗体的片段。
[0107]
人抗体的轻链通常分为κ轻链和λ轻链，每个轻链包含一个可变区和一个恒定结构域。重链通常被分类为μ链、δ链、γ链、α链或ε链，这些将抗体的同种型分别定义为igm、igd、igg、iga和ige。人igg有几种亚型，包括但不限于lgg1、lgg2、lgg3和lgg4。人igm亚型包括igm1和lgm2。人iga亚型包括lga1和lga2。在人中，iga和igd同种型包含四条重链和四条轻
链；igg和ige同种型包含两条重链和两条轻链；igm同种型包含10或12条重链和10或12条轻链。根据本发明的抗体可以是igg、ige、igd、iga或igm免疫球蛋白。
[0108]
在一些实施方案中，本发明的abp是igg抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明的abp是ige抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明的abp是igd抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明的abp是iga抗体或其片段。在一些实施方案中，本发明的abp是igm抗体或其片段。优选地，本发明的abp是、包含或衍生自igg免疫球蛋白或其片段；例如人、衍生自人的igg免疫球蛋白、或源自兔子或大鼠的igg、和/或igg2免疫球蛋白或其片段。当本发明的abp是、包含或衍生自大鼠来源的igg时，则优选地，abp是或包含或衍生自大鼠igg2a或igg2b免疫球蛋白。当本发明的abp是、包含或衍生自人来源的igg时，则更优选地，本发明的abp是、包含或衍生自人igg1、igg2或igg4，最优选地，本发明的abp是、包含或衍生自人igg1或igg2。
[0109]
因此，在本发明的特定实施方案中，abp是抗体，其中所述抗体是igg、ige、igd、iga或igm免疫球蛋白；优选igg免疫球蛋白。
[0110]
本发明的abp，其中包含免疫球蛋白恒定区的至少一部分(通常是人免疫球蛋白的恒定区)，可以具有这样的(例如人)免疫球蛋白恒定区修饰，例如通过糖工程化或突变，以优化这样的区域的一个或多个特性和/或改善(例如治疗性)抗体的功能，例如增加或减少fc效应子功能或增加血清半衰期。
[0111]
本发明的abp，特别是那些可用于本方法的abp包括诱导表达内皮糖蛋白的细胞的抗体依赖性细胞毒性(adcc)的抗体。可以通过使用具有低水平的岩藻糖或缺乏岩藻糖的抗体来改善抗内皮糖蛋白抗体的adcc。缺乏岩藻糖的抗体与增强的adcc(抗体依赖性细胞毒性)活性相关，特别是在低剂量抗体下(shields et ah,2002,j.biol.chem.277:26733-26740；shinkawa et ah,2003,j.biol.chem.278:3466)。
[0112]
制备无岩藻糖抗体或岩藻糖水平降低的抗体的方法包括在大鼠骨髓瘤yb2/0细胞(atcc crl 1662)中生长。yb 2/0细胞表达低水平的fut8mrna，fut8 mrna编码多肽岩藻糖基化所必需的酶(α1，6-岩藻糖基转移酶)。
[0113]
或者，在这样的抗体的表达过程中，可以使用针对与糖链修饰相关的酶的抑制剂，包括：衣霉素，其选择性地抑制glcnac-p-p-dol的形成，这是形成作为n-糖苷连接的糖链的前体的核心寡糖的第一步，作为糖苷酶i的抑制剂的栗精胺(castanospermin)和w-甲基-1-脱氧野尻霉素，作为甘露糖苷酶i抑制剂的几夫碱(kifunensine)，作为糖苷酶ii的抑制剂的溴康二醇(bromocondulitol)，作为甘露糖苷酶i的抑制剂的1-脱氧野尻霉素和1，4-二氧基-1，4-亚氨基-d-甘露糖醇，作为甘露糖苷酶ii的抑制剂的苦马豆素、作为甘露糖苷酶ii的抑制剂的苦马豆素等。对糖基转移酶具有特异性的抑制剂的实例包括针对n-乙酰葡糖胺转移酶v(gntv)的底物的脱氧衍生物等。此外，已知1-脱氧野尻霉素抑制复杂型糖链的合成，并增加高甘露糖型和杂合型糖链的比率(glycobiology series 2-destiny of sugar chain in cell，由katsutaka nagai,senichiro hakomori和akira kobata编辑，1993)。
[0114]
基于这些数据，已经对几种细胞系进行了基因工程改造，以产生不含岩藻糖或含低水平岩藻糖的抗体(mori et al,2004；yamane-ohnuki et al.,2004)，以对igg的糖基化模式进行工程改造，从而选择表现出fcγr接合(engagement)的特定特征的治疗性单克隆抗体，这些抗体可用于各种病理。
[0115]
umana等人和davis等人表明，与其亲代抗体相比，经过改造的含有增加量的二等分的复合寡糖(二等分a-乙酰葡糖胺，glcnac)的lgg1抗体，允许触发强烈的adcc(umana et al.,1999；davies et al.,2001)。其次，人lgg1 n-连接的寡糖缺乏岩藻糖已被证明可以改善fcgriii结合和adcc。
[0116]
glycart biotechnology ag(zurich,ch)在中国仓鼠卵巢(cho)细胞系中表达了n-乙酰基-葡糖胺基转移酶iii(gntiii)，其催化将二等分的glcnac残基添加到n连接的寡糖中，并显示出产生的lgg1抗体的更大adcc(wo 99/54342；wo 03/011878；wo 2005/044859)。
[0117]
wo20070166306涉及在用(i)抗cd19抗体的cdna和(ii)gntiii酶的cdna转染的哺乳动物人293t胚胎肾细胞中产生的抗cd19的抗体的修饰，所述抗cd19的抗体含有60％ n-乙酰葡糖胺二等分寡糖和10％非岩藻糖基化n-乙酰葡糖胺二等分寡糖。
[0118]
在yb2/0细胞(shinkawa et al.,2003；siberil et al.,2006)或cho-lec13(shields et al.,2002)中产生的重组人lgg1，与在野生型cho细胞中产生的相同lgg1相比，表现出低岩藻糖含量或缺乏岩藻糖，显示出触发细胞毒性的增强的能力。相比之下，没有观察到半乳糖和adcc之间的相关性，并且二等分glcnac的含量仅轻微影响adcc(shinkawa et al.,2003)。
[0119]
通过从抗体的fc部分去除或取代岩藻糖，kyowahakko kogyo(tokyo,japan)具有增强的fc结合和改善的adcc，从而提高了mab的功效(us 6,946,292)。低岩藻糖基化igg的这种改善的fc-γ-riiia依赖性效应子功能已被证明独立于fcγ-riii等位基因形式(niwa et al.,2005)。此外，最近已经表明，与高度岩藻糖基化的igg相比，当igg具有低的岩藻糖含量时，诱导有效adcc所需的抗原密度较低(niwa et al.,2005)。
[0120]
laboratoire frangais du fractionnement et des biotechnologies(lfb)(france)表明，mab寡糖中的fuc/gal比例应等于或低于0.6，以获得具有高adcc的抗体(fr 2 861 080)。
[0121]
cardarelli等人，2019在编码α1，6-岩藻糖基转移酶的fut8基因缺陷的ms-704pf cho细胞中产生抗cd19抗体，该文章中抗体的非岩藻糖化需要酶缺陷细胞系的工程化改造。该文章不考虑氨基酸突变。
[0122]
herbst等人产生了人源化lgg1 mab medi-55，其在岩藻糖基转移酶缺陷的生产者cho细胞系中表达。该文章不考虑氨基酸突变(herbst et al.,2010)。s.siberil等人使用大鼠骨髓瘤yb2/0细胞系以产生具有低岩藻糖含量的mab抗rhd。野生型cho中产生的mab表现出高岩藻糖含量(81％)，而yb2/0细胞中产生的相同mab则表现出较低的岩藻糖含量(32％)。本文确实考虑了氨基酸突变(siberil et al.,2006)。
[0123]
因此，本发明的abp可以被制备和/或可以具有上述这种糖工程化(例如非岩藻糖基化)方法/抗体的一个或多个特征。
[0124]
增加本发明的abp的addc活性的备选方法包括这种abp的fc部分的突变，特别是增加抗体对fc-γ-r受体亲和力的突变。
[0125]
因此，上述本发明的任何abp都可以用不同的同种型或突变同种型产生，以控制与不同fcγ受体的结合程度。缺乏fc区的抗体(例如fab片段)缺乏与不同fcγ受体的结合。同种型的选择也影响与不同fcγ受体的结合。已经确定了各种人igg同种型对三种不同的fc
γ受体fcγri、fcγrii和fcγriii的各自的亲和力。(参见，ravetch&kinet,annu.rev.immunol.9,457(1991))。fcγri是一种以单体形式与igg结合的高亲和力受体，后两者是仅以多聚体形式结合igg的低亲和力受体。一般来说，igg1和igg3两者对所有三种受体都具有显著的结合活性，igg4对fcγri、igg2对仅一种称为iialr的fcγrii具有显著的结合活性(参见parren et al.,j.immunol.148,695(1992))。因此，通常选择人同种型igg1是为了与fcγ受体更强的结合，而通常选择igg2是为了较弱的结合。
[0126]
使用基于靶向细胞毒性细胞的测定已经证明了增加的fcγr结合与突变的fc之间的相关性(shields et ah,2001,j.biol.chem.276:6591-6604；presta et ah,2002,biochem soc.trans.30:487-490)。通过特异性fc区突变增加adcc活性的方法包括fc变体，所述fc变体在选自由以下组成的组的位置处包含至少一个氨基酸取代：234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、267、269、296、297、298、299、313、325、327、328、329、330和332，其中fc区中残基的编号是kabat中的eu索引的编号(kabat et ah,sequences of proteins ofimmunological interest(national institute of health,bethesda,md.1987))。
[0127]
在某些特定实施方案中，所述fc变体包含选自由以下项组成的组的至少一个取代：l234d,l234e,l234n,l234q,l234t,l234h,l234y,l234i,l234v,l234f,l235d,l235s,l235n,l235q,l235t,l235h,l235y,l235i,l235v,l235f,s239d,s239e,s239n,s239q,s239f,s239t,s239h,s239y,v240i,v240a,v240t,v240m,f241w,f241l,f241y,f241e,f241r,f243w,f243l,f243y,f243r,f243q,p244h,p245a,p247v,p247g,v262i,v262a,v262t,v262e,v263i,v263a,v263t,v263m,v264l,v264i,v264w,v264t,v264r,v264f,v264m,v264y,v264e,d265g,d265n,d265q,d265y,d265f,d265v,d265i,d265l,d265h,d265t,v266i,v266a,v266t,v266m,s267q,s267l,e269h,e269y,e269f,e269r,y296e,y296q,y296d,y296n,y296s,y296t,y296l,y296i,y296h,n297s,n297d,n297e,a298h,t299i,t299l,t299a,t299s,t299v,t299h,t299f,t299e,w313f,n325q,n325l,n325i,n325d,n325e,n325a,n325t,n325v,n325h,a327n,a327l,l328m,l328d,l328e,l328n,l328q,l328f,l328i,l328v,l328t,l328h,l328a,p329f,a330l,a330y,a330v,a330i,a330f,a330r,a330h,i332d,i332e,i332n,i332q,i332t,i332h,i332y和i332a，其中fc区中的残基的编号是kabat中的eu索引的编号。
[0128]
fc变体也可选自由以下项组成的组：v264l,v264i,f241w,f241l,f243w,f243l,f241l/f243l/v262i/v264i,f241w/f243w,f241w/f243w/v262a/v264a,f241l/v262i,f243l/v264i,f243l/v262i/v264w,f241y/f243y/v262t/v264t,f241e/f243r/v262e/v264r,f241e/f243q/v262t/v264e,f241r/f243q/v262t/v264r,f241e/f243y/v262t/v264r,l328m,l328e,l328f,i332e,l3238m/i332e,p244h,p245a,p247v,w313f,p244h/p245a/p247v,p247g,v264i/i332e,f241e/f243r/v262e/v264r/i332e,f241e/f243q/v262t/264e/i332e,f241r/f243q/v262t/v264r/i332e,f241e/f243y/v262t/v264r/i332e,s298a/i332e,s239e/i332e,s239q/i332e,s239e,d265g,d265n,s239e/d265g,s239e/d265n,s239e/d265q,y296e,y296q,t299i,a327n,s267q/a327s,s267l/a327s,a327l,p329f,a330l,a330y,i332d,n297s,n297d,n297s/i332e,n297d/i332e,n297e/i332e,d265y/n297d/i332e,d265y/n297d/t299l/i332e,d265f/n297e/i332e,l328i/i332e,
l328q/i332e,i332n,i332q,v264t,v264f,v240i,v263i,v266i,t299a,t299s,t299v,n325q,n325l,n325i,s239d,s239n,s239f,s239d/i332d,s239d/i332e,s239d/i332n,s239d/i332q,s239e/i332d,s239e/i332n,s239e/i332q,s239n/i332d,s239n/i332e,s239n/i332n,s239n/i332q,s239q/i332d,s239q/i332n,s239q/i332q,y296d,y296n,f241y/f243y/v262t/v264t/n297d/i332e,a330y/i332e,v264i/a330y/i332e,a330l/i332e,v264i/a330l/i332e,l234d,l234e,l234n,l234q,l234t,l234h,l234y,l234i,l234v,l234f,l235d,l235s,l235n,l235q,l235t,l235h,l235y,l235i,l235v,l235f,s239t,s239h,s239y,v240a,v240t,v240m,v263a,v263t,v263m,v264m,v264y,v266a,v266t,v266m,e269h,e269y,e269f,e269r,y296s,y296t,y296l,y296i,a298h,t299h,a330v,a330i,a330f,a330r,a330h,n325d,n325e,n325a,n325t,n325v,n325h,l328d/i332e,l328e/i332e,l328n/i332e,l328q/i332e,l328v/i332e,l328t/i332e,l328h/i332e,l328i/i332e,l328a,i332t,i332h,i332y,i332a,s239e/v264i/i332e,s239q/v264i/i332e,s239e/v264i/a330y/i332e,s239e/v264i/s298a/a330y/i332e,s239d/n297d/i332e,s239e/n297d/i332e,s239d/d265v/n297d/i332e,s239d/d265i/n297d/i332e,s239d/d265l/n297d/i332e,s239d/d265f/n297d/i332e,s239d/d265y/n297d/i332e,s239d/d265h/n297d/i332e,s239d/d265t/n297d/i332e,v264e/n297d/i332e,y296d/n297d/i332e,y296e/n297d/i332e,y296n/n297d/i332e,y296q/n297d/i332e,y296h/n297d/i332e,y296t/n297d/i332e,n297d/t299v/i332e,n297d/t299i/i332e,n297d/t299l/i332e,n297d/t299f/i332e,n297d/t299h/i332e,n297d/t299e/i332e,n297d/a330y/i332e,n297d/s298a/a330y/i332e,s239d/a330y/i332e,s239n/a330y/i332e,s239d/a330l/i332e,s239n/a330l/i332e,v264i/s298a/i332e,s239d/s298a/i332e,s239n/s298a/i332e,s239d/v264i/i332e,s239d/v264i/s298a/i332e,和s239d/264i/a330l/i332e，其中fc区中的残基的编号是kabat中的eu索引的编号。还参见wo2004029207，其通过引用纳入本文。
[0129]
在特定实施方案中，在所有同种型中，可以在铰链连接区中的位点上、邻近或靠近位点处进行突变(例如，用另一个残基取代残基234、235、236和/或237)，以降低对fcγ受体，特别是fcγri受体的亲和力(参见，例如us6624821)。任选地，位置234、236和/或237由丙氨酸取代，位置235由谷氨酸取代。(参见，例如us5624821。)位置236在人igg2同种型中缺失。人igg2的位置234、235和237的氨基酸的示例性片段是ala ala gly,val ala ala,ala ala ala,val glu ala和ala glu ala。突变体的优选组合是l234a、l235e和g237a，或者对于人同种型igg1是l234a、l235a和g237a。本发明的特别优选的abp是具有人同种型igg和fc区的这三种突变之一的抗体。降低与fcγ受体结合的其他取代是e233p突变(特别是在小鼠igg1中)和d265a(特别是在小鼠igg2a中)。减少fc和/或c1q结合的突变和突变组合的其他实例是e318a/k320a/r322a(特别是在小鼠igg1中)、l235a/e318a/k320a/k322a(特别在小鼠igg2a中)。类似地，人igg4中的残基241(ser)可以被取代，例如用脯氨酸来破坏fc结合。
[0130]
可以对恒定区进行另外的突变以调节效应子活性。例如，可以在a330s、p331s或两者对igg1或igg2a恒定区进行突变。对于igg4，可以在e233p、f234v和l235a处进行突变、g236缺失或其任何组合。igg4还可以具有以下突变s228p和l235e中的一个或两个。使用被破坏的恒定区序列来调节效应子功能进一步描述于，例如在wo2006118,959和
wo2006036291中。
[0131]
可以对人igg的恒定区进行另外的突变以调节效应子活性(参见例如wo200603291)。这些包括以下取代：对人igg1进行(i)a327g，a330s，p331s；(ii)e233p、l234v、l235a、g236缺失；(iii)e233p、l234v、l235a；(iv)e233p、l234v、l235a、g236缺失、a327g、a330s、p331s；和(v)e233p、l234v、l235a、a327g、a330s、p331s；或特别地，(vi)l234a、l235e、g237a、a330s和p331s(例如，对人igg1)，其中fc区中的残基的编号是如kabat中的eu索引的编号。还参见wo2004029207，其通过引用纳入本文。
[0132]
抗体对fcr的亲和力可以通过突变重链恒定区的某些残基来改变。例如，人igg1的糖基化位点的破坏可以降低抗体的fcr结合，从而降低效应子功能(参见例如wo2006036291)。三肽序列nxs和nxt，其中x是脯氨酸以外的任何氨基酸，是n残基糖基化的酶识别位点。任何三肽氨基酸的破坏，特别是igg的ch2区中三肽氨基酸的破坏，将阻止该位点的糖基化。例如，人igg1的n297的突变阻止糖基化并减少fcr与抗体的结合。
[0133]
fc受体结合的优选增强可以通过引入人igg1的fc结构域突变体(本文中通常称为“sdie”)来实现，“sdie”表示突变s239d/i332e。
[0134]
尽管adcc和cdc的激活对于治疗性抗体通常是需要的，但在某些情况下，不能激活效应子功能的本发明的abp是优选的(例如，作为激动性调节剂的本发明abp)。出于这些目的，igg4已被广泛使用，但近年来由于该亚类经历fab臂交换的独特能力而不再受到青睐，在fab臂交换中，重链可以在体内在igg4之间交换。因此，fc工程方法也可用于确定fc结构域与fcγ受体和c1q的关键相互作用位点，然后突变这些位置，例如在本发明的abp的fc中的位置，以减少或消除结合。通过丙氨酸扫描，duncan和winter(1998；nature 332:738)首先分离出c1q与覆盖铰链和fc结构域的上部ch2的区域的结合位点。genmab的研究人员鉴定了突变体k322a、l234a和l235a，它们的组合足以几乎完全消除fcγr和c1q的结合(hezareh et al,2001；j virol 75:12161)。以类似的方式，medimmune后来鉴定了一组三个突变，l234f/l235e/p331s(称为tm)，它们具有非常相似的作用(oganesyan et al,2008；acta crystallographica 64:700)。备选方法是fc结构域的天冬酰胺297上的糖基化的修饰，已知该糖基化是最佳fcr相互作用所必需的。在n297点突变(tao et al,1989；j immunol 143:2595)、酶解去乙酰羰基化fc结构域(mimura et al,2001；j biol chem 276:45539)、在糖基化抑制剂存在下重组表达的抗体(walker et al,1989；biochem j259:347)和细菌中fc结构域的表达(mazor et al 2007；nat biotechnol 25:563)中观察到与fcr结合的丧失。相应地，本发明还包括abp的实施方案，其中已经使用这样的技术或突变来减少效应子功能。
[0135]
由于fcrn介导的再循环，igg在(如人)血清中天然存在很长一段时间，使其具有约21天的典型半衰期。尽管如此，仍有许多努力来设计fc结构域与fcrn的ph依赖性相互作用，以增加在ph 6.0的亲和力，同时在ph7.4保持最小结合。pdl biopharma的研究人员鉴定了突变t250q/m428l和m252y/s254t/t256e(称为yte)，突变t250q/m428l导致恒河猴中igg半衰期增加约2倍(hinto et al,2004；j biol chem 279:6213),突变m252y/s254t/t256e(称为yte)导致食蟹猴中igg半衰期增加约4倍(dall’acqua,et al 2006；j biol chem 281:23514)。本发明的abp也可以是peg化的。聚乙二醇化，即与合成聚合物聚乙二醇(peg)的化学偶联，已成为开发执行长期作用的生物制剂的一种公认技术，迄今已有约10种临床批准
的蛋白质和肽药物(jevsevar et al.,2010；biotechnol j 5:113)。本发明的abp也可以进行pas酰化，这是peg化的一种生物替代，用于延长药物活性蛋白的血浆半衰期(schlapschy et al,2013；protein eng des sel 26:489；xl-protein gmbh,germany)。因此，本发明还包括abp的实施方案，其中这些技术或突变已被用于延长血清半衰期，特别是在人血清中的半衰期。
[0136]“fab片段”由重链和轻链各自的一个恒定和一个可变结构域组成，由轻链的相邻恒定区和重链的第一恒定结构域(ch1)连接在一起。这些可以通过蛋白酶消化，例如用木瓜蛋白酶从常规抗体中消化形成，但类似的fab片段也可以通过基因工程产生。fab片段包括fab’、fab和“fab-sh”(它们是含有至少一个游离巯基的fab片段)。
[0137]
fab’片段与fab片段的不同之处在于，它们在重链第一恒定结构域的羧基末端含有另外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’片段包括“fab
’‑
sh”(即含有至少一个游离巯基的fab’片段)。
[0138]
此外，抗体片段包括f(ab')2片段，其包含两条轻链和两条重链，这两条重链路包含ch1和ch2结构域之间的一部分恒定区(“铰链区”)，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，f(ab')2片段由两个fab’片段组成，这两个片段通过两条重链之间的二硫键保持在一起。f(ab')2片段可由常规抗体通过用在铰链区下方切割的酶(例如用胃蛋白酶)进行蛋白水解切割或通过基因工程制备。
[0139]“fv区”包括重链和轻链两者的可变区，但缺乏恒定区。“单链抗体”或“scfv”是指fv分子，其中重链和轻链可变区通过柔性接头连接形成单个多肽链，该单个多肽链形成抗原结合区。
[0140]“fc区”包含两个重链片段，其包含抗体的ch2和ch3结构域。这两个重链片段通过两个或多个二硫键和通过ch3结构域的疏水相互作用保持在一起。
[0141]
在优选实施方案中，本发明的abp是抗体，其中所述抗体或其片段的框架序列的至少一部分是人共有框架序列，例如，包含人种系编码的框架序列。
[0142]
在一些实施方案中，本发明的abp被修饰或工程化以增加抗体依赖性细胞毒性(adcc)。正如普通技术人员现在所理解的那样，本发明的此类abp将在与细胞对免疫细胞如ctl的耐药性相关的疾病或病症(如cd28阳性癌症)的治疗方面具有特殊用途；由于adcc机制(细胞介导的免疫防御，借此免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞，所述靶细胞的膜表面抗原已被特异性抗体结合)将相对于对ctl等免疫细胞具有抗性的细胞增强，从而导致免疫系统的效应细胞对这些细胞的附着和/或裂解的增加。
[0143]
如本文所用，“治疗”是治疗疾病、病症或病况的同义词，其包括减轻疾病、病症和病况的症状，抑制疾病、病症或病况的进展，引起疾病、病症或病况的消退和/或治愈疾病、病症或病况。
[0144]
修饰或设计本发明的abp以增加adcc的各种技术是已知的(satoh et al,2006；expert opin biol ther 6:1161；wo2009/135181)，并且因此这样的实施方案包括其中本发明的abp可以是去岩藻糖基化的(glycart biotechnology)，例如其中在cho细胞中产生抗体，cho细胞中内源性fut8基因已经被敲除；或者abp可以是“糖工程化抗体”(seattle genetics)，例如其中岩藻糖类似物被添加到表达抗体的cho细胞中，导致岩藻糖基化的显著减少。可应用于本发明的abp的其他去岩藻糖基化方法在本文其他地方描述。
[0145]
修饰或设计本发明的abp以增加adcc的其他技术包括abp的fc部分中的突变(如本文其他地方更详细描述的)，特别其中在人fc的残基234、235、236和/或237、和/或残基330、331中的一个或多个被如此突变下；其中fc区中的残基的这种编号是如kabat中的eu索引的编号(kabat et ah,sequences of proteins of immunological interest(national institute of health,bethesda,md.1987)。
[0146]
因此，在某些实施方案中，本发明的abp被修饰或工程化以增加抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，优选地其中所述abp是去岩藻糖基化的和/或所述abp的fc是突变的(例如其中fc使用以下残基改变中的一个或多个进行突变：l234a、l235e、g237a、a330s和/或p331s)。在备选实施方案中，本发明的abp被修饰或工程化以减少抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。
[0147]
在其他某些实施方案中，本发明的abp被修饰以延长血清半衰期，特别是在人血清中的半衰期。例如，本发明的abp可以是peg化和/或pas化的，或者具有具有t250q/m428l或m252y/s254t/t256e修饰的fc区。
[0148]
本发明的abp可以是单特异性的(即，它具有仅与一种抗原结合的抗原结合结构域)或可以是多特异性的，即，它具有与不同抗原结合的两个或多个不同抗原结合结构域)。例如，“双特异性”、“双重特性”或“双功能”abp或抗体分别是具有两个不同抗原结合位点的杂合abp或抗体。双特异性抗原结合蛋白和抗体是一种多特异性抗原结合蛋白抗体，可以通过多种方法生产，包括但不限于杂交瘤的融合或fab’片段的连接(参见，例如，songsivilai和lachmann,1990；kostelny et al.,1992)。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将与两个不同的表位结合，这两个表位可以位于相同或不同的蛋白质靶标上。
[0149]
因此，在某些实施方案中，本发明的abp是包含至少两个抗原结合结构域的多特异性抗体，其中每个抗原结合结构域特异性结合不同的抗原表位。
[0150]
本发明的abp的优选变体涉及双特异性变体，其包括抗cd28的抗体的抗原结合区和针对疾病相关抗原蛋白如内皮糖蛋白的第二抗原结合区。优选地，抗cd28结合位点是scfv构建体。本发明的一个优选构建体包括本文命名为7c4抗体的两个抗原结合结构域和两个抗cd3结合结构域，例如上述ucht1-scfv构建体。
[0151]
在优选的实施方案中，本发明的abp包含至少一个抗体恒定结构域，特别是其中至少一个抗体恒定结构域是ch1、ch2或ch3结构域或其组合。
[0152]
在进一步的这样的实施方案中，具有抗体恒定结构域的本发明的abp包括突变的fc区，例如用于增加fc区与fc受体(免疫效应细胞上的fc受体)的相互作用(例如saxena&wu,2016；front immunol 7:580)。本文在其他地方描述了其实例和实施方案。
[0153]
在其他实施方案中，本发明的abp可以包括效应子基团和/或标签基团。
[0154]
术语“效应子基团”是指作为细胞毒性剂的任何基团，特别是与另一分子(如抗原结合蛋白)偶联的基团。合适的效应子基团的实例是放射性同位素或放射性核素。其他合适的效应子基团包括毒素、治疗基团或化疗基团。合适的效应子基团的实例包括加利车霉素、奥瑞他汀(auristatins)、格尔德霉素(geldanamycins)、α-鹅膏毒环肽、吡咯苯并二氮杂和美登素。
[0155]
术语“标签”或“标签基团”是指任何可检测的标签。一般来说，标签分为多种类别，这取决于检测它们的测定方法：a)同位素标签，其可以是放射性或重同位素；b)磁性标签
(例如磁性粒子)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化的基团；和f)第二报告子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。
[0156]
在备选的方面，本发明还涉及内皮糖蛋白结合分子，其包含至少具有序列rnyvtgfdy(seq id no:16)的重链互补决定区(cdr)3，或与该序列相比具有不超过3、2、优选不超过1个氨基酸突变的序列；和具有序列hqylssyt(seq id no:20)的轻链cdr3，或与该序列相比具有不超过3、2、优选不超过1个氨基酸突变的序列。
[0157]
在一个另外的方面中，内皮糖蛋白结合分子是abp，并且包含至少一个、优选两个抗体重链序列和至少一个、优选两个抗体轻链序列，其中所述至少一个、优选两个抗体重链序列包含具有序列sywmh(seq id no:14)的hcdr1，以及具有序列niypgsgstfydekfkg(seq id no:15)的hcdr2和具有序列rnyvtgfdy(seq id no:16)的hcdr3；和/或其中所述至少一个、优选两个抗体轻链序列包含具有序列kssqsvlyssnqknyla(seq id no:18)的lcdr1、具有序列wastres(seq id no:19)的lcdr2和具有序列hqylssyt(seq id no:20)的lclr3。任选地，其中与所指示的序列相比，每个序列具有不超过三个，优选不超过两个，更优选不超过1个氨基酸变异，例如氨基酸添加、缺失、插入或取代。
[0158]
在该方面的进一步的实施方案中，内皮糖蛋白抗体可以是单特异性abp，例如igg，或者可以在本文公开的发明的其他方面的上下文中用作介导与肿瘤相关抗原的结合的双特异性分子的“第二结合位点”。
[0159]
优选地，内皮糖蛋白结合分子是abp，其中所述重链序列包含seq id no:17中所示的抗体重链可变区；任选地，其中所述序列中的每一个与所指示的序列相比具有不超过10、9、8、7、6、5、4、3，优选不超过两个，更优选不超过1个氨基酸变异，例如氨基酸添加、缺失、插入或取代；和/或其中所述轻链序列包含seq id no:21中所示的抗体轻链可变区；任选地，其中所述序列中的每一个与所指示的序列相比具有不超过10、9、8、7、6、5、4、3，优选不超过两个，更优选不超过1个氨基酸变异，例如氨基酸添加、缺失、插入或取代。
[0160]
进一步的备选方面涉及编码本发明的抗内皮糖蛋白abp的核酸序列、用于本发明的抗内皮糖蛋白abp的重链和/或轻链序列的表达的载体。示例性的这种编码核酸序列在seq id no:22和23中示出。
[0161]
应当理解，为了简洁起见，本文的以上一般描述在抗体的上下文中不重复，而是相应地适用。
[0162]
在第二方面，本发明涉及分离的核酸，其包含编码本发明的结合分子、或第一方面的任一项的结合分子的抗原结合片段或单体(例如重链或轻链)、或编码根据本发明的双特异性abp的序列。
[0163]
例如，由本发明的核酸编码的组分可以是本发明的抗体的一个链的全部或部分；或者所述组分可以是所述结合分子的scfv。由这种核酸编码的组分可以是本发明抗体的一个或其他链的全部或部分；例如，由这样的核酸编码的组分可以是本发明的结合分子。本发明的核酸还可以编码本发明的结合分子的片段、衍生物、突变体或变体，和/或代表适合和/或足以用作杂交探针、聚合酶链式反应(pcr)引物或测序引物的多核苷酸的组分，用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸，用于抑制多核苷酸表达的反义或抑制性核酸(如rnai/sirna/shrna或grna分子)和上述的互补序列。
[0164]
在本发明的特定实施方案中，本发明的核酸包含具有编码重链或轻链cdr、重链和/或轻链cdr1、cdr2和cdr3的组合或重链或重链可变结构域的序列的核酸，在每种情况下如表1的序列所示，或其功能片段。在其他实施方案中，本发明的核酸包含这样的核酸序列，所述核酸序列与编码表1中本文公开的cdr中的任一项，优选cdr3的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％；或95％(优选至少75％)的序列同一性(或具有不超过五十、四十、三十、二十、十五、十或五个，优选不超过三个、两个或一个碱基取代、插入或缺失)。
[0165]
根据本发明的核酸可以是基因组、mrna、cdna或合成来源的dna或rna或它们的一些组合，任选地连接到其在自然界中未连接的多核苷酸。在一些实施方案中，这样的核酸可以包含一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过20个，特别是1至约5个，或优选地，序列中具体核苷酸的所有实例)非天然(例如合成)核苷酸；和/或这样的核酸可以包含(例如缀合到)另一个化学部分，例如标签基团或效应子基团；例如本文别处所述的标签基团或效应子基团。
[0166]
在一个实施方案中，本发明的核酸可以是分离的或基本上纯的。在另一个实施方案中，本发明的核酸可以是重组的、合成的和/或修饰的，或者以任何其他方式非天然的。例如，本发明的核酸可以含有相对于天然产物如人核酸的至少一个核酸取代(或缺失)修饰(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个这样的修饰，特别是1至约5个这样的修饰，优选2或3个这样的修饰)。
[0167]
核酸可以具有任何合适的长度，例如长度为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1000、1500、3000、5000或更多个核苷酸。例如：sirna核酸的长度可以优选为约15至约25个碱基对(优选为约19至约21个碱基对)；shrna核酸可以优选地包括20-30个碱基对的茎、至少4个核苷酸的环和3
′
端的二核苷酸突出端；微小rna的长度可以优选为约22个碱基对；编码本发明的abp或其组分(例如重链或轻链或igg抗体)的mrna或dna序列可以优选地在约500至1500个核苷酸之间。更优选地，编码哺乳动物抗体轻链的核酸可以在约630至约650个核苷酸之间，并且编码哺乳动物抗体重链的核酸可在约1300至约1650个核苷酸之间。核酸可以包括一个或多个另外的序列，例如调节序列，和/或是较大核酸的一部分。核酸可以是单链的或双链的，并且可以包含rna和/或dna核苷酸及其人工变体(例如肽核酸)。
[0168]
可以通过突变将变化引入本发明的核酸的序列中。这种变化，取决于它们的性质和在密码子中的位置，可以导致其编码的多肽(例如抗原结合蛋白)的氨基酸序列的变化。可以使用本领域已知的任何技术引入突变。
[0169]
在一个实施方案中，可以使用例如定点诱变方案来改变一个或多个特定的氨基酸残基。在另一个实施方案中，可以使用例如随机诱变方案来改变一个或多个随机选择的残基。然而，可以表达突变多肽，并对其进行所需性质的筛选。突变可以被引入核酸中，而不会显著改变其编码的多肽的生物学活性。例如，可以在非必需氨基酸残基处进行导致氨基酸取代的核苷酸取代。
[0170]
可以对本发明的核酸序列进行的其他改变(例如通过突变)可能不会改变编码多肽的氨基酸序列，但可能导致编码多肽的稳定性和/或表达的有效性的改变。例如，通过密码子优化，给定多肽序列的表达可以通过利用给定氨基酸的更常见的密码子来改善，所述
更常见的密码子发现于待表达核苷酸的物种。密码子优化的方法和备选方法(例如cpg和g/c含量的优化)描述于例如hass et al,1996(current biology 6:315)；wo1996/09378；wo2006/015789和wo 2002/098443)。
[0171]
在第三方面，本发明涉及核酸构建体(nac)，其包含第三方面的核酸和一个或多个另外的序列特征，所述序列特征允许编码的结合分子(或进一步的结合分子)p或所述结合分子或进一步的结合分子的组分(如抗体重链或轻链)在细胞中表达。
[0172]
这样的nac可以包括一个或多个另外的特征，所述另外的特征允许编码的结合分子或所述结合分子的组分(例如抗原结合位点)在细胞(例如宿主细胞)中的表达。本发明的nac的实例包括但不限于质粒载体、病毒载体、mrna、非附加型哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。本发明的核酸构建体可以包含本发明的核酸，其形式适合于在细胞例如宿主细胞中表达核酸(见下文)。本发明的核酸构建体通常是重组核酸，和/或可以是分离的和/或基本上纯的。重组核酸通常是非天然的；特别是如果它们包含衍生自不同物种和/或合成的、体外的或诱变方法的部分。
[0173]
在一些实施方案中，本发明的nac包含一种或多种构建体，所述构建体中的任一种包含编码重或轻抗体链的核酸。在一些实施方案中，本发明的nac包含两个构建体，其中一种包含编码重抗体链的核酸，另一种包含包含编码轻抗体链的核苷酸，使得来自两个构建体的表达可以产生完整的抗体分子。在一些实施方案中，本发明的nac包括构建体，该构建体包括编码重抗体链和轻抗体链两者的核酸，使得完整的抗体分子可以从一个构建体表达。在其他实施方案中，本发明的nac可以包括单个构建体，其编码足以形成本发明的abp的单链；例如如果编码的结合分子是scfv或单域抗体(例如骆驼科动物抗体)。
[0174]
在一些实施方案中，本发明的nac包括编码恒定区的全部或部分的序列，从而能够表达重链和/或轻链的全部或一部分。
[0175]
根据本发明的nac可以包含(或由......组成)包括编码本发明的结合分子的开放阅读框的mrna分子，并且例如与能够表达结合分子的上游和下游元件(例如5’和/或3’utr和/或poly-a序列)一起，优选增强mrna的稳定性和/或结合分子的表达。使用mrna作为nac引入细胞并在细胞中表达多核苷酸描述于例如zangi et al的nat.biotechnol.vol.31,898-907(2013),sahin et al(2014)nature reviews drug discovery 13:759和thess et al的mol.ther.vol.23no.9,1456-1464(2015)。可包含在本发明的mrna nac中的特定utr包括：top基因的5’utr(wo2013/143699)和/或组蛋白茎环(wo2013/120629)。本发明的mrnanac可以进一步包括一种或多种化学修饰(ep 1 685 844)；包括5
’‑
帽，例如m7g(5’)ppp、(5’(a,g(5’)ppp(5’)a或g(5’)ppp(5’)g,和/或至少一种核苷酸，其为天然存在的核苷酸的类似物，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-去氮杂-鸟苷、5-甲基胞嘧啶或肌苷。
[0176]
nac，例如本发明的基于dna-、逆转录病毒-和mrna-的nac，可以用于遗传治疗方法，以治疗或预防免疫系统的疾病(参见下面的治疗方法)，其中将包括编码本发明的abp的可表达序列的nac施用至细胞或生物体(例如通过转染)。特别地，从wo2008/083949中已知使用mrna治疗剂来表达抗体。
[0177]
优选地，在第二和第三方面的上下文中，核酸可以包括编码蛋白质的序列，所述蛋白质具有表1的seq id no:1至12中任一项的氨基酸序列。
[0178]
在第四方面，本发明涉及重组宿主细胞，其包含根据第三或第四方面的核酸或nac。优选地，这样的细胞能够表达由所述nac编码的结合分子(或其组分)。例如，如果本发明的结合分子包含两个单独的多肽链(例如igg的重链和轻链)，则本发明的细胞可包含编码(并能表达)这种结合分子的重链的第一nac以及编码(并能表达)这种结合分子的轻链的第二nac；或者，细胞可以包含编码这种结合分子的两条链的单个nac。通过这些方式，本发明的这种细胞将能够表达本发明的功能性(例如结合和/或抑制性)结合分子。本发明的(宿主)细胞可以是本文其他地方描述的哺乳动物、原核或真核宿主细胞之一，特别是其中细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
[0179]
在这样的方面的某些实施方案中，(宿主)细胞是人细胞；特别地，它可以是从特定个体取样的人细胞(例如自体人细胞)。在这样的实施方案中，可以在体外繁殖和/或操纵这样的人细胞，从而引入本发明的nac。来自特定个体的被操纵的人细胞的用途可以是产生本发明的结合分子，包括将这样的被操纵人细胞群体重新引入人受试者中，例如用于治疗。在某些这样的用途中，被操纵的人细胞可以被引入到首次对其进行采样的同一人个体中；例如作为自体人细胞。
[0180]
接受这种操作的人细胞可以是体内的任何生殖细胞或体细胞类型。例如，供体细胞可以是生殖细胞或体细胞，其选自由以下各项组成的组：成纤维细胞、b细胞、t细胞、树突细胞、角质形成细胞、脂肪细胞、上皮细胞、表皮细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、心脏细胞、食道细胞、肌肉细胞、黑色素细胞、造血细胞、巨噬细胞、单核细胞，和单核细胞。供体细胞可以从身体中的任何器官或组织中获得；例如，它可以是来自选自由肝脏、胃、肠、肺、胰腺、角膜、皮肤、胆囊、卵巢、睾丸、肾脏、心脏、膀胱和尿道组成的组的器官的细胞。
[0181]
在第五方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包括：(i)第一方面的结合分子，或(ii)第二方面的核酸或第三方面的nac，或(iii)根据第四方面的重组宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稳定剂和/或赋形剂。
[0182]
在第六方面，本发明涉及包装或药物组合物的试剂盒，在单独的容器中，所述试剂盒包含：(i)前述任一方面中所述的分离的结合分子、编码所述分离的结合分子的分离的核酸、和/或包含这样的核酸或分离的结合分子的重组宿主细胞；和(ii)前述任一方面中所述的分离的另外的结合分子、编码所述分离的另外的结合分子的分离的核酸、和/或包含这样的核酸或分离的另外的结合分子的重组宿主细胞。
[0183]
为了用于治疗，本发明的结合分子、核酸或nac(或细胞，例如宿主细胞)可以配制成适合于促进施用至动物或人类的药物组合物。术语“药物组合物”是指用于药物用途的包括治疗活性物质(如本发明的abp)的物质的混合物。
[0184]
例如，本发明的药物组合物可包含0.1％至100％(w/w)的活性成分，例如约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，优选约1％至约20％、约10％至50％或约40％至90％。
[0185]
如本文所用，语言“药学上可接受的”赋形剂、稳定剂或载体旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、增溶剂、填充剂、稳定剂、粘合剂、吸收剂、碱、缓冲剂、润滑剂、控释运载体、稀释剂、乳化剂、保湿剂、分散介质、包衣、抗细菌剂或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟
剂等。这种介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域是众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则其在组合物中的用途是可设想的。补充剂也可以掺入组合物中。
[0186]
本发明的药物组合物(或与本发明一起使用的药物组合物)通常被配制成与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括口服、肠胃外，例如鞘内、动脉内、静脉内、皮内、皮下、口服、经皮(局部)和经粘膜施用。
[0187]
在一些实施方案中，包含结合分子或nac的药物组合物为10至1000mg的单位剂量形式。在一些实施方案中，包含结合分子或nac的药物组合物为10至200mg的单位剂量形式。在一些实施方案中，包含结合分子的药物组合物为200至400mg的单位剂量形式。在一些实施方案中，包含结合分子或nac的药物组合物为400至600mg的单位剂量形式。在一些实施方案中，包含结合分子或nac的药物组合物为600至800mg的单位剂量形式。在一些实施方案中，包含结合分子或nac的药物组合物为800至100mg的单位剂量形式。
[0188]
包含结合分子或nac的药物组合物的示例性单位剂型是片剂、胶囊剂(例如粉末剂、颗粒剂、微片剂或微丸剂)、悬浮液或一次性预装注射器。在某些实施方案中，提供了用于生产单剂量给药单元的试剂盒。试剂盒可以包含具有干燥活性成分的第一容器和具有水性制剂的第二容器。备选地，该试剂盒可以包含单腔和多腔预装注射器。
[0189]
这种活性成分的毒性和治疗效果(例如有效性)可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如用于确定ld50(对50％的群体的致命的剂量)和ed50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为ld50/ed50的比值。优选表现出大的治疗指数的活性剂。虽然可以使用表现出毒性副作用的化合物，但应注意设计将此类化合物靶向受影响组织部位的递送系统，以最大限度地减少对未感染细胞的潜在损伤，从而减少副作用。
[0190]
根据本文提供的医疗用途和治疗方法的所有方面和实施方案，对需要用结合分子或nac治疗的受试者至少一次给药的有效量通常为每次给药约0.01mg/kg至约100mg/kg，例如每次给药约1mg/kg至约10mg/kg。在一些实施方案中，对所述受试者施用至少一次abp或nac的有效量为每次给药约0.01mg/kg至约0.1mg/kg，每次给药约0.1mg/kg至约1mg/kg，每次给药约1mg/kg至约5mg/kg，每次给药约5mg/kg至约10mg/kg，每次给药约10mg/kg至约50mg/kg、或每次给药约50mg/kg至约100mg/kg。
[0191]
对于疾病的预防或治疗，结合分子或nac(或包含其的药物组合物)的适当剂量将取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重程度和病程、结合分子或nac和/或药物组合物被施用用于预防还是治疗目的、先前的治疗、患者的临床病史、年龄、大小/重量和对结合分子或nac和/或药物组合物的反应，以及主治医师的判断。结合分子或nac和/或药物组合物在一次或一系列治疗中适当地施用至患者。如果这种结合分子或nac和/或药物组合物在一系列治疗中给药，则给定疗程的给药总数可以由总共约2、3、4、5、6、7、8、9、10次或超过约10次治疗组成。例如，可以在一周、一个月甚至几个月内每天给予一次治疗(或每天2次、3次或4次)。在某些实施方案中，治疗过程可以无限期地继续。
[0192]
在第六方面，本发明涉及用于医学的组分，其中所述组分选自由以下组成的列表：(i)第一方面的结合分子或双特异性abp，或(ii)第二方面或第三方面的核酸或nac，或(iii)根据第四方面的重组宿主细胞和(iv)根据第五方面的药物组合物或试剂盒。
[0193]
在相关方面，本发明还涉及治疗或预防有需要的哺乳动物受试者的疾病、病症或病况的方法，其包括向所述受试者施用至少一次有效量的如上所述的调节化合物，或特别是向所述被试者施用至少一次有效量的如上所述的结合分子、nac、(宿主)细胞或药物组合物。
[0194]
在另一个相关方面，本发明还涉及如上所述的本发明产品或如上所述调节化合物(特别是本发明的结合分子)在制备药物中的用途，特别是用于治疗哺乳动物受试者的疾病、病症或病况，特别是在疾病、病症或病况是本文所述的病症、病症或病况。
[0195]
本发明中的术语“治疗”是指包括疗法，例如治疗性治疗，以及对疾病(或病症或病况)的预防或抑制措施。因此，例如，在疾病发作之前成功施用根据本发明的化合物导致疾病的治疗。“治疗”还包括在疾病出现后施用本发明的化合物，以改善或根除疾病(或其症状)。在发病后和临床症状出现后施用本发明的cd28结合分子，可能减轻临床症状并可能改善疾病，也包括疾病的治疗。那些“需要治疗”的人包括已经患有该疾病、病症或病况的受试者(如人类受试者)，以及那些容易或怀疑患有该疾病、病症或病况的人，包括那些需要预防该疾病、病症或病况的人。
[0196]
在这些方面的特定实施方案中，调节化合物是上述化合物，和/或是本发明的结合分子、nac、(宿主)细胞或药物组合物或试剂盒；特别是本发明的结合分子。
[0197]
在本文其他地方描述的其他方面中，提供了检测和/或诊断哺乳动物受试者的疾病、病症或病况的方法。
[0198]
在一个特定实施方案中，疾病、病症或病况的特征在于病理性免疫反应。
[0199]
在另一个特定实施方案中，疾病、病症或病况是增殖性病症(或与这种病症或疾病相关的病况)，特别是当是产物或调节化合物(例如本发明的结合分子、核酸、nac或重组宿主细胞，特别是本发明的结合分子)时。
[0200]“增殖性病症”是指特征在于细胞的异常增殖的病症。增殖性病症并不意味着对细胞生长速率的任何限制，而仅仅表明影响生长和细胞分裂的正常控制的丧失。因此，在一些实施方案中，增殖性病症的细胞可以具有与正常细胞相同的细胞分裂速率，但不响应限制这种生长的信号。在“增殖性病症”的范围内是赘生物或肿瘤，这是一种组织或细胞的异常生长。基于现有技术理解癌症，其包括以细胞增殖为特征的各种恶性肿瘤，这些细胞有能力侵入周围组织和/或转移到新的定殖位点。增殖性病症包括癌症、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、特发性肺纤维化和肝硬化。非癌性增生性病症还包括皮肤中细胞的过度增殖，如银屑病及其各种临床形式、reiter综合征、毛发红糠疹，以及角质化病症的过度增殖变体(例如光化性角化病、老年角化病)、硬皮病等。
[0201]
在更具体的实施方案中，增殖性病症是癌症或肿瘤，特别是实体肿瘤(或与此类癌症或肿瘤相关的病况)。此类增殖性病症包括但不限于头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、孤立性浆细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、生殖细胞肿瘤、肝母细胞癌、肝细胞癌、黑色素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因肉瘤、软骨肉瘤、任何血液系统恶性肿瘤(例如慢性成淋巴细胞性白血病、慢性单核细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、慢性原始粒细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病、肥大细胞白血病、肥大细胞肿瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区
淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、蕈样肉芽肿、灼热综合征、皮肤t细胞淋巴瘤、外周t细胞淋巴瘤，慢性骨髓增生性疾病、骨髓纤维化、骨髓组织异生、系统性肥大细胞增多症)，和中枢神经系统肿瘤(例如，脑癌、胶质母细胞瘤、非胶质母细胞癌脑癌、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤和脉络丛乳头瘤)、骨髓增生性疾病(例如真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化)、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌癌症或肝癌。
[0202]
在一个优选的实施方案中，本发明的各个方面涉及例如用于检测/诊断、预防和/或治疗这样的增殖性病症的本发明的结合分子，所述增殖性病症包括但不限于癌症(包括乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肺癌、结直肠癌和/或结肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤)、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤和蕈样肉芽肿)、白血病、肉瘤、间皮瘤、脑癌(包括胶质瘤)、生殖细胞瘤(包括睾丸癌和卵巢癌)、绒毛膜癌、肾癌、胰腺癌、甲状腺癌、头颈癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌或胃癌。
[0203]
因此，在优选实施方案中，根据本发明的结合分子或nac用于预防和/或治疗癌症，例如其特征是存在选自由以下组成的组的癌细胞的癌症：肾上腺肿瘤、aids相关癌症、肺泡软部肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌症、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳腺癌、颈动脉体肿瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、难染肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、室管膜瘤、尤因瘤、一种骨骼外黏液样软骨肉瘤、骨成纤维发生不全、骨纤维发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、肾癌、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、甲状旁腺肿瘤、小儿癌症、外周神经鞘肿瘤、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、前列腺癌、后发性葡萄膜黑色素瘤(posterious unveal melanoma)、罕见血液病、肾转移性癌症、横纹肌样瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌和子宫癌的细胞。
[0204]
在其他方法中，可将调节(例如抑制)化合物(例如结合分子，例如本发明的结合分子)与不同的抗增殖治疗，特别是不同的抗癌治疗结合使用，尤其是在不同的抗增殖治疗是免疫疗法的情况下，尤其是使用免疫检查点分子的配体的免疫疗法的情况下。因此，该组合物可用于治疗有需要的受试者的增殖性病症，其中受试者通过免疫疗法进行联合治疗，特别是与免疫检查点分子的配体的联合疗法(例如联合治疗)。
[0205]
在这样的实施方案中，配体是与免疫(抑制性)检查点分子结合的配体。例如，这样的检查点分子可以是从由以下组成的组中选择的一种：a2ar、b7-h3、b7-h4、ctla-4、ido、kir、lag3、pd-1(或其配体pd-l1和pd-l2之一)、tim-3(或其配体半乳凝集素-9)、tigit，或例如靶向flt3、psma或其他肿瘤相关靶点的抗原结合分子。特别是在这样的实施方案中，配体结合检查点分子，该检查点分子选自：ctla-4、pd-1和pd-l1。在其他更具体的实施方案中，配体是选自由以下组成的组的抗体：伊匹木单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、bgb-a317、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)和度伐利尤单抗(durvaluma)；特别是选自由伊匹木单抗(yervoy)、纳武单抗(opdivo)、派姆单抗(keytruda)和阿替利珠单抗(tecentriq)组成的组的抗体。
[0206]
当本发明的治疗方法或用途(例如，涉及本发明abp的方法或用途)与任何此类其他程序(例如，另一种药剂或癌症免疫疗法，例如结合免疫(抑制)检查点分子的配体)一起用于联合治疗时，那么作为组合治疗方案的这种方法或用途可以包括伴随这种暴露/给药的实施方案。在备选实施方案中，这样的给药可以是按顺序的；特别是在这样的其它程序之前施用本发明的abp的那些实施方案。例如，本发明的这种化合物可以在另一个程序的约14天内(例如在之前)，例如在另一程序的约10天、7天、5天、2天或1天内(如在之前)顺序给药；并且进一步包括本发明的化合物可以在另一程序的约48小时、24小时、12小时、8小时、6小时、4小时、2小时、1小时、30分钟、15分钟或5分钟内(例如在之前)顺序给药。
[0207]
在进一步的方面，本发明涉及预防和/或治疗受试者增殖性病症的方法，其包括向需要治疗的受试者施用治疗有效量的本公开中所述的组分；并且其中所述增殖性病症的特征在于抗原蛋白在与所述增生性病症相关的细胞中的表达。在优选的实施方案中，并且如本文其他地方所公开的，这样的治疗包括另外的结合分子的另外给药。
[0208]
如上所述，在一个方面，本文提供了能够表达如上所述的abp的细胞，例如(重组)宿主细胞或杂交瘤。在备选方面中，本文提供了细胞，其包括如上所述编码abp或abp的成分的至少一种nac。本发明的细胞可用于本文提供的方法中以产生本发明的abp和/或nac。
[0209]
因此，在另一个方面，本发明涉及生产能够表达第一方面的结合分子的重组细胞系的方法，该方法包括以下步骤：
[0210]
·
提供合适的宿主细胞；
[0211]
·
提供至少一种遗传构建体，所述遗传构建体包含编码本发明的结合分子的编码序列；
[0212]
·
将所述遗传构建体引入所述合适的宿主细胞中；和
[0213]
·
任选地，由所述合适的宿主细胞在允许所述结合分子表达的条件下表达所述遗传构建体。
[0214]
在另一个方面，本文提供了产生如上所述的结合分子的方法，例如包括在允许所述结合分子的表达的条件下培养一种或多种本发明的细胞。
[0215]
在一些进一步的方面和实施方案中，本发明涉及以下项目，应考虑本文公开和描述的其他方面和实施方案以及实例来解释这些项目：
[0216]
项目1.结合分子，其至少是双特异性的，包括至少两个第一抗原结合位点和至少一个第二抗原结合位点，用于受试者的疾病的治疗，其中
[0217]
(i)所述至少两个第一抗原结合位点能够特异性结合t细胞特异性表面糖蛋白cd28的表位；和
[0218]
(ii)所述至少一个第二抗原结合位点能够结合在受试者中与疾病相关的细胞上或细胞中表达的抗原靶蛋白的表位；
[0219]
其中所述治疗包括向所述受试者施用所述结合分子。
[0220]
项目2.项目1的用途的结合分子，其中所述至少两个第一和/或所述至少一个第二抗原结合位点衍生自抗体或抗体样分子，并且其中所述至少两个第一抗原结合位点各自作为抗体的抗原结合片段提供，所述抗体的抗原结合片段不是f(ab')2或fab，并且优选为单链构建体，最优选为单链fv(scfv)。
[0221]
项目3.项目1或2的用途的结合分子，其中当在没有表达抗原靶蛋白的第二细胞的
情况下与为cd28阳性免疫细胞的第一细胞(例如t细胞)接触时，所述结合分子不诱导cd28信号传导，并且优选不活化免疫细胞(t细胞)。
[0222]
项目4.项目1至3中任一项的用途的结合分子，其中抗原靶蛋白选自在与增殖性病症相关的细胞上表达的蛋白、与病原生物(如寄生虫、病毒或细菌)相关的蛋白或其他分子。
[0223]
项目5.项目1至4中任一项的用途的结合分子，其中所述抗原靶蛋白是内皮糖蛋白。
[0224]
项目6.项目1至5中任一项的用途的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点中的每一个与所述至少一个第二抗原结合位点直接连接，例如共价或非共价连接。
[0225]
项目7.项目1至6中任一项的用途的结合分子，其包括至少两个第二抗原结合位点。
[0226]
项目8.项目1至7中任一项的用途的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点结合cd28上的相同表位，优选其中至少两个抗原结合位点相同。
[0227]
项目9.项目1至8中任一项的用途的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点和所述至少一个第二抗原结合位点中的至少一个通过包含一个或多个抗体衍生的人恒定结构域(优选igg的恒定结构域)的蛋白接头彼此连接，例如它们通过人igg衍生的ch1、ch2和/或ch3连接。
[0228]
项目10.项目1至9中任一项的用途的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点包含抗体重链序列和抗体轻链序列(优选至少cdr1至cdr3)，各自衍生自包含在由seq id no:2、3、4、5、7、8或9中所示的抗体序列中的c末端结合位点，并与所述c末端结合位点竞争性结合相同的抗原。
[0229]
项目11.项目1至10中任一项的用途的结合分子，其中所述至少一个第二抗原结合位点包含抗体重链序列和抗体轻链序列，它们各自衍生自包含在由seq id no:1和2组成的抗体中的n末端结合位点，并与所述n末端结合位点竞争性结合至相同的抗原。
[0230]
项目12.项目1至11中任一项的用途的结合分子，其中所述结合分子特异性结合免疫细胞和与疾病相关的细胞，优选其中所述免疫细胞是参与细胞介导的免疫应答的免疫细胞，例如细胞毒性免疫应答或辅助细胞介导的免疫应答。
[0231]
项目13.项目1至12中任一项的用途的结合分子，其中免疫细胞优选是细胞毒性细胞或辅助细胞，例如表达cd28和cd3(以及tcr)的细胞，并且优选是t细胞。
[0232]
项目14.项目1至13中任一项的用途的结合分子，其中所述受试者的特征在于cd3/tcr信号传导通过治疗被激活，或内源性地响应于疾病相关抗原，例如抗原蛋白。
[0233]
项目15.项目1至14中任一项的用途的结合分子，其中所述治疗进一步包括针对与疾病相关的细胞刺激和/或活化免疫细胞，例如t细胞的活化和/或刺激。
[0234]
项目16.项目1至15中任一项的用途的结合分子，其包括两个抗体重链序列和两个抗体轻链序列，并且其中
[0235]
(i)所述至少两个第一抗原结合位点中的一个与所述两条抗体轻链序列中的一条的c末端共价连接，并且所述至少两个第一抗原结合位点中的另一个与两条抗体重链序列中的另一条的c末端共价连接；或
[0236]
(ii)所述至少两个第一抗原结合位点中的一个共价连接至所述两条抗体重链序列中的一条的c末端，并且所述至少两个第一抗原结合位点中的另一个共价连接至两个抗
体重链序列中的另一条的c末端。
[0237]
项目17.项目16的用途的结合分子，其中所述结合位点在没有肽接头的情况下或通过具有不超过氨基酸的短肽接头，或通过具有至少6个、优选高达50个氨基酸的长肽接头连接，其中进一步优选所述肽接头是(ggggs)n接头，并且n大于或等于2。
[0238]
项目18.前述项目中任一项的用途的结合分子，其中所述至少一个第二抗原结合位点包含fab、f(ab')2或最优选igg。
[0239]
项目19.项目1至18中任一项的用途的结合分子，其中治疗包括顺序或伴随施用(i)另一种结合分子，其是双特异性的并且能够特异性结合(和活化)t细胞，例如通过结合cd3和/或t细胞受体(tcr)；或能够提供或增强t细胞活化信号的任何其他试剂，如(ii)表达抗原受体(如嵌合抗原受体(car))的遗传修饰的免疫细胞(异源或自体t细胞)，该受体能够特异性结合抗原靶蛋白，或(iii)提供来自感染剂或癌细胞的抗原结构(taa或tsa)的疫苗，或(iv)通过检查点分子如pd1阻断抑制性“第二信号”的试剂。这些试剂被称为检查点阻断剂。
[0240]
项目20.项目19的用途的结合分子，其中另外的结合分子是至少双特异性的，并且包括至少一个第三抗原结合位点和至少一个第四抗原结合位点，其中
[0241]
(i)所述至少一个第三抗原结合位点能够特异性结合cd3和/或t细胞受体(tcr)(cd3/tcr)；和
[0242]
(ii)所述至少一个第四抗原结合位点能够特异性结合在与受试者的疾病相关的细胞上或细胞中表达的另外的抗原靶蛋白的表位。
[0243]
项目21.项目17的用途的结合分子，其中抗原靶蛋白和另外的抗原靶蛋白(i)相同或(ii)不同，但在空间上彼此紧密接近，例如在与疾病相关的同一细胞上表达或位于同一疾病组织中，例如在同一肿瘤环境中表达。
[0244]
项目22.项目1至18中任一项的用途的结合分子，其中疾病是增殖性疾病，优选选自癌症疾病，例如癌症，例如肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨髓瘤、肾癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌或前列腺癌，特别是从由以下项组成的列表中选择的一种：黑色素瘤、肺癌(例如非小细胞肺癌)、膀胱癌(例如尿路上皮癌)、肾癌(例如肾细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)和霍奇金淋巴瘤。优选地，增殖性疾病是黑色素瘤或肺癌(例如非小细胞肺癌)，优选是靶抗原蛋白表达阳性的癌症。
[0245]
项目23.分离的结合分子，其中所述分离的结合分子是前述任一项目中所述的结合分子。
[0246]
项目24.分离的核酸，其编码项目23的分离的结合分子。
[0247]
项目25.重组宿主细胞，其包含项目23的分离的结合分子或项目24的分离的核酸。
[0248]
项目26.药物组合物，其包含项目23的分离的结合分子、项目24的分离的核酸、项目25的重组宿主细胞以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
[0249]
项目27.项目26的药物组合物，其进一步包含如项目19或20所述的分离的另外的结合分子。
[0250]
项目28.包装或药物组合物的试剂盒，所述试剂盒在单独的容器中包含：
[0251]
(i)前述任一项目中的分离的结合分子、编码所述分离结合分子的分离的核酸和/或包含这样的核酸或分离的结合分子的重组宿主细胞；和(ii)前述任一项目中的分离的另
外的结合分子、编码所述分离的另外的结合分子的分离的核酸、和/或包含这样的核酸或分离的另外的结合分子的重组宿主细胞。
[0252]
本文中使用的术语“本发明的”、“根据本发明”、“按照本发明”等旨在指本文中描述和/或列举的本发明的所有方面和实施方案。
[0253]
如本文所使用的，术语“包括”应被解释为包含“包括”和“由......组成”，这两个含义都是特意的，因此是根据本发明单独公开的实施方案。在本文中使用的情况下，“和/或”应被视为两个特定特征或组件中的每一个的具体公开，具有或不具有另一个。例如，“a和/或b”应被视为(i)a、(ii)b和(iii)a和b中每一个的具体公开，就像每一个在本文中单独列出的一样。在本发明的上下文中，术语“大约”和“近似”表示本领域技术人员将理解的精确区间，以仍然确保所述特征的技术效果。该术语通常表示与指示数值的偏差为
±
20％、
±
15％、
±
10％，例如
±
5％。如本领域技术人员所理解的，对于给定的技术效果，数值的具体这种偏差将取决于技术效果的性质。例如，天然或生物技术效果通常可能比人工制作或工程改造技术效果具有更大的偏差。如本领域技术人员所理解的，对于给定的技术效果，数值的具体这种偏差将取决于技术效果的性质。例如，天然或生物技术效果通常可能比人工制作或工程改造技术效果具有更大的偏差。如果在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一”、“一个”或“该”，则包括该名词的复数，除非另有特别说明。
[0254]
应当理解，根据本文所包含的教导，将本发明的教导应用于特定问题或环境，以及包括本发明的变型或其另外的特征(例如其他方面和实施方案)将在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0255]
除非上下文另有说明，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
[0256]
本文引用的所有参考文献、专利和出版物通过引用的方式全部纳入本文。
[0257]
附图和序列的简要描述
[0258]
附图显示：
[0259]
图1：显示了在不同细胞系上b7h3-和内皮糖蛋白表达的定量。将标示的细胞u937、ht-29和hek293t(dsmz，braunschweig,germany)与内皮糖蛋白抗体mkro-22孵育，并使用qifikit测定系统通过流式细胞术进行分析(nd：不可检测的)。
[0260]
图2：显示了从一组新开发的内皮糖蛋白抗体中选择高亲和力结合剂。通过流式细胞术(a)和biacore分析(b)测定不同抗体的亲和力。
[0261]
图3：显示了本技术中使用的双特异性抗体变体：(a)具有b7h3xtcr/cd3特异性的iggsc形式的bsab(bsabcd3)，其为t细胞活化提供减弱的第一信号；(b-e)iggsc形式的双特异性内皮糖蛋白xcd28抗体的变体(bicos)。单链部分与igg抗体的重链和轻链融合，如使用不同长度的接头所示。bico变体被命名为hc-l(b)、hc+l(c)、lc-l(d)和lc+l(e)；f)bico变体，其包含其cd28结合部分作为n-末端fab2-而不是c-末端单链部分。有关更多信息，请参阅序列表。
[0262]
图4：示出了不同bico变体与人cd4+和cd8+t细胞上表达的cd28的结合。将pbmc与相应的构建体孵育并随后通过流式细胞术进行分析，确定变体与正常人t细胞的结合。
[0263]
图5：示出了bico变体对u937和ht-29靶细胞的共刺激活性，u937和ht-29靶细胞分别表现出高和低内皮糖蛋白表达。将单核细胞耗尽的pbmc与照射的靶细胞以及双特异性
b7h3xcd3构建体和四种不同bico变体中的一种以分别在(a)和(f)的左上角以及x轴所示的标示浓度一起孵育。孵育3天后，测量3h-胸苷摄取以评估t细胞增殖。在e和j中，示出了在不存在相应靶细胞的情况下的对照实验。在这些实验中，bsabcd3和bicos的浓度分别为1μg/ml和2μg/ml。
[0264]
图6：示出了bico变体对u937和hek293靶细胞的共刺激活性，u937和hek293靶细胞分别具有高水平的和检测不到的内皮糖蛋白表达。实验条件与图5中的条件相同，除了使用了固定浓度的bsabcd3和bicos(分别为0.2μg/ml和0.4μg/ml)
[0265]
图7：示出了bico变体和用于其构建的单特异性、二价cd28抗体的共刺激活性。实验条件与图5中的条件相同。bsabcd3的抗体浓度为0.2μg/ml，所有其他抗体的抗体浓度均为1.0μg/ml。
[0266]
图8：示出了在免疫功能受损小鼠模型中，bsabcd3 bei bico1(lc+l变体)的抗肿瘤活性的增强。将3x10exp6 ht-29结肠癌细胞静脉注射到nsg小鼠中。6小时后，将人pbmc(2x10exp 7)单独或与2nm bsabcd3、50nm bico-1或50nm bico-ctr一起静脉内单独或组合施用，如所示。在第4天重复用抗体进行治疗。在第8天，处死小鼠，并在酶消化后通过流式细胞术定量肺中的人pbmc和肿瘤细胞。左图，肺中癌细胞的百分比；右图，效应子细胞增殖。使用mann-whitney检验进行统计分析(**p《0.01，***p《0.001)。bico-ctr是lc+l形式的具有不相关靶标特异性的bico(psmaxcd28)。
[0267]
图9：示出了本发明的另一种双特异性抗体(“bico-2”)的结果；图a描绘了本发明的两种双特异性抗体的结构；图b描绘了通过各种浓度的具有b7h3xcd28特异性的bico(bico-2，x轴)与各种浓度的cc-1(具有psmaxcd3特异性的双特异性抗体)组合的t细胞增殖(a左侧)。图的右侧小图显示了使用相同实验设置的数据，其中bico-2由对照bico取代，其中psma结合部分由针对无关靶抗原(mopc)的抗体取代。示出了用不同健康供体的外周血单核细胞(pbmc)进行的三个实验中的一个代表。
[0268]
图10：示出了本发明的另一双特异性抗体(“bico-3”)的结果；图a示意性地描绘了本发明的两种双特异性抗体的结构；图中的图b描绘了在存在(i)表达人fap(hfap转染的sp2/0细胞)或psma(lncap细胞)的两种不同靶细胞，命名为“sp2/0hfap”的设置，或(ii)表达psma的细胞和包被的重组fap蛋白(“hfap)的情况下，由固定浓度的具有fapxcd28特异性的两种bico变体(bico-3，0.1μg/ml＝0.5nm)和低浓度的具有psmaxcd3特异性的双特异性抗体(cc-1，1ng/ml＝0.005nm)诱导的t细胞增殖。命名为“mfap”的条形图描述了存在包被的鼠fap蛋白的情况下的结果。注意，使用了两种bico变体，一种包含对人fap产生排他性反应的抗体(“sibrox9.3-8”)，另一种包含针对人和鼠fap产生反应的抗体(“mfp5x9.3-8”)。在图的小图c中，探索了在没有抗体的情况下的各种对照设置，包括那些具有泛克隆t细胞刺激剂pha的对照设置。
[0269]
图11：示出了双特异性共刺激抗体形式的比较。图a描述了在这些实验中使用的构建体；图b显示了在表达b7h3(但不是内皮糖蛋白)、具有b7h3xcd3特异性(cc-3)的双特异性抗体(bsab)和具有内皮糖蛋白xcd28特异性的各种bsab的lncap细胞存在下的t细胞增殖。engxcd28lc+l是指在例如图8所示的实验中使用的bico分子，命名为bico-1。这些分子的共同点是cd28抗体以c末端二价单链部分的形式包含。cd28xenglc+l和cd28xenghc+l是指具有倒置的排列的分子，即与n末端二价cd28抗体的轻链或重链融合的内皮糖蛋白结合单c端
二价单链部分(图a中倒置的bico-1)。在图c中显示了在不存在所评估的抗体的情况下的各种对照设置，包括一种包含多克隆t细胞促细胞分裂剂pha的设置。
[0270]
图12：示出了本发明改进的hu9.3.8.v1 cd28抗体构建体的突变序列和标示位置。
[0271]
图13：示出了本发明的bico构建体的优化。对cd28 scfv的序列变体进行蛋白质聚集测试。bico-1opt(＝变体1)的表征，其是原始bico-1分子的改进版本，其包含(i)新的fc修饰，其提供fcr结合的减弱以及血清半衰期(lala-yte)的延长，以及(ii)cd28抗体的vh和vl结构域中的5种修饰，以改善聚集趋势和可生产性。
[0272]
图14：显示了旧的bico1分子和优化的变体1的共刺激活性的比较。
[0273]
序列显示：
[0274]
表1：本发明的抗体序列
[0275]
[0276]
[0277]
[0278]
[0279]
[0280][0281]
表2：内皮糖蛋白抗体序列
[0282]
[0283]
实施例
[0284]
本发明的某些方面和实施方案现在将通过实施例的方式并参考本文中给出的描述、附图和表格进行说明。本发明的方法、用途和其他方面的这些实施例仅是代表性的，不应将本发明的范围限制为仅这些代表性实施例。
[0285]
实施例显示：
[0286]
实施例1：对cd28和内皮糖蛋白具有结合特异性的双特异性共刺激(“bico”)抗体。
[0287]
用于本发明的基于igg的分子部分基于coloma&morrison描述的构建体(iggsc形式)，其中单链部分融合在正常igg抗体重链的c末端之后[22]。此外，发明人使用了其中两条单链已经融合到轻链的c末端的构建体。发明人进一步在融合位点添加短和长接头，以允许cd28结合部分的可变亲和力(参见图3)。
[0288]
例如，图3所示共刺激构建体中的taa抗体针对内皮糖蛋白(cd105)，内皮糖蛋白在癌症相关成纤维细胞以及一些白血病细胞上表达，最重要的是，在许多实体肿瘤的血管系统上表达[23]。该试剂是基于其优越的亲和力从一组新产生的抗体中选择的(图2)。对所用的内皮糖蛋白克隆进行测序，序列如表2所示。该克隆的特征在于具有改进的结合亲和力。
[0289]
bicos与针对tcr/cd3复合体的特定表位的b7h3xtcr/cd3-bsab(bsabcd3)组合进行评估，为t细胞活化提供减弱的“第一信号”。这导致很大程度上依赖于cd28的活化，并因此导致如上所述的组合的增加的特异性。
[0290]
抗体在人单核细胞耗尽的pbmc(外周血单核细胞)培养物和辐照的肿瘤靶细胞的共培养物中测试，所述肿瘤靶细胞表现出(i)高或(ii)低或(iii)检测不到内皮糖蛋白的表达。单核细胞耗尽的pbmc用于防止bico变体与单核细胞谱系的活化细胞上表达的内皮糖蛋白结合。
[0291]
在第一轮实验中，表明所有bico变体以靶细胞限制的方式大大增强了pbmc培养物中t细胞的bsabcd3诱导的活化。通过(i)在不存在靶细胞的情况下，或者甚至更具体地(ii)在缺乏内皮糖蛋白(bicos的靶抗原)但表达b7h3(bsabcd3的靶抗原)的靶细胞的存在下，活性的缺乏来证明相当高抗体浓度下的靶细胞限制。重要的是，在这些实验中清楚地表明，只有两种bsab的组合才能有效诱导t细胞活化，因此，由于所证明的靶细胞限制性，t细胞活化依赖于两种靶抗原的存在。bsabcd3和bicos任一个单独都没有发挥活性。
[0292]
在第二轮实验中，同样显示在靶细胞存在的情况下，针对未表达的靶抗原(纤连蛋白的细胞外结构域b，edb)的bico分子不表现出共刺激活性。相反，单特异性、二价cd28抗体(以c末端单链部分的形式存在于bico构建体中)发挥惊人的共刺激活性，而与靶细胞上任何特定抗原的表达无关。
[0293]
因此，如上所述证明的靶细胞限制是出乎意料的。最引人注目的是靶向特定内皮糖蛋白的bico变体hc+l的不受限制的共刺激活性，该变体包含作为n末端fab2-而不是c末端单链部分的cd28结合部分(参见图3f和图7)。
[0294]
最后，在用人pbmc过继转移的免疫功能受损小鼠中，bico变体lc+l在很大程度上增强了bsabcd3的抗肿瘤活性(图8)。
[0295]
实施例2：对cd28和b7h3具有结合特异性的双特异性共刺激(“bico-2”)抗体。
[0296]
bico-2抗体的结构如图9a所示。bico-2构建体对b7h3的结合功能来源于wo 2021/099347中公开的抗体克隆7c4(其全部内容通过引用纳入本文)。双特异性cc-1构建体描述
于wo/2017/121905(其全部内容通过引用纳入本文)中。
[0297]
在96孔组织培养板中单核细胞耗尽的pbmc(每孔2x10exp5)与表达靶抗原psma和b7h3的经辐照的lncap前列腺癌细胞(每孔0,5x10exp5)以及标示的抗体浓度一起孵育。2天后，加入3h-胸苷(每孔0.5μci)，再过20小时后收获平板，并使用micro beta闪烁计数器测定掺入细胞的放射性。
[0298]
有趣的是，bico-2构建体显著增强了cc-1诱导的t细胞增殖，而针对无关靶抗原相同的对照抗体则没有。bico-2效应在低cc-1浓度(1ng/ml)下最显著，其中增殖几乎完全依赖于bico-1。在较高的cc-1浓度下，单独cc-1可诱导显著的t细胞增殖。
[0299]
实施例3：另一种对cd28和成纤维细胞活化蛋白(fab)具有结合特异性的双特异性共刺激(“bico-3”)抗体
[0300]
bico-3抗体的结构如图10a所示。bico-3构建体的fab的结合功能来源于hfab的抗体克隆sibrox9.3-8和mfab的抗体颗粒mfp5x9.3-。双特异性cc-1构建体描述于wo/2017/121905(其全部内容通过引用纳入本文)中。
[0301]
将人单核细胞耗尽的pbmc(每孔10exp5)与0.1μg/ml的fapxcd28变体和1ng/ml的psmaxcd3抗体一起与用人fap转染的经辐照的sp2/0细胞(每孔0,5x10exp5)和经辐照的表达psma的人lncap细胞(每孔0,5x10exp5)一起孵育。备选地，在先前用1μg/ml重组人或小鼠fap包被的孔中仅使用经辐照的lncap细胞。2天后，加入3h-胸苷(每孔0.5μci)，再过20小时后，收获平板，并使用micro beta闪烁计数器测定掺入细胞的放射性。结果如图10b和图10c所示。
[0302]
结果表明，添加具有fapxcd28特异性的bico分子显著且特异性地增强了由低浓度cc-1诱导的t细胞增殖，即使不同的靶抗原存在于单独的细胞上或作为包被蛋白。
[0303]
实施例4：只有使用在一个双特异性共刺激抗体构建体中具有scfv抗cd28与f(ab)靶细胞特异性抗体组合的构建体中靶细胞限制才是可能的。
[0304]
在96孔组织培养板中,单核细胞耗尽的pbmc(每孔10exp5)与经辐照的lncap细胞(每孔0.5
×
10exp5)、cc-3(10ng/ml)和标示浓度的双特异性共刺激物一起孵育。2天后，加入3h-胸苷(每孔0.5μci)，再过20小时后收获平板，并使用micro beta闪烁计数器测定掺入细胞的放射性。结果如图11所示。
[0305]
具有天然n端cd28结合部分的倒置分子与cc-3一起发挥显著的共刺激作用，尽管不存在它们可能结合的内皮糖蛋白。对于bico-1，这种类型的非特异性和不期望的共刺激远没有那么明显，并且仅在非常高的抗体浓度下检测到。该结果表明，本文所公开的bico结构优于其他已知的双特异性形式。
[0306]
实施例5：bico-1序列的优化
[0307]
引入图12中列出的cd28 scfv(重轻链序列)的序列修饰，用各自的构建体转染cho细胞，并使用superdex s200柱(a和b)通过蛋白a亲和和大小排阻层析纯化蛋白质。在图c中，比较了原始蛋白质和修饰蛋白质的聚集体％和生产率。
[0308]
图13的结果表明，优化的分子表现出较低的聚集倾向和提高的生产率。
[0309]
为了将bico的新变体与原始分子进行比较，将单核细胞耗尽的pbmc与表达b7h3和内皮糖蛋白经辐照的u937细胞、双特异性b7h3xcd3抗体以及具有内皮糖蛋白xcd28特异性的bico-1抗体的旧变体以及优化变体(v1＝hv)一起孵育。2天后，加入3h-胸苷(每孔0.5μ
ci)，再过20小时后收获平板，并使用micro beta闪烁计数器测定掺入细胞的放射性。
[0310]
图14所示的结果表明，两种bico-1变体诱导的t细胞增殖是无法区分的。因此，该序列变体具有相当的生物学活性，同时不太容易聚集。
[0311]
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技术特征：
1.结合分子，其至少是双特异性的，包括至少两个第一抗原结合位点和至少一个第二抗原结合位点，用于受试者的疾病的治疗，其中(i)所述至少两个第一抗原结合位点能够特异性结合t细胞特异性表面糖蛋白cd28的表位，并且各自作为抗体的抗原结合片段提供，所述抗原结合片段不是fab、f(ab')2或igg；和(ii)所述至少一个第二抗原结合位点能够结合与在所述受试者中的所述疾病相关的细胞上或细胞中表达的抗原靶蛋白的表位，并且其中所述至少一个第二抗原结合位点衍生自抗体或抗体样分子并且包含fab、f(ab')2或igg；其中所述治疗包括向所述受试者施用所述结合分子。2.权利要求1的用途的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点各自作为单链fv(scfv)提供。3.权利要求1或2的用途的结合分子，其中当在不存在表达抗原靶蛋白的第二细胞的情况下，所述结合分子与为cd28阳性免疫细胞的第一细胞(例如t细胞)接触时，不诱导cd28信号传导。4.权利要求1至3中任一项的用途的结合分子，其中抗原靶蛋白选自在与增殖性病症相关的细胞上表达的蛋白、与病原生物相关的蛋白或其他分子。5.权利要求1至4中任一项的用途的结合分子，其中所述抗原靶蛋白是内皮糖蛋白、fab或b7h2。6.权利要求1至5中任一项的用途的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点中的每一个与所述至少一个第二抗原结合位点直接连接。7.权利要求6的用途的结合分子，其中所述结合分子包括相等数量的第一和第二抗原结合位点，并且其中所述至少两个第一抗原结合位点中的一个末端连接(通过肽键)至所述至少两个第二抗原结合位点中的一个的轻链(或备选地重链)，并且其中所述至少两个第一抗原结合位点中的另一个末端连接(通过肽键)至所述至少两个第二抗原结合位点中的另一个的轻链(或备选地重链)。8.权利要求1至6中任一项的用途的结合分子，其包括至少两个第二抗原结合位点。9.权利要求1至6中任一项的用途的结合分子，其中所述结合分子包含精确且不超过两个第一抗原结合位点和精确且不超过一个或两个第二抗原结合位点。10.权利要求1至9中任一项的用途的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点结合cd28上的相同表位。11.权利要求1至10中任一项的用途的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点中的至少一个和所述至少一个第二抗原结合位点通过蛋白接头彼此连接，所述蛋白接头包含一个或多个抗体衍生的人恒定结构域。12.权利要求1至11中任一项的用途的结合分子，其中所述至少两个第一抗原结合位点包含抗体重链序列和抗体轻链序列，其各自衍生自包含在seq id no:2、3、4、5、7、8或9所示的抗体序列中的c末端结合位点，并与所述c末端结合位点竞争性结合至相同的抗原。13.权利要求1至12中任一项的用途的结合分子，其中所述至少一个第二抗原结合位点包含抗体重链序列和抗体轻链序列，其各自衍生自包含在seq id no:1和2组成的抗体中包含的n末端结合位点，并与所述n末端结合位点竞争性结合至相同的抗原。
14.权利要求1至13中任一项的用途的结合分子，其中所述结合分子特异性结合免疫细胞和与疾病相关的细胞，其中所述免疫细胞是参与细胞介导的免疫应答的免疫细胞。15.权利要求1至14中任一项的用途的结合分子，其中免疫细胞是表达cd28和cd3以及tcr的细胞。16.权利要求1至15中任一项的用途的结合分子，其中所述受试者的特征在于cd3/tcr信号传导通过治疗被激活，或内源性地响应于疾病相关抗原。17.权利要求1至16中任一项的用途的结合分子，其中所述治疗进一步包括刺激和/或活化针对与疾病相关的细胞的免疫细胞。18.权利要求1至17中任一项的用途的结合分子，其包括两个抗体重链序列和两个抗体轻链序列，并且其中(i)所述至少两个第一抗原结合位点中的一个与所述两条抗体轻链序列中的一条的c末端共价连接，并且所述至少两个第一抗原结合位点中的另一个与两条抗体轻链序列中的另一条的c末端共价连接；或(ii)所述至少两个第一抗原结合位点中的一个共价连接至所述两条抗体重链序列中的一条的c末端，并且所述至少两个第一抗原结合位点中的另一个共价连接至两个抗体重链序列中的另一条的c末端。19.权利要求18的用途的结合分子，其中所述结合位点在没有肽接头的情况下连接或通过具有不超过5个氨基酸的短肽接头，或通过具有至少6个、优选多达50个氨基酸的长肽接头连接，其中进一步优选地，所述肽接头是(ggggs)
n
接头，并且n大于或等于2。20.权利要求1至19中任一项的用途的结合分子，其中治疗包括顺序或伴随施用(i)另一种结合分子，其是双特异性的并且能够特异性结合(和活化)t细胞，例如通过结合cd3和/或t细胞受体(tcr)；或能够提供或增强t细胞活化信号的任何其他试剂，如(ii)表达抗原受体(如嵌合抗原受体(car))的遗传修饰的免疫细胞(异源或自体t细胞)，该受体能够特异性结合抗原靶蛋白，或(iii)提供来自感染剂或癌细胞的抗原结构(taa或tsa)的疫苗，或(iv)通过检查点分子如pd1阻断抑制性“第二信号”的试剂。21.权利要求20的用途的结合分子，其中另外的结合分子是至少双特异性的，并且包括至少一个第三抗原结合位点和至少一个第四抗原结合位点，其中(i)所述至少一个第三抗原结合位点能够特异性结合cd3和/或t细胞受体(tcr)(cd3/tcr)；和(ii)所述至少一个第四抗原结合位点能够特异性结合在与受试者的疾病相关的细胞上或细胞中表达的另外的抗原靶蛋白的表位。22.权利要求21的用途的结合分子，其中抗原靶蛋白和另外的抗原靶蛋白(i)相同或(ii)不同，但在空间上彼此紧密接近，例如在与疾病相关的同一细胞上表达或位于同一疾病组织中，例如在同一肿瘤环境中表达。23.权利要求1至22中任一项的用途的结合分子，其中疾病是增殖性疾病，优选选自癌症疾病，例如癌症，例如肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、骨髓瘤、肾癌、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌或前列腺癌，特别是从由以下项组成的列表中选择的一种：黑色素瘤、肺癌(例如非小细胞肺癌)、膀胱癌(例如尿路上皮癌)、肾癌(例如肾细胞癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)和霍奇金淋巴瘤。优选地，增殖性疾病是黑色
素瘤或肺癌(例如非小细胞肺癌)，优选是靶抗原蛋白表达阳性的癌症。24.分离的结合分子，其中所述分离的结合分子是前述权利要求任一项中所述的结合分子。25.分离的核酸，其编码权利要求24的分离的结合分子。26.重组宿主细胞，其包含权利要求24的分离的结合分子或根据权利要求25的分离的核酸。27.药物组合物，其包含权利要求24的分离的结合分子、权利要求25的分离的核酸、权利要求26的重组宿主细胞以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。28.权利要求27的药物组合物，其进一步包含如权利要求20或21所述的分离的另外的结合分子。29.包装或药物组合物的试剂盒，所述试剂盒在单独的容器中包含：(i)前述权利要求任一项中所述的分离的结合分子、编码所述分离的结合分子的分离的核酸、和/或包含这样的核酸或分离的结合分子的重组宿主细胞；和(ii)前述权利要求任一项中所述的分离的另外的结合分子、编码所述分离的另外的结合分子的分离的核酸、和/或包含这样的核酸或分离的另外的结合分子的重组宿主细胞。30.用于药物的化合物或组合物，其中所述化合物或组合物包含前述权利要求任一项所述的结合分子、前述权利要求任一项所述的分离的核酸、前述权利要求任一项所述的重组宿主细胞、前述权利要求任一项所述的药物组合物，或前述权利要求任一项所述的试剂盒。

技术总结
本发明提供了一种新的双特异性抗CD28抗体形式，其是二价的并且包含两个CD28结合位点和至少一个靶标结合位点。本发明的双特异性抗CD28抗体由于其严格的靶细胞限制性的共刺激活性而具有令人惊讶的优势。本发明的双特异性CD28抗体被提供用于单独或与诱导CD3/T细胞受体信号的另一双特异性抗体组合来治疗疾病。体信号的另一双特异性抗体组合来治疗疾病。体信号的另一双特异性抗体组合来治疗疾病。


技术研发人员：赫尔穆特
受保护的技术使用者：图宾根埃伯哈德
技术研发日：2021.11.03
技术公布日：2023/8/24