改进的小分子的制作方法

1.本发明涉及新的小分子e3泛素连接酶蛋白结合配体化合物以及其在蛋白水解靶向嵌合体(protac)中的效用及其制备方法以及其在医学中的用途。本发明特别地涉及与布罗莫和额外末端(bromo-andextra-terminal，bet)蛋白质家族中的蛋白质结合的protac，并且尤其涉及包含小分子e3泛素连接酶蛋白结合配体化合物的protac，所述protac诱导bet蛋白质家族布罗莫结构域中brd2蛋白的优先降解。
背景技术：
：：2.通常根据是二价还是一价以用于结合而分类为protac或分子胶的靶向降解化合物已显示出作为用于研究生物学和治疗剂以用于治疗疾病的一类新的化学探针的巨大的前景1至3。3.降解剂形成三元复合物，使靶蛋白和e3泛素连接酶组分合在一起，导致泛素化以及随后通过蛋白酶体的靶蛋白降解。4.分子胶通常与e3连接酶或靶标单价接合，并随后偶然地诱导三元复合物中非同源配偶体的高度协作性募集4至8。5.相比之下，protac通常被认为是双官能的，即由通过接头连接的两个配体构成，并且作为结果可在二元复合物中单独与靶标或e3组分接合，或者同时与靶标和e3组分二者接合以形成三元复合物9至11。这种设计特征使protac不仅比分子胶的靶范围更广，而且能够使用建立的e3连接酶结合剂使设计标准化。实际上，已开发了有效的protac降解剂以最常见地针对包括核蛋白12131415，16、胞质蛋白11，17，18、膜结合蛋白19和多次跨膜蛋白20在内的广泛蛋白质靶标募集vonhippel-lindau(vhl)或cereblon(crbn)e3连接酶。6.由于它们通过三元复合物的复合作用模式，因此protac与它们所构成的抑制剂相比显示出意料之外的优势。例如，protac可针对高度同源物靶标进行区分21至24，并且由于催化作用机制，可表现出比预期大得多的效力，这可补偿低的二元结合亲和力或差的细胞通透性，并且允许使用弱的非官能抑制剂作为弹头配体(warheadligand)15，22，25，26。7.此外，即使通过旁观者泛素化或去稳定作用不直接被降解剂接合，protac也可影响复合物中的蛋白质15，27，28。尽管已表明了上述优势和显著的成功，但有效设计protac仍可是挑战性的，通常需要大量的化学优化29，30。8.与抑制剂不同，降解剂必须在简单的二元接合之外发挥作用。相比之下，它们必须在一连串事件中发挥作用，不仅诱导非天然相互作用的两种蛋白质之间的接近，而且产生有效的三元复合物，该复合物在结构上定位靶蛋白以用于通过e3连接酶的有效泛素化3132，33。9.最近对protac三元复合物的x射线晶体结构和相关生物物理研究已巧妙地证明，一些protac介导的三元复合物像分子胶一样能够协同结合，最显著表明的是vhl-mz1-brd4-bd2三元复合物21。本研究和后续研究已表明如何才能在催化低浓度下驱动有效的靶标泛素化和显著的靶标降解，降解剂需要形成具有足够稳定性、协同性和停留时间的复合物其通过有利的复合物内相互作用增强15，21，22，31，32。10.用常规的protac降解剂实现这样的分子识别特征的最佳“黏合(gluing)”可能是挑战性的，所述降解剂在目的靶标处根据定义是单价的。这限制了其在三元复合物内利用有利的蛋白质-蛋白质和其他稳定相互作用的能力。11.实际上，经常观察到非协同或甚至负协同protac三元复合物，其虽然允许下游蛋白质泛素化和降解，但可导致降解剂的不利药理学特性(例如在较高浓度下显著的钩状效应)，经常导致缓慢和不完全的靶标降解17，34。12.本发明的一个目的是减轻或解决这些问题中的至少一些。13.发明概述14.本发明人已开发了一种新策略，其利用三价protac以增强布罗莫和额外末端(bet)结构域家族成员蛋白brd2、brd3和brd4的靶向蛋白质降解。本发明人已开发了一种策略以协同二价靶配体与e3连接酶募集的作用来产生具有增强的亲合力、协同性和靶标降解的三价protac。15.在第一方面中，提供了式i化合物，或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物：[0016][0017]其中b和d各自是与待被泛素连接酶降解的靶蛋白或多肽结合的配体；[0018]其中a是e3泛素连接酶蛋白结合配体；[0019]其中m、n和o各自独立地选自0、1、2、3、4、5和6。[0020]在所述式i化合物中，m和n可各自独立地选自2、3、4、5和6。在一些优选的式i化合物中，m和n可各自独立地选自2、3和4。[0021]在所述式i化合物中，m和n二者可相同，并且选自2、3、4、5和6。在一些优选的式i化合物中，m和n二者可相同并且选自2、3和4。在另一些优选的式i化合物中，m和n二者都可以是3。[0022]在所述式i化合物中，o可选自0和1。在一些优选的式i化合物中，o可以是0。[0023]在所述式i化合物中，b和d各自可以是与布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中的蛋白质结合的化学部分。在所述式i化合物中，b和d各自可以是诱导布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中brd2、brd3和/或brd4蛋白降解的化学部分。[0024]在所述式i化合物中，b和d可各自独立地选自：[0025](i)[0026](ii)[0027](iii)和[0028](iv)[0029]在一些优选的实施方案中，b和d中的至少一个是在一些优选的实施方案中，的手性中心具有s构型。在一些实施方案中，b或d中的一个是并且b或d中的另一个是也就是说，在一些实施方案中，b或d中的一个是在手性中心具有s构型的并且b或d中的另一个是在手性中心具有r构型的在一些最优选的实施方案中，b和d二者都是(即b和d二者是在手性中心具有s构型的[0030]在所述式i化合物中，a可选自vonhippel-lindau(vhl)-e3泛素连接酶结合配体或cereblon(crbn)-e3泛素连接酶配体。[0031]在所述式i化合物的一些优选实施方案中，a可选自：[0032](i)[0033](ii)和[0034](iii)[0035]在所述式i化合物的另一些优选的实施方案中，a可选自：[0036](i)和[0037](ii)[0038]在甚至另一些优选的实施方案中，a可以是[0039][0040]所述式i化合物可具有式ia：[0041][0042]其中p选白2、3、4、5和6；[0043]其中q选自0、1和2；[0044]或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物。[0045]在一些优选的式ia化合物中，p可选自2、3和4。在另一些优选的式ia化合物中，p可以是3。[0046]在一些优选的式ia化合物中，q可选自0和1。在另一些优选的式ia化合物中，q可以是0。[0047]所述式i化合物可具有式ib：[0048][0049]其中r选自2、3、4、5和6；[0050]其中s选自0、1和2；[0051]或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物。[0052]在一些优选的式ib化合物中，r可选自2、3和4。在另一些优选的式ib化合物中，r可以是3。[0053]在一些优选的式ib化合物中，s可选自0和1。在另一些优选的式ib化合物中，s可以是0。[0054]所述式i化合物可具有式ic：[0055][0056]其中t选自2、3、4、5和6；[0057]其中u选自0、1和2；[0058]或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物。[0059]在一些优选的式ic化合物中，t可选自2、3和4。在另一些优选的式ic化合物中，t可以是3。[0060]在一些优选的式ic化合物中，u可选自0和1。在另一些优选的式ic化合物中，u可以是0。[0061]所述式i化合物可具有式id：[0062][0063]其中v选自2、3、4、5和6；6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-14-(13-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-12-氧代-2，5，8-三氧杂-11-氮杂十三烷基)-14-甲基-2，18-二氧代-6，9，12，16-四氧杂-3，19-二氮杂二十一烷-21-酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺；[0077](ix)n，n’‑(8-((2-(((s)-1-((2s，4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-8-甲基-3，6，10，13-四氧杂十五烷-1，15-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)；[0078]或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物。[0079]本文中使用的术语“可药用盐”是指通过本发明的方法形成的化合物的那些盐，它们在合理医学判断的范围内适用于与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变应性应答等并与合理的收益/风险比相称。可药用盐是本领域公知的。例如，s.m.berge等人在j.pharmaceuticalsciences，66：1-19(1977)中详细描述了可药用盐。所述盐可在本发明化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过游离碱官能团与合适的有机酸反应单独制备。适用于本文中用途的可药用盐的一些实例包括但不限于无毒的酸加成盐，其是与无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(例如乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的或者通过使用本领域中使用的其他方法(例如离子交换)形成的氨基的盐。[0080]其他可药用盐包括但不限于己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐(lactobionate)、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。另一些可药用盐在适当时包含使用反离子例如卤化物、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、具有1至6个碳原子的烷基、磺酸根和芳基磺酸根形成的胺阳离子和无毒铵、季铵。[0081]本发明的protac化合物可作为在体内释放本发明化合物的可药用前药来施用。本文中使用的“前药”意指可通过代谢方式(例如通过水解)在体内转化为由本发明的式描述的任何化合物的化合物。多种形式的前药在本领域是已知的，例如，在″designandapplicationofprodrugs，textbookofdrugdesignanddevelopment，chapter5，113—191(1991)；bundgaard，etal.，journalofdrugdeliverreviews，8：1-38(1992)；和bernardtestaandjoachimmayer，″hydrolysisindrugandprodrugmetabolism-chemistry，biochemistryandenzymology，″johnwileyandsons，ltd.(2003)中讨论的。[0082]本发明设想的取代基和变化的组合仅仅是导致形成稳定化合物的那些。本文中使用的术语“稳定的”是指这样的化合物，其具有足以允许制备的稳定性并且维持化合物的完整性持续足够的一段时间以用于本文所详细说明的目的(例如，对对象的治疗性或预防性施用)。[0083]相关术语将根据上面提供的定义和本
技术领域：
：中的通常用法来相应地解释。[0084]用于如本文限定的式iprotac化合物的式i化合物可表示为限定的立体异构体。这样的化合物的绝对构型可使用本领域已知的方法(例如x-射线衍射或nmr)和/或来自已知立体化学的起始物质中的启示来确定。[0085]根据本发明的药物组合物将优选地包含所示立体异构体的基本上立体异构纯的制剂。[0086]如本文提及的化合物和中间体的纯立体异构形式被限定为基本上不含所述化合物或中间体的相同基本分子结构的其他对映体或非对映体形式的异构体。特别地，术语“立体异构纯的”涉及立体异构体过量至少80％(即一种异构体最少90％，而其他可能的异构体最多10％)最高至立体异构体过量100％(即一种异构体100％，且不含其他异构体)的化合物或中间体，更特别地，立体异构体过量90％最高至100％，甚至更特别地立体异构体过量94％最高至100％，并且最特别地立体异构体过量97％最高至100％的化合物或中间体。术语“对映体纯的”和“非对映体纯的”应该以类似的方式理解，但随后分别考虑所讨论的混合物的对映体过量和非对映体过量。[0087]本文详述的化合物和中间体的纯立体异构形式可通过应用本领域已知的过程获得。例如，对映体可通过其非对映体盐与光学活性酸或碱的选择性结晶而彼此分离。其实例是酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。或者，可使用手性固定相通过色谱技术分离对映体。所述纯立体化学异构形式也可来源于合适起始物质的相应纯立体化学异构形式，前提是反应立体特特定地发生。优选地，如果期望特定的立体异构体，则通过立体定向性的制备方法合成所述化合物。这些方法将有利地使用对映体纯的起始物质。[0088]用于本文限定的式iprotac化合物的式i化合物的非对映体外消旋体可通过常规方法单独获得。可有利地使用的合适的物理分离方法是，例如，选择性结晶和色谱，例如柱色谱。[0089]本发明提供了式iprotac化合物，其中b是与布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中的蛋白质结合的化学部分，优选地式iprotac化合物，其中b是与布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中独立地选自以下的蛋白质结合的化学部分：brd2、brd3和brd4，并且特别地式iprotac化合物，其中b是选择性地诱导布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中brd2蛋白降解的化学部分。[0090]在另一个方面中，本发明提供了如本文所限定的式iprotac化合物，其用作药物。[0091]本文使用的术语“对象”指哺乳动物。因此，对象指例如狗、猫、马、牛、猪、豚鼠等。优选地，对象是人。当对象是人时，对象在本文中也可称为患者。[0092]“治疗”及其变化形式是指缓解或减轻疾病和/或其伴随症状的方法。[0093]术语“治疗有效量”意指有效治疗、治愈或改善疾病、病症疾病或病痛的量。[0094]本发明的另一个方面提供了用于预防或治疗与布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中的一种或更多种蛋白质brd2、brd3和brd4的蛋白活性失调相关的疾病或病症的方法，其包括向患有或可能暴露于所述疾病或病症的对象施用式iprotac化合物。本发明的一个相关方面提供了式iprotac化合物在治疗或预防与bet蛋白活性失调相关的疾病或病症中的用途。另一个相关方面提供了如本文所限定的式iprotac化合物用于治疗或预防与bet蛋白活性失调相关的疾病或病症的用途。[0095]本发明的另一个方面提供了用于预防或治疗与布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中的一种或更多种蛋白质brd2、brd3和brd4的蛋白活性失调相关的疾病或病症的方法，其包括向患有或可能暴露于所述疾病或病症的对象施用治疗有效量的式iprotac化合物。本发明的一个相关方面提供了治疗有效量的式iprotac化合物在治疗或预防与bet蛋白活性失调相关的疾病或病症中的用途。另一个相关方面提供了治疗有效量的如本文所限定的式iprotac化合物用于治疗或预防与bet蛋白活性失调相关的疾病或病症的用途。[0096]本发明的另一个方面提供了用于预防或治疗与bet蛋白质家族布罗莫结构域中brd2蛋白的选择性降解相关的疾病或病症的方法，其包括向患有或可能暴露于所述疾病或病症的对象施用如本文所限定的式iprotac化合物。本发明的一个相关方面提供了式iprotac化合物在治疗或预防与bet蛋白质家族布罗莫结构域中brd2蛋白的选择性降解相关的疾病或病症中的用途。另一个相关方面提供了式iprotac化合物用于治疗或预防与bet蛋白质家族布罗莫结构域中brd2蛋白的选择性降解相关的疾病或病症的用途。[0097]可通过施用如本文所限定的式iprotac化合物来治疗的与布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中的一种或更多种蛋白brd2、brd3和brd4的蛋白活性失调相关的疾病或病症包括：癌症；良性增殖性病症；感染性或非感染性炎性事件；自身免疫病；炎性疾病；全身炎症反应综合征；病毒感染和疾病；以及眼科病症。[0098]本发明还提供了根据本文详述的任一方面或优选方面的式iprotac化合物，其用于医学，特别地涉及用于其中与布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中独立地选自以下的蛋白质结合的病症或疾病：brd2、brd3和brd4，并且特别地用于治疗一种或更多种独立地选自以下的病症或疾病：癌症；良性增殖性病症；感染性或非感染性炎性事件；自身免疫病；炎性疾病；全身炎症反应综合征；病毒感染和疾病；以及眼科病症。[0099]本文还提供了根据本文任一方面的式iprotac化合物，其用于治疗癌症，以及通过向需要这样的治疗的哺乳动物(特别是人)施用有效量的根据本文任一方面的式iprotac化合物来治疗癌症的方法。[0100]可通过施用如本文限定的式iprotac化合物来治疗的癌症类型包括：与上皮细胞病症相关的癌型癌症，例如，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌；与间充质细胞病症相关的肉瘤型癌症；淋巴瘤；白血病，例如急性髓系白血病；与多能细胞相关的癌症和/或癌性肿瘤例如睾丸癌和卵巢癌。[0101]本发明化合物可用于其治疗的癌症的一些实例包括：肾上腺癌、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端雀斑样痣黑素瘤、肢端螺旋体瘤、急性嗜酸性粒细胞白血病、急性红白血病、急性淋巴细胞白血病、急性原巨核细胞性白血病、急性单核细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、腺鳞癌、脂肪组织赘生物、肾上腺皮质癌、成人t细胞白血病/淋巴瘤、侵袭性nk细胞白血病、aids相关淋巴瘤、腺泡状横纹肌肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、成釉细胞纤维瘤、间变性大细胞淋巴瘤、甲状腺未分化癌、血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、血管平滑肌脂肪瘤、血管肉瘤、星形细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样瘤、b细胞慢性淋巴细胞性白血病、b细胞幼淋巴细胞白血病、b细胞淋巴瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、布伦纳瘤(brennertumor)、棕色瘤、伯基特淋巴瘤(burkitt’slymphoma)、乳腺癌、脑癌、癌、原位癌、癌肉瘤、软骨瘤、牙骨质瘤、髓系肉瘤、软骨瘤(chondroma)、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、肾透明细胞瘤、颅咽管瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、宫颈癌、结直肠癌、恶性萎缩性丘疹病、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、弥漫大b细胞淋巴瘤、胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、无性细胞瘤、胚胎性癌、内分泌腺赘生物、内胚窦瘤、肠病相关t细胞淋巴瘤、食道癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡状甲状腺癌、节细胞神经瘤、胃肠道癌、生殖细胞肿瘤、妊娠绒毛膜癌、巨细胞成纤维细胞瘤、骨巨细胞瘤、胶质肿瘤、胶质母细胞瘤、胶质瘤、大脑胶质瘤病、胰升糖素瘤、成性腺细胞瘤、颗粒细胞瘤、性腺母细胞瘤、胆癌、胃癌、毛细胞白血病、血管母细胞瘤、头颈癌、血管外皮细胞瘤、血液学恶性肿瘤、肝母细胞瘤、肝脾t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(hodgkin’slymphoma)、非霍奇金淋巴瘤、浸润性小叶癌、肠癌、肾癌、喉癌、恶性雀斑样痣、致死性中线性癌、白血病、睾丸间质细胞瘤、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、malt淋巴瘤、恶性纤维组织细胞瘤、恶性周围神经鞘瘤、恶性蝾螈瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴b细胞淋巴瘤、肥大细胞白血病、纵膈生殖细胞肿瘤、乳腺髓样癌、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、梅克尔细胞癌(merkelcellcancer)、间皮瘤、转移性尿路上皮癌、苗勒管混合瘤(mixedmulleriantumor)、黏液性肿瘤、多发性骨髓瘤、肌肉组织赘生物、蕈样肉芽肿病、黏液性脂肪肉瘤、黏液瘤、黏液肉瘤、鼻腔癌、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节性黑素瘤、眼部癌、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸细胞瘤、视神经鞘脑膜瘤、视神经瘤、口腔癌、骨肉瘤、卵巢癌、肺上沟瘤、乳头状甲状腺癌、副神经节瘤、松果体母细胞瘤、松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体肿瘤、浆细胞瘤、多胚瘤、前体t淋巴细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、胰腺癌、咽癌、腹膜假黏液瘤、肾细胞癌、肾髓质癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、richter转化(richter’stransformation)、直肠癌、肉瘤、神经鞘瘤病、精原细胞瘤、睾丸支持细胞瘤、性索-性腺间质肿瘤、印戒细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞肿瘤、小细胞癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、滑膜肉瘤、塞扎里病(sezary’sdisease)、小肠癌、鳞状细胞癌、胃癌、t细胞淋巴瘤、睾丸癌、卵泡膜细胞瘤、甲状腺癌、移行细胞癌、咽喉癌、脐尿管癌、泌尿生殖癌、尿路上皮癌、葡萄膜黑素瘤、子宫癌、疣状癌、视觉通路胶质瘤(visualpahwayglioma)、外阴癌、阴道癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom’smacroglobulinemia)、沃辛瘤(warthin’stumor)、肾母细胞瘤(wilmstumor)、血液学癌症(例如白血病)、上皮癌(包括肺癌、乳腺癌和结肠癌)、中线癌、间充质肿瘤、肝肿瘤、肾肿瘤和神经肿瘤。因此[0102]本发明化合物可用于治疗其的良性增殖性病症的一些实例包括但不限于良性软组织肿瘤、骨肿瘤、脑和脊柱肿瘤、眼睑和眼眶肿瘤、肉芽肿、脂肪瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤病、鼻息肉、垂体肿瘤、催乳素瘤、假性脑瘤、脂溢性角化病、胃息肉、甲状腺结节、胰腺囊性肿瘤、血管瘤、声带结节、息肉、和囊肿、卡斯尔曼病(castlemandisease)、慢性藏毛病、皮肤纤维瘤、柱状囊肿、化脓性肉芽肿和幼年性息肉综合征。[0103]本文还提供了根据本文任一方面的式iprotac化合物，其用于治疗感染性和非感染性炎性事件以及自身免疫性和其他炎性疾病、病症和综合征，以及通过向需要这样的治疗的哺乳动物特别是人施用有效量的根据本文任一方面的式iprotac化合物来治疗感染性和非感染性炎性事件以及自身免疫性和其他炎性疾病、病症和综合征的方法。本发明的化合物可用于治疗其的感染性和非感染性炎性事件以及自身免疫性和其他炎性疾病、病症和综合征的一些实例包括但不限于：炎性盆腔疾病(pelvicdisease，pid)、痛风、胸膜炎、湿疹、脾炎、喉炎、甲状腺炎、前列腺炎、咽炎、结节病、脂溢性皮炎、肠易激综合征(irritablebowelsyndrome，ibs)、憩室炎、尿道炎、皮肤晒伤、鼻窦炎、肺炎、脑炎、脑膜炎、心肌炎、肾炎、骨髓炎、肌炎、肝炎、胃炎、肠炎、皮炎、牙龈炎、阑尾炎、胰腺炎、胆囊炎(cholocystitus)、无丙种球蛋白血症、银屑病、变态反应、克罗恩病(crohn’sdisease)、肠易激综合征、溃疡性结肠炎、干燥病(sjogren′sdisease)、组织移植排斥、移植器官超急性排斥、哮喘、变应性鼻炎、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，copd)、自身免疫性多内分泌腺病(也称为自身免疫性多内分泌腺综合征)、自身免疫性脱发、恶性贫血、肾小球肾炎、皮肌炎、多发性硬化、一些肌病、硬皮病、血管炎、自身免疫性溶血和血小板减少状态、肺出血-肾炎综合征、动脉粥样硬化、艾迪生病(addison’sdisease)、帕金森病(parkinson’sdisease)、阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease)、i型糖尿病、脓毒症休克、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，sle)、类风湿性关节炎、银屑病关节炎、幼年型关节炎、骨关节炎、慢性特发性血小板减少性紫癜、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrommacroglobulinemia)、重症肌无力、桥本甲状腺炎(hashimoto’sthyroiditis)、特应性皮炎、退行性关节病、白癜风、自身免疫垂体机能减退、吉兰-巴雷综合征(guillain-barresyndrome)、白塞病(behcet’sdisease)、硬皮病(scleracierma)、蕈样肉芽肿、急性炎性反应(例如急性呼吸窘迫综合征和缺血/再灌注损伤)和格雷夫斯病(graves’disease)。[0104]在另一些实施方案中，本发明提供了根据本文任一方面的式iprotac化合物，其用于治疗全身炎症反应综合征，以及通过向需要这样的治疗的哺乳动物特别是人施用有效量的根据本文任一方面的式iprotac化合物来治疗全身炎症反应综合征的方法。可用本发明化合物治疗的全身炎症反应综合征的一些实例包括：lps诱导的内毒素休克和/或细菌诱导的脓毒症。[0105]可通过施用本文限定的结构i的protac化合物治疗的自身免疫病和自身免疫相关疾病包括：急性播散性脑脊髓炎(acutedisseminatedencephalomyelitis，adem)；急性坏死性出血性白质脑炎；艾迪生病；无丙种球蛋白血症；斑秃；淀粉样变；强直性脊柱炎；抗gbm/抗tbm肾炎；抗磷脂综合征(antiphospholipidsyndrome，aps)；自身免疫性血管性水肿；自身免疫性再生障碍性贫血；自身免疫性自主神经功能障碍；自身免疫性肝炎；自身免疫性高脂血症；自身免疫性免疫缺陷；自身免疫性内耳病(autoimmuneinnereardisease，aied)；自身免疫性心肌炎；自身免疫性卵巢炎；自身免疫性胰腺炎；自身免疫性视网膜病变；自身免疫性血小板减少性紫癜(autoimmunethrombocytopenicpurpura，atp)；自身免疫性甲状腺疾病；自身免疫性荨麻疹；轴突和神经元神经病；巴洛病(behcet’sdisease)；白塞病；大疱性类天疱疮；心肌病；卡斯尔曼病(castlemandisease)；乳糜泻；美洲锥虫病；慢性疲劳综合征；慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronicinflammatorydemyelinatingpolyneuropathy，cidp)；慢性复发性多灶性造骨髓炎(chronicrecurrentmultifocalostomyelitis，crmo)；许尔许斯特劳斯综合征(churg-strausssyndrome)；瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮；克罗恩病(crohn’sdisease)；cogan综合征(coganssyndrome)；冷凝集素病；先天性心脏传导阻滞；柯萨奇病毒性心肌炎(coxsackiemyocarditis)；crest病；原发性混合性冷球蛋白血症；脱髓鞘性神经病；疱疹样皮炎；肌痹；德维克病(devic’sdisease)(视神经脊髓炎)；盘状狼疮；心肌梗死后综合征(dressler’ssyndrome)；子宫内膜异位症；嗜酸性食管炎；嗜酸性筋膜炎；结节性红斑；实验性变态反应性脑脊髓炎；伊文思综合征(evanssyndrome)；纤维肌痛；纤维性肺泡炎；巨细胞动脉炎(颞动脉炎)；巨细胞心肌炎；肾小球肾炎；肺出血-肾炎综合征；肉芽肿性多血管炎(granulomatosiswithpolyangiitis，gpa)(以前称为韦氏肉芽肿病(wegener’sgranulomatosis))；格雷夫斯病(graves’disease)；吉兰-巴雷综合征；桥本脑炎；桥本甲状腺炎(hashimoto’sthyroiditis)；溶血性贫血；过敏性紫癜；妊娠疱疹；低丙种球蛋白血症；特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura，itp)；iga肾病；igg4相关硬化性疾病；免疫调节脂蛋白；包涵体肌炎；间质性膀胱炎；幼年关节炎；幼年糖尿病(1型糖尿病)；幼年肌炎；川崎综合征(kawasakisyndrome)；兰伯特-伊顿综合征(lambert-eatonsyndrome)；白细胞碎裂性血管炎；扁平苔藓；硬化性苔藓；木样结膜炎；线状iga病(linearigadisease，lad)；狼疮(sle)；莱姆病；美尼尔氏病；显微镜下多血管炎；混合性结缔组织病(mixedconnectivetissuedisease，mctd)；蚕蚀性角膜溃疡；mucha-habermann病；多发性硬化症；重症肌无力；肌炎；发作性睡病；视神经脊髓炎(德维克病)；中性粒细胞减少症；眼瘢痕性类天疱疮；视神经炎；复发性风湿病；pandas(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神疾病)；副肿瘤性小脑变性；阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria，pnh)；帕里-龙贝格综合征；parsonnage-turner综合征；睫状体扁平部炎(中间葡萄膜炎)；天疱疮；周围神经病；静脉周围脑脊髓炎；恶性贫；poems综合征；结节性多动脉炎；i、ii&iii型自身免疫性多内分泌腺综合征；风湿性多肌痛；多肌炎；心肌梗死后综合征；心包切开术后综合征；孕酮皮炎；原发性胆汁性肝硬变；原发性硬化性胆管炎；银屑病；银屑病关节炎；特发性肺纤维化；坏疽性脓皮病；纯红细胞再生障碍；雷诺氏现象(raynaudsphenomenon)；反应性关节炎；反射性交感神经营养不良；莱特尔综合征(reiter’ssyndrome)；复发性多软骨炎；下肢不宁综合征；腹膜后纤维化；风湿热；类风湿性关节炎；结节病；施密特综合征(schmidtsyndrome，)；巩膜炎；硬皮病；舍格伦综合征(sjogren’ssyndrome)；精子和睾丸自身免疫；僵人综合征；亚急性细菌性心内膜炎(subacutebacterialendocarditis，sbe)；susac综合征；交感性眼炎；大动脉炎；颞动脉炎/巨细胞动脉炎；血小板减少性紫癜(ttp)；托洛萨-亨特综合征(tolosa-huntsyndrome)；横贯性脊髓炎；1型糖尿病；溃疡性结肠炎；未分化结缔组织疾病(undifferentiatedconnectivetissuedisease，uctd)；葡萄膜炎；血管炎；水疱性皮肤病；白癜风；韦氏肉芽肿病(现在称为肉芽肿性多血管炎(gpa)。[0106]如本领域技术人员将容易理解的，在本文定义为炎性疾病或病症和自身免疫疾病或病症的那些病症和疾病之间存在一定程度的重叠，鉴于这样的病症的复杂性质和每个个体对象的表现，这是可预期的。[0107]本文还提供了根据本文任一方面的式iprotac化合物，其用于治疗病毒感染和疾病，以及通过向需要这样的治疗的哺乳动物特别是人施用有效量的根据本文任一方面的式iprotac化合物来治疗病毒感染和疾病的方法。本发明化合物可用于治疗的病毒感染和疾病的一些实例包括：基于附加体的dna病毒，包括但不限于人乳头瘤病毒、疱疹病毒、eb病毒(epstein-barrvirus)、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。[0108]本文还提供了根据本文任一方面的式iprotac化合物，其用于治疗病毒感染，以及通过向需要这样的治疗的哺乳动物特别是人施用有效量的根据本文任一方面的式iprotac化合物来治疗病毒感染的方法。本发明化合物可用于治疗的病毒感染的实例包括疱疹病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒、痘病毒和其他dna病毒。[0109]本文还提供了根据本文任一方面的式iprotac化合物，其用于治疗眼科适应证，以及通过向需要这样的治疗的哺乳动物特别是人施用有效量的根据本文任一方面的式iprotac化合物来治疗眼科适应证的方法。本发明化合物可用于治疗的眼科适应证的一些实例包括干眼。[0110]本发明的另一个方面提供了用于预防或治疗与bet蛋白活性失调相关的疾病或病症的方法，其包括向患有或可能暴露于所述疾病或病症的对象施用如本文所限定的结构iprotac化合物，其中所述疾病或病症独立地选自：癌症；良性增殖性病症；感染性或非感染性炎性事件；自身免疫病；炎性疾病；全身炎症反应综合征；病毒感染和疾病；以及眼科病症。本发明的一个相关方面提供了如本文所限定的式iprotac化合物在治疗或预防与bet蛋白活性失调相关的疾病或病症中的用途，其中所述疾病或病症独立地选自：癌症；良性增殖性病症；感染性或非感染性炎性事件；自身免疫病；炎性疾病；全身炎症反应综合征；病毒感染和疾病；以及眼科病症。另一个相关方面提供了如本文所限定的式iprotac化合物用于治疗或预防与bet蛋白活性失调相关的疾病或病症的用途，其中所述疾病或病症独立地选自：癌症；良性增殖性病症；感染性或非感染性炎性事件；自身免疫病；炎性疾病；全身炎症反应综合征；病毒感染和疾病；以及眼科病症。[0111]本文还提供了根据本文任一方面的式iprotac化合物，其用于治疗适应布罗莫结构域抑制剂的疾病或病症，以及通过向需要这样的治疗的哺乳动物特别是人施用有效量的根据本文任一方面的式iprotac化合物来治疗适应布罗莫结构域抑制剂的疾病或病症的方法。本发明化合物可用于治疗的适应布罗莫结构域抑制剂的疾病或病症的一些实例包括与全身炎症反应综合征相关的疾病，例如脓毒症、烧伤、胰腺炎、严重创伤、出血和缺血。[0112]在这样的用途或方法中，优选地在诊断点向需要这样的治疗的对象施用式iprotac化合物，以降低以下的发生率：sirs、休克发作、多器官功能障碍综合征(包括急性肺损伤发作)、ards、急性肾、肝、心脏和胃肠损伤以及死亡。[0113]或者，在存在感知到的高风险的脓毒症、出血、大量组织损伤、sirs或mods的另一些情况下，优选地向需要这样的保护免于这样的风险的对象施用式iprotac化合物，例如在与高风险的脓毒症、出血、大量组织损伤、sirs或mods相关的手术或其他操作之前。[0114]根据一个特定实施方案，本文提供了式iprotac化合物用于治疗脓毒症、脓毒症综合征、脓毒症休克和/或内毒素血症的用途。[0115]根据另一个实施方案，本文提供了式iprotac化合物用于治疗急性或慢性胰腺炎或烧伤的用途。[0116]适应布罗莫结构域抑制剂并且式iprotac化合物可用于其治疗的疾病或病症的另一些实例包括单纯疱疹感染和再活化、唇泡疹、带状疱疹感染和再活化、水痘、带状疱疹、人乳头瘤病毒、宫颈瘤形成、腺病毒感染(包括急性呼吸系统疾病)和痘病毒感染(例如牛痘和天花)以及非洲猪瘟病毒。[0117]根据另一个实施方案，本文提供了式iprotac化合物用于治疗治疗皮肤或宫颈上皮的人乳头瘤病毒感染的用途。[0118]在另一个方面中，本文提供了式iprotac化合物，其用于治疗上文所指示的任何疾病或病症，其中所述治疗在所治疗的疾病或病症中体内调节蛋白质甲基化、基因表达、细胞增殖、细胞分化和/或凋亡中的一种或更多种。[0119]根据另一个方面，提供了式iprotac化合物，其用于在独立地选自以下的疾病或病症的治疗中体内调节蛋白质甲基化、基因表达、细胞增殖、细胞分化和/或凋亡中的一种或更多种：癌症；炎性疾病；和/或病毒疾病。[0120]根据另一个方面，提供了在癌症、炎性疾病和/或病毒疾病的治疗中体内调节蛋白质甲基化、基因表达、细胞增殖、细胞分化和/或凋亡中的一种或更多种的治疗方法，其中所述方法通过向需要这样的治疗的对象施用治疗有效量的一种或更多种式iprotac化合物来提供。[0121]如本文还表明的，相比于brd3和brd4，式iprotac化合物，例如化合物sim1有效且快速地诱导brd2的可逆、持久且出乎意料的选择性去除。[0122]因此，本发明提供了式iprotac化合物，其与布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中的蛋白质结合。[0123]根据一个方面，本发明提供了式iprotac化合物，其中b和d是与待被泛素连接酶降解的靶蛋白或多肽结合的配体，并且其中所述靶蛋白选自结构蛋白、受体、酶、细胞表面蛋白、与细胞整合功能相关的蛋白，包括涉及以下的蛋白质：催化活性、芳香化酶活性、运动活性、解旋酶活性、代谢过程(合成代谢和分解代谢)、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成，具有以下的蛋白质：激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节剂活性、信号转导活性、结构分子活性、结合活性(蛋白质、脂质碳水化合物)、受体活性、细胞运动性、膜融合、细胞通信、生物过程的调节、发育、细胞分化、对刺激的响应、行为蛋白质(behavioralprotein)、细胞黏附蛋白质、涉及细胞死亡的蛋白质、涉及转运的蛋白质(包括蛋白质转运体活性、核转运、离子转运体活性、通道转运体活性、载体活性、通透酶活性、分泌活性、电子转运体活性、发病机制、分子伴侣调节物活性、核酸结合活性、转录调节物活性、胞外组织和生物发生活性以及翻译调节物活性。[0124]根据一个方面，本发明提供了如上文所限定的具有式iprotac化合物，其中b和d是与待被泛素连接酶降解的靶蛋白或多肽结合的配体，并且其中所述靶蛋白选自b7.1和b7、tifrlm、tnfr2、nadph氧化酶、bclibax和细胞凋亡途径中的其他配偶体、c5a受体、hmg-coa还原酶、pdev型磷酸二酯酶、pdeiv型磷酸二酯酶4、pdei、pdeii、pdeiii、角鲨烯环化酶抑制剂、cxcrl、cxcr2、一氧化氮(no)合酶、环加氧酶1、环加氧酶2、5ht受体、多巴胺受体、g蛋白(即gq)、组胺受体、5-脂氧合酶、类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶、胸苷酸合成酶、嘌呤核苷磷酸化酶、gapdh锥虫(trypanosomal)、糖原磷酸化酶、碳酸酐酶、趋化因子受体、jawstat、rxr及类似、hiv1蛋白酶、hiv1整合酶、流感、神经氨酸酶、乙型肝炎病毒逆转录酶、钠通道、多重耐药性(multidrugresistance，mdr)、蛋白p-糖蛋白(和mrp)、酪氨酸激酶、cd23、cd124、酪氨酸激酶p56lck、cd4、cd5、il-2受体、il-1受体、tnf-αr、icam1、cat+通道、vcam、vla-4整合素、选择素、cd40/cd40l、newokinin及受体、肌苷一磷酸脱氢酶、p38map激酶、raslraflmewerk途径、白介素-1转化酶、胱天蛋白酶、hcv、ns3蛋白酶、hcvns3rna解旋酶、甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶、鼻病毒、3c蛋白酶、单纯疱疹病毒-1(herpessimplexvirus-1，hsv-i)、蛋白酶、巨细胞病毒(cytomegalovirus、cmv)蛋白酶、聚(adp-核糖)聚合酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、血管内皮生长因子、催产素受体、微粒体转移蛋白抑制剂、胆汁酸转运抑制剂、5α还原酶抑制剂、血管紧张素11、甘氨酸受体、去甲肾上腺素重摄取受体、内皮素受体、神经肽y及受体、腺苷受体、腺苷激酶和amp脱氨酶、嘌呤能受体(p2y1、p2y2、p2y4、p2y6、p2x1至7)、法尼基转移酶、牻牛儿基牻牛儿基转移酶、ngf的trkaa受体、β淀粉样物质、酪氨酸激酶flk-iikdr、玻连蛋白受体、整合素受体、her-21neu、端粒酶抑制、细胞溶质磷脂酶a2和egf受体酪氨酸激酶、蜕皮激素20-单加氧酶、gaba门控氯离子通道的离子通道、乙酰胆碱酯酶、电压敏感钠通道蛋白、钙释放通道和氯离子通道；乙酰辅酶a羧化酶、腺苷酸琥珀酸合成酶、原卟啉原氧化酶和烯醇式丙酮酰莽草酸-磷酸合酶。[0125]根据本发明的一个方面，提供了具有式i的protac化合物，其中b和d是与待被泛素连接酶降解的靶蛋白或多肽结合的配体，并且其中b或d是hsp90抑制剂；激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、mdm2抑制剂、靶向包含人bet布罗莫结构域蛋白的化合物、hdac抑制剂、人赖氨酸甲基转移酶抑制剂、靶向raf受体的化合物、靶向fkbp的化合物、血管生成抑制剂、免疫抑制化合物、靶向芳基烃受体的化合物、靶向雄激素受体的化合物、靶向雌激素受体的化合物、靶向甲状腺激素受体的化合物、靶向hiv蛋白酶的化合物、靶向hiv整合酶的化合物、靶向hcv蛋白酶的化合物或靶向酰基蛋白硫酯酶1和/或2的化合物。[0126]根据一个方面，本发明提供了在有需要的患者中降解靶蛋白的方法，其包括向所述患者施用有效量的如本文所限定的式iprotac化合物，或通过施用有效量的所述protac在患者中将其用来降解靶蛋白的用途。[0127]根据一个方面，本发明提供了在细胞中靶向蛋白质的方法，其包括将所述细胞暴露于有效量的如本文限定的式iprotac化合物，或将所述protac用于在细胞中靶向蛋白质的用途，包括将所述细胞暴露于有效量的所述protac。[0128]本发明的protac化合物可作为药物组合物通过任何常规途径施用，特别是经肠内(例如经口，例如以片剂或胶囊剂的形式)施用，或肠胃外(例如以可注射溶液剂或混悬剂的形式)施用，经表面(例如以洗剂、凝胶剂、软膏剂或乳膏剂的形式)，或以经鼻或者栓剂的形式施用。包含以游离形式或可药用盐形式的本发明protac化合物以及至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可通过混合、制粒或包衣方法以常规方式制备。例如，经口组合物可以是片剂或明胶胶囊剂，其包含活性成分和a)稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂还包含c)黏合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果期望的话d)崩解剂，例如淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐，或泡腾混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。可注射组合物可以是等张水溶液剂或混悬剂，并且栓剂可由脂肪乳剂或混悬剂制备。组合物可以是经灭菌的和/或可包含助剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，组合物还可包含其他治疗上有价值的物质。用于经皮应用的合适制剂包括有效量的本发明的protac化合物和载体。载体可包含可吸收的药理学上可接受的溶剂以帮助通过宿主的皮肤。例如，经皮装置为绷带的形式，其包括背衬构件、包含化合物和任选地载体的贮存器；任选地速率控制屏障，以在延长的时间内以受控和预定的速率将化合物递送至宿主皮肤，以及将装置固定至皮肤的装置。也可使用基质经皮制剂。用于表面施加(例如，施加于皮肤和眼)的合适制剂优选地是本领域公知的水溶液剂、软膏剂、乳膏剂或凝胶剂。这样的制剂可包含增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。[0129]本发明的药物组合物包含与一种或更多种可药用载体一起配制的治疗有效量的本发明的protac化合物。本文中使用的术语“可药用载体”意指任何类型的制剂助剂或无毒、惰性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封物质。[0130]本发明的药物组合物可经口、经直肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内、表面(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、含服(buccally)、或作为经口或经鼻喷雾剂施用于人和其他动物。[0131]用于经口施用的液体剂型包括可药用乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除惰性稀释剂外，经口组合物还可包含助剂，例如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。[0132]可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性混悬剂，可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液剂、混悬剂或乳液剂，例如如在1，3-丁二醇中的溶液剂。可用的载剂和溶剂有水、林格溶液(ringer’ssolution)、u.s.p.和等张氯化钠溶液。另外，无菌不挥发油通常用作溶剂或助悬介质。出于该目的，可使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸例如油酸用于制备可注射剂。为了延长药物的作用，通常期望的是减慢来自皮下或肌内注射的药物的吸收。这可通过使用具有水溶性差的结晶或无定形物质的液体混悬剂来实现。于是药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率进而可取决于晶体尺寸和结晶形式。或者，通过将药物溶解或悬浮于油载剂中来实现肠胃外施用的药物形式的延迟吸收。[0133]用于直肠或阴道施用的组合物优选是栓剂，其可通过将本发明的protac化合物与合适的非刺激性的赋形剂或载体(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡)混合而制备，所述赋形剂或载体在环境温度下为固体，但在体温下为液体，并且因此在直肠或阴道腔中融化并释放出活性化合物。类似类型的固体组合物也可使用例如乳糖(lactose)或乳糖(milksugar)以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂用作软填充明胶胶囊剂和硬填充明胶胶囊剂中的填料。[0134]protac化合物也可以以微包封形式与一种或更多种上述赋形剂一起提供。片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可制备成具有包衣和壳，例如肠溶衣、控释包衣和药物配制领域公知的其他包衣。在这样的固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂(例如蔗糖、乳糖或淀粉)混合。如在常规实践中，这样的剂型还可包含除惰性稀释剂以外的另外物质，例如压片润滑剂和其他压片助剂，例如硬脂酸镁和微晶纤维素。就胶囊剂、片剂和丸剂而言，剂型还可包含缓冲剂。[0135]用于本发明化合物的表面或经皮施用的剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、散剂、溶液剂、喷雾剂、吸入剂或贴剂。将活性成分在无菌条件下与可药用载体和任何需要的防腐剂或缓冲剂(可根据需求)混合。眼用制剂、滴耳剂、眼软膏剂、散剂和溶液剂也被认为在本发明的范围内。除本发明的活性化合物外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶剂还可包含赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。[0136]除本发明的protac化合物外，散剂和喷雾剂还可包含赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂还可包含典型的抛射剂，例如氯氟烃。经皮贴剂具有提供化合物向身体的受控递送的另外的优点。这样的剂型可通过将化合物溶解或分散在合适的介质中来制备。吸收增强剂也可用于提高化合物穿过皮肤的通量。可通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。[0137]根据本发明的治疗方法，通过向对象施用治疗有效量的本发明的protac化合物在对象(例如人或其他动物)中治疗或预防疾病、病症或障碍，以实现所期望的结果必需的这样的量并持续这样的时间。本文中使用的术语“治疗有效量”的本发明的化合物意指足以在对象中减轻病症症状的化合物的量。如在医学领域中公知的，治疗有效量的本发明的protac化合物将为适用于任何医学治疗的合理的收益/风险比。[0138]本发明化合物的剂量可根据许多因素而变化，所述因素包括疾病类型、患者年龄和一般状况、施用的具体化合物以及用药物所经历的毒性或不良作用的存在或水平。合适剂量范围的一个代表性实例为低至约0.025mg至约1000mg。然而，施用的剂量通常由医师自行决定。[0139]可使用多种用于哺乳动物患者的药物剂型。如果固体剂量用于经口施用，则制剂可以以片剂、硬明胶胶囊剂、糖锭剂或锭剂的形式。固体载体的量将在大范围内变化，但通常protac化合物的量将为约0.025mg至约1g，其中固体载体的量弥补了所期望的片剂、硬明胶胶囊剂、糖锭剂或锭剂尺寸的差异。因此，片剂、硬明胶胶囊剂、糖锭剂或锭剂通常具有例如0.025mg、0.05mg、0.1mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、25mg、100mg、250mg、500mg或1000mg的本发明化合物。片剂、硬明胶胶囊剂、糖锭剂或锭剂方便地每日给予一次、两次或三次。[0140]一般而言，本发明的protac化合物将以治疗有效量通过本领域已知的任何通常和可接受的方式单独或与一种或更多种治疗剂组合施用。治疗有效量可根据疾病的严重程度、对象的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力和其他因素而广泛变化。[0141]在某些实施方案中，本发明的化合物的治疗量或剂量可为约0.1mg/kg至约500mg/kg，或者为约1至约50mg/kg。一般而言，根据本发明的治疗方案包括向需要这样的治疗的患者每天以单剂量或多剂量施用约10mg至约1000mg的本发明化合物。治疗量或剂量也将根据施用途径以及与其他药剂合用的可能性而有所不同。当对象的状况改善时，如有必要，可施用维持剂量的本发明化合物、组合物或组合。随后，作为症状的函数，可将施用的剂量或频率或者二者都降低至保持改善的状况的水平，此时症状已经减轻到所期望的水平，治疗应当停止。然而，一旦疾病症状复发，对象可需要基于长期的间歇性治疗。然而，应当理解，本发明的化合物和组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。用于任何特定患者的具体抑制剂量将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用具体化合物的活性；所用的具体组分；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别及膳食；所用具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所用具体化合物组合或同时使用的药物；以及医学领域中公知的类似因素。[0142]本发明还提供了药物组合，例如药盒，其包含a)为游离形式或可药用盐形式的第一药剂，其是如本文公开的本发明的protac化合物，和b)至少一种助剂。药盒可包含施用说明。本文中使用的术语“共施用”或“组合施用”等意指涵盖向单个患者施用所选择的治疗剂，并且旨在包括其中不一定通过相同施用途径或同时施用药剂的治疗方案。本文中使用的术语“药物组合”意指由混合或组合多于一种活性成分而产生的产物，并且包括活性成分的固定和非固定组合二者。术语“固定组合”意指活性成分(例如本发明的protac化合物和助剂)均以单一实体或剂量的形式同时向患者施用。术语“非固定组合”意指活性成分(例如本发明的protac化合物和助剂)均作为单独的实体同时、同步或顺序地向患者施用而没有特定时间限制，其中这样的施用提供了两种化合物在患者体内的治疗有效水平。后者也适用于联合治疗(cocktailtherapy)，例如施用三种或更多种活性成分。可用作可药用载体的物质的一些实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、羊毛脂、糖(例如乳糖、葡萄糖和蔗糖)；淀粉(例如玉米淀粉和马铃薯淀粉)；纤维素及其衍生物(例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素)；粉末状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂(例如可可脂和栓剂蜡)、油(例如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油)；乙二醇；例如丙二醇或聚乙二醇；酯例如油酸乙酯和十二酸乙酯、琼脂；缓冲剂(例如氢氧化镁和氢氧化铝)；海藻酸；无热原水、等张盐水；林格溶液；乙醇和磷酸盐缓冲液，以及其他无毒的相容润滑剂(例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)，以及根据配制者的判断，着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。[0143]附图简述[0144]图1a)和1b)示出了vhl：mz1：brd4bd2(a，pdb：5t35)和brd4bd2：mt1：brd4bd2(b，pdb5jwm)的三级复杂晶体结构，以确定在三价protac设计中用于接头化学支化的化合物的溶剂暴露区域。示出了母体双官能分子mz1和mt1的化学结构。[0145]图1c)示出了基于vhl和crbne3连接酶配体设计的三价protac的化学结构。[0146]图1d)示出了将hek293细胞用1μmprotac或dmso处理4小时之后brd2、brd3、brd4的免疫印迹分析。[0147]图1e)示出了一式四份用1μm化合物或dmso处理之后crisprhibit-brd4hek293细胞的定量活细胞降解动力学。在24小时时间段内，以5分钟间隔连续监测发光(rlu)。[0148]图1f)是示出了在每个浓度点重复三次用protac或dmso处理48小时之后mv4；11aml细胞系的细胞生存力的图。[0149]图2a)示出了用连续稀释的protac化合物sim1、sim2和sim3处理4小时的hek293细胞中brd2、brd3、brd4水平的免疫印迹。bet蛋白水平的量化是相对于dmso对照和用于测量dc50值的图进行的，如图6d中所示。示出的印迹代表两个独立的实验。[0150]图2b)示出了在一式四份用连续稀释的sim1处理之后crisprhibit-brd2、brd3和brd4hek293细胞的定量活细胞降解动力学。在24小时时间段内连续监测发光(rlu)。[0151]图2c)示出了根据图b中所示的brd2、brd3和brd4动力学曲线计算的降解速率、降解最大值(dmax)和dmax50值。[0152]图2d)示出了sim1(蓝色)和顺式-sim1(红色)对用10nm的化合物处理4小时的mv4；11细胞的蛋白质组的作用。数据绘制了针对来自3个独立实验的每种蛋白p值的-log10，相对于dmso对照的倍数变化的log2。代表性蛋白的量化可参见图7d。[0153]图2e)示出了用10nm的化合物sim1处理之后，hibit-bet蛋白的nanobret泛素化动力学。[0154]图3a)示出了根据sim1(动力学曲线在图2b中示出)、arv-771(动力学曲线在图8a中示出)和mz131的hibit-brd2动力学剂量响应曲线计算的降解速率、dmax和dmax50值的比较。[0155]图3b)示出了显示用化合物处理4小时的22rv1前列腺癌细胞系中内源性brd2和myc的量化表达水平的图。曲线是来自两个生物学独立实验的平均值的最佳拟合±s.e.m。[0156]图3c)示出了显示一式四份用1nm浓度的指定化合物处理的mv4；11细胞中crisprcmyc-hibit蛋白水平和相关细胞生存力下降的图。在24小时内的不同时间点，通过celltiter-glo测量发光和细胞生存力。[0157]图3d)示出了在添加或不添加胱天蛋白酶抑制剂(qvd-oph，20μm)或坏死性凋亡抑制剂(necrostatin-1，20m)的情况下用10nm的指定化合物在22rv1细胞中进行24小时的parp-裂解的免疫印迹。48小时处理以及1mmmz1和mt1处理的印迹在图10中示出。[0158]图3e)示出了在22rv1细胞中用化合物或dmso处理24小时的胱天蛋白酶-glo3/7测定。曲线是三个生物学独立实验平均值的最佳拟合±s.e.m。[0159]图3f)示出了克隆形成测定中对22rv1细胞存活进行的实验的图像。将细胞用10nm化合物处理24小时。在扫描之前，将500个细胞重新平板接种并将其在37℃下培养20天。通过将经处理细胞的平板接种效率除以未经处理细胞的平板接种效率来确定存活分数。误差棒表示来自重复项的平均值±s.d.。[0160]图4a)示出了sim1(红色)、mz1或顺式-sim1(橙色)、mt1(绿色)或dmso(青色)与来自brd4的bd1-bd2串联结构域孵育之后的复合物形成的尺寸排阻色谱结果(左图：野生型，中图：n140f突变体，右图：在有vcb蛋白的情况下的野生型)。峰强度为280nm下的吸光度。[0161]图4b)示出了nanobret构象生物传感器测定，该测定由brd4野生型(wild-type，wt)的bd1-bd2串联结构域组成，或包含侧翼是nanoluc供体和halotag接受体融合标签的bd2n433f突变。将hek293细胞用wt或n433f突变体生物传感器瞬时转染，并一式四份用化合物sim1、顺式-sim1或mt1化合物的连续稀释液进行处理。测量了nanobret以确定哪些处理显示出构象变化，计算并示出了ec50值。[0162]图4c)示出了brd4bd1-bd2串联蛋白(装载在注射器中，wt为200μm，n至f突变体为300μm)itc滴定到预孵育到样品细胞中的sim1(16μm)和vcb(32μm)的1∶1混合物。[0163]图4d)示出了显示在瞬时表达与全长brd4wt、n140f或n433f突变体配对的halotag-vhl的hek293细胞中nanobret动力学三元复合物形成的图，所述细胞一式四份用sim1、顺式-sim1、mt1或dmso对照处理。添加化合物之后，连续监测nanobret2小时，并且显示出每种brd4变体的三元复合物形成的不同水平。[0164]图4e)示出了在不存在(红色)或存在(蓝色)vcb蛋白的情况下，一式两份的sim1针对生物素-jq1：brd4bd2的alphalisa滴定。[0165]图4f)示出了来自荧光偏振竞争测定的拟合曲线，该测定测量了在存在或不存在brd4串联bd1-bd2的情况下来自一式三份滴定的sim1的vcb的fam标记的hif-1α肽位移。[0166]图4g)示出了spr传感图，以实时监测预孵育的sim1-brd4-串联蛋白与固定化的生物素-vcb蛋白的相互作用。作为三个独立实验的代表，所示传感图用于三元单循环动力学(single-cyclekinetic，sck)实验，以测量三元复合物的解离常数kd和解离半衰期t1/2。[0167]图4h)示出了用brd4进行的活细胞化合物停留时间实验，如通过nanobret靶标接合测量的。一式四份将crisprhibit-brd4细胞与指定化合物孵育，然后添加竞争性荧光标记的bet抑制剂。在活细胞中对nanobret进行了动力学测量。[0168]图5a)示出了sim1与vhl和bet蛋白形成1∶1∶1三元复合物的建议机制。sim1与brd4的bd2优先初始结合，然后发生构象变化以及同时与bd1分子内结合。亲合力和协同性有助于在极低浓度的sim1下形成具有增强的停留时间的高度稳定的三元复合物。[0169]图5b)示出了不同类型的protac和分子胶诱导的具有e3连接酶组分的三元复合物，并以其作为protac或降解浓度的因素的不同程度描述。结合了亲合力与协同性的三价复合物显示出最高和最持久的三元复合物形成水平，并具有最小的钩状效应。其次是协同的二价protac复合物，然后是非协同的二价复合物。最后，示出了由分子胶化合物诱导的三元复合物，其达到平台期，并且与protac不同，在较高浓度下不经历竞争性钩状效应。[0170]图6(与图1相关)[0171]图6a)示出了对三级复杂晶体结构brd4bd1：bi-bet：brd4bd1(pdb：5ad3)的检查，显示出二价抑制剂埋入蛋白质界面内，表明衍生化会损害结合模式。[0172]图6b)示出了在一式四份用连续稀释的sim1至sim3处理之后稳定表达lgbit的crisprhibit-brd4hek293细胞的定量活细胞降解动力学。在24小时的时间段内，以5至15分钟间隔连续监测发光(rlu)，并通过相对于dmso对照进行归一化来确定部分rlu(fractionalrlu)。[0173]图6c)示出了在每个浓度点一式三份用protac或dmso处理48小时之后a549肺癌细胞系或hl-60aml细胞系的细胞生存力。[0174]图6d)示出了相对于来自图2a的hek293细胞的ib数据的dmso对照的每种bet蛋白水平的定量。[0175]图7(与图2相关)[0176]图7a)、图7b)示出了在一式四份用连续稀释的sim2或sim3处理之后稳定表达lgbit的crisprhibit-brd2、brd3和brd4hek293细胞的定量活细胞降解动力学。在24小时的时间段内，以5至15分钟间隔连续监测发光(rlu)，并通过相对于dmso对照归一化来确定部分rlu。[0177]图7c)示出了从图7a或2b中分别示出的sim2和sim3动力学曲线计算的sim2(上侧组)和sim3(下侧组)的降解速率、降解最大值(dmax)和dmax50值。[0178]图7d)示出了图2d中质谱蛋白质组学的代表性蛋白质的量化。[0179]图7e)示出了在一式四份100nmsim1或mz1或dmso处理之后表达lgbit和halotag-泛素的hibit-bethek293细胞的nanobret泛素化动力学。值以相对于dmso对照的倍数提高表示。[0180]图8(与图3相关)[0181]图8a)示出了一式四份用连续稀释的arv-771处理之后的crisprhibit-brd2、brd3和brd4hek293细胞的定量活细胞降解动力学。在24小时的时间段内，以5至15分钟间隔连续监测发光(rlu)，并通过相对于dmso对照归一化来确定部分rlu。[0182]图8b)来自sim1(图2b)、arv-771(图8a)和先前测定的mz1(richinget.al.acschem.biol.2018)的动力学曲线的brd3和brd4降解速率、降解最大值(dmax)和dmax50值的比较。[0183]图8c)(上侧图)示出了用化合物处理4小时的22rv1前列腺癌细胞系中内源性brd3和brd4的量化表达水平。曲线是来自两个生物学独立实验的平均值的最佳拟合±s.e.m.。(下侧图)图3b和上侧图的western印迹的代表性图像。[0184]图8d)示出了在存在brd降解剂或抑制剂(有/没有蛋白酶体抑制剂(mg132)或vhl配体(vh298))的情况下处理4小时的mv4；11细胞中内源性brd2、brd3和brd4的免疫印迹。误差棒表示来自两个生物学独立实验的平均值±s.d。使用100nm的sim1和顺式-sim1。使用3μm的mg132，使用10μm的vh298。[0185]图9(与图3c相关)[0186]图9a)和b)示出了显示在一式四份用3nm、10nm、50nm和100nm浓度的指定化合物处理的mv4；11中crisprcmyc-hibit蛋白水平(a)和相关细胞生存力(b)下降的图。在24小时内的不同时间点，通过celltiter-glo测量发光和细胞生存力，并相对于dmso对照归一化。[0187]图10(与图3d、e相关)[0188]图10a)示出了在添加/不添加胱天蛋白酶抑制剂(qvd-oph，20μm)或坏死性凋亡抑制剂(necrostatin-1，20μm)的情况下在指定时间点，用10nm的sim1或顺式-sim1的22rv1细胞中parp-裂解的免疫印迹。[0189]图10b)示出了在添加/不添加胱天蛋白酶抑制剂(qvd-oph，20μm)或坏死性凋亡抑制剂(necrostatin-1，20μm)的情况下在指定时间点，用10nm或1μm的mt1的22rv1细胞中parp-裂解的免疫印迹。[0190]图10c)示出了在添加/不添加胱天蛋白酶抑制剂(qvd-oph，20μm)或坏死性凋亡抑制剂(necrostatin-1，20μm)的情况下在指定时间点，在用10nm或1μμm的mz1的22rv1细胞中parp-裂解的免疫印迹。[0191]图10d)示出了在存在bet降解剂或抑制剂(有/没有胱天蛋白酶抑制剂(qvd-oph)或vhl配体(vh298))的情况下处理24小时的22rv1细胞中胱天蛋白酶-glo3/7测定。误差棒表示来自三个生物学独立实验的平均值±s.d。使用100nm的sim1、顺式-sim1和mt1。使用1μm的mz1和arv-771，使用10mm的vh298。使用20μm的qvd-oph。[0192]图11(与图4相关)[0193]图11a)示出了sim1(红色，25μm)、mz1(橙色，25μm)、mt1(绿色，25μm)或dmso(青色，25μm)与25μmbrd4bd1-bd2串联蛋白孵育之后复合物形成的尺寸排阻色谱(左图：n433f突变体，右图：n140f突变体与vcb蛋白)。峰强度为280nm处吸光度。[0194]图11b)示出了一式四份以透化和活细胞形式进行的用稳定表达lgbit的crisprhibit-brd4hek293细胞进行的nanobret靶标接合测定。将细胞用荧光bet示踪剂处理，然后与不同浓度下的指定化合物孵育，以测量竞争性位移。示出了透化和活细胞二者的每种化合物的ic50值。[0195]图11c)示出了一式四份的100nmsim1或mz1或dmso处理之后表达lgbit和halotag-vhl的hibit-bethek293细胞的nanobret三元复合物动力学。值以相对于dmso对照的倍数提高表示。[0196]图12示出了表1，该表示出了sim1二元和三元复合物与固定化vcb结合的实验和拟合spr数据。[0197]图13示出了sim1及其设计的阴性对照(r，s)-sim1和顺式-sim1的化学结构。反向立体中心用星号表示。[0198]图14示出了通过来自brd4(1，2)的sim1和(r，s)-sim1进行的布罗莫扫描位移滴定。相对于相应的化合物浓度以log10标度(nm，x轴)绘制了通过qpcr测量的布罗莫结构域蛋白的量(信号；y轴)。将来自曲线拟合的解离常数kd制成表格。误差值由graphpadprism程序生成，并且反映了非线性最小二乘曲线与实验数据之间的拟合质量。[0199]图15示出了用1μm的指定化合物或dmso处理4小时之后hek293细胞中bet蛋白降解的免疫印迹。[0200]图16示出了在重复板中将crisprhibit-brd2、brd3和brd4hek293细胞用100nm的dmso、mz1、(r，s)-sim1以及10nm和100nm两种浓度的sim1处理以用于洗脱实验。如图中所示，在3.5小时时去除包含10nm和/或100nm化合物的培养基，并在实验的剩余时间内替换为缺乏化合物的培养基。在50小时的时间段内连续监测发光(rlu)，并相对于dmso对照进行归一化作为部分rlu来制图。[0201]图17示出了显示用指定浓度下的测试化合物处理24小时之后早期(fitc：apotrackergreen)和晚期(fitc：apotrackergreen和dapi)凋亡和健康mv4；11细胞的百分比的条形图，如分别通过apotrackergreen和dapi染色分析生存力和磷脂酰丝氨酸的表面存在，并进行流式细胞术分析。数据绘制为堆叠条形图，因此不显示单个点。误差棒反映了三次生物学重复的平均值±s.d.。[0202]图18示出了向雄性c57bl/6小鼠(n＝3)单次静脉内(iv)或皮下(sc)施用(5mg/kg)之后sim1的平均血浆浓度-时间谱。该图示出了sim1在体内表现出优异的可用性和药代动力学暴露。更多详情在相关表2中示出。[0203]图19示出了表2，其呈现了针对静脉内(i.v.)和皮下(s.c)施用sim1的计算的药代动力学参数(这项工作)，以及施用mz1(https：//opnme.com/molecules/bet-mz-1)和jq1的计算的药代动力学参数(filippakopoulosetal.nature468，1067-1073(2010))。[0204]图20示出了表3，总结了brd2、brd4_长和brd4_短的dc50值，以量化sim1及其类似物mn674降解brd2和brd4同种型的效力。dc50值以nm为单位并从图22中产生的剂量依赖性曲线中获得。[0205]图21示出了免疫印迹，显示出在rcc4-ha-vhl中使用异三价(heterotrivalent)protacsim1和mn674时brd2和brd4的剂量依赖性蛋白降解。[0206]图22示出了显示图21中所示的mn674和sim1对brd2(图22a)和brd4(图22b)的剂量依赖性蛋白降解的免疫印迹带强度的图，免疫印迹带强度转换为相对于仅0.1％dmso对照合理化的百分比带强度，并相对于降解剂protac浓度(单位为nm)制图。具体实施方式[0207]三价protac的结构指导的设计和合成[0208]已从母体单价bet抑制剂开发了数种bet家族protac，包括mz1(公开于ep3268363)9，11，37，38。本发明人先前已经合成了由与pan-betbd抑制剂(+)-jq1缀合的vhl配体vh032(参考文献39)构成的有效betprotac化合物mz1，9与在具有vhl和brd4的第二布罗莫结构域(bd)brd4bd2的三元复合物中结合的mz1的晶体结构21显示出mz1的peg3接头的中心部分是溶剂暴露的，这表明peg3接头是与第二bet配体连接的潜在分支点(图1a)。类似地，对与brd4bd2的两个单体结合的二价bet抑制剂mt1(具有peg7接头的(+)-jq1的同二聚体)40的共晶体结构的检查揭示了接头中心区域内的一个位点，该位点用于向(toward)e3连接酶配体的潜在的化学分支(图1b)。相比之下，二价抑制剂bi-bet在其共晶体结构中在两个布罗莫结构域的界面处完全埋入，表明衍生化可削弱其结合模式(图6a)41。[0209]本发明人在其设计策略中选择mz1和mt1作为祖双官能分子。然后，本发明人设计了合适的“核心支架”，其能够通过可变接头组装三个配体以产生三官能的protac(图1c)。本发明人选择了1，1，1-三(羟基甲基)乙烷，也称为三羟甲基乙烷(trimethylolethane，tme)，因为其特征在于在新戊基核心结构中的三个伯醇基团，因此作为peg单元的支化、紧密生物电子等排取代物。在一些实施方案中，每个bet配体部分的化学接头保持相同，导致tme中心季碳的非手性。为了允许在探索不同单体配体之间的相对约束时的灵活性同时保持整体化学结构尽可能接近于mz1和mt1的那些，我们设计了三种支化protac(sim1至sim3)，其在bet配体的每个接头处具有peg3或peg4(n＝3、4)，并具有向vh032的peg0或peg1(m＝0、1)(图1c)。本发明人还设计了由代替vh032(sim4至sim6)的crbn靶向配体泊马度胺(pomalidomide)构成的类似化合物(图1c)。[0210]为了合成一般结构12的基于vhl的三价protac，本发明人从由tme合成的缩丙酮1开始，其作为三价接头核心的关键前体(方案1)。由1的烯丙基化和随后的脱保护得到了二醇2，其用甲磺酸接头3烷基化以得到烯丙基醚4，作为与e3连接酶配体的具有m＝0的protac的前体。为了引入另外的peg1单元(m＝1)，在存在氢化钠的情况下使醇1与碘化物5反应。将6的缩丙酮基团脱保护，并随后用接头3将显示出的伯醇烷基化，产生了二叠氮化物7。将7的对甲氧基苄基(pmb)基团用2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(ddq)脱保护，并随后烯丙基化，得到烯丙基醚8。烯丙基醚4或8中双键的氧化裂解和随后所得醛9的pinnick氧化得到羧酸10，其与vh032-胺偶联27，37。将11中的两个叠氮化物基团还原为胺，并进一步与(+)-jq1羧酸进行酰胺偶联，完成了基于vhl的三价protac的制备。基于crbn的三价protac类似地通过偶联代替vh032-胺的泊马度胺29的含胺类似物来得到。[0211]尽管顺式-sim1的合成与其反式非对映体一样简单，但通过在最终偶联步骤时使用半当量的bet配体来合成(r，s)-sim1化合物(参见图13)的最初尝试未能以可接受的产率产生所期望的1∶1偶联。因此，本发明人修改了合成路线以允许随后的独立的首先与(+)-jq1(filippakopoulosetal.nature468，1067-1073(2010))然后是(-)-jq1(filipakopoulosetal，nature468，1067-1073(2010))的偶联步骤(参见化学-材料和方法)。[0212]sim1是有效的基于vhl的三价protac，其优先进行brd2降解[0213]为了评价三价化合物诱导bet蛋白胞内降解的能力，本发明人首先以1μm浓度处理人hek293细胞持续4小时，并通过western印迹评估brd2、brd3和brd4的水平。观察到用基于vhl的sim1至sim3时bet蛋白中的显著降解，而观察到用基于crbn的sim4至sim6时最小至无降解(图1d)。为了确认基于vhl的化合物与基于crbn的protac相比具有更高的活性，本发明人接下来在24小时内使用活细胞连续发光监测hek293细胞中crispr/cas9内源性标记的hibit-brd429，31。观察到与sim4至sim6相比，用sim1至sim3时更快的brd4降解初始速率伴随更高的最大降解水平(图1e)。用从4nm至1μm的sim1至3对hibit-brd4进行的剂量响应动力学分析显示迅速且完全的降解而未观察到针对任何化合物的钩状效应(图6b)。为了确认基于vhl的化合物的更大效力，本发明人评价了用化合物处理的bet敏感癌细胞系mv4；11(图1f)、a549和hl-60(图6c)的生长抑制曲线。与sim4至sim6相比，以及与母体双官能分子mz1和mt1相比，化合物sim1至sim3一致地显示出更强的活性(图1f和图6c)。总之，初步的筛选支持结构导向设计的vhl降解剂比其同源crbn分子的活性更高。[0214]受到这些初步结果的鼓舞，本发明人接下来寻求更深入地表征基于vhl的降解剂对整个bet蛋白家族的降解活性。使用免疫印迹在4小时处理下的浓度依赖性谱证明，在所有bet蛋白中化合物sim1至sim3的dc50值(0.7至9.5nm)与mz1(dc50值为25至920nm)的相比低得多，其中sim1成为三种降解剂中最有效的(图2a和图6d)。本发明人还观察到，与mz1的显著的优先brd4降解相比，用所有化合物对brd2的降解优先于brd3和brd4(图6d)9，21，25。用bet家族成员brd2、3和4的crisprhibit细胞系以及化合物sim1至sim3滴定(最高10nm浓度)，进行了化合物sim1至sim3的定量活细胞降解动力学测定(图2b和图7a、b)。这些分析进一步使化合物sim1有资格作为在所有bet家族成员中最有效的降解剂(dmax5060至400pm)(图2b、c和图7a至c)，并且brd2显示出所有化合物中最快的降解速率和最低的dmax50值(图2c和图7c)。[0215]还测试了(r，s)-sim1的降解活性，并发现其行为类似于mz1，且降解所有bet家族成员的效力低于sim1(参见图15，其示出了在用1μm指定化合物或dmso处理4小时之后hek293细胞中bet蛋白降解的免疫印迹)。[0216]为了评估与mz1或(r，s)-sim1相比三价protac是否还诱导了细胞中更持续的bet蛋白降解，进行了降解洗脱实验。将crisprhibit-bethek293细胞用当量浓度(100nm)的siml、(r，s)-sim1和mz1化合物处理3.5小时，然后去除培养基并替换为缺乏化合物的培养基。本发明人还测试了低10×浓度(10nm)的sim1以解释其对bet蛋白的较高降解效力。从最初添加化合物以及洗涤之后紧接着连续监测hibit-bet蛋白水平，总时间为50小时。在100nm处理下，在时间进程内洗脱之后，sim1对所有bet家族成员的降解保持在恒定的低水平，而在10nmsim1处理下，观察到洗脱之后brd2、brd3和brd4部分恢复(图16)。在将用100nm(r，s)-sim1或100nmmz1处理的细胞洗脱之后，所有bet家族成员的恢复比用sim1时观察到的恢复更大且发生更快(图16)。[0217]为了评估化合物sim1对bet蛋白的细胞选择性，进行了多重串联质谱标签(tandemmasstag，tmt)标记的质谱蛋白质组学实验来以定量和无偏的方式监测蛋白质水平。为了在这些实验中提供合适的非降解阴性对照异构体，本发明人合成了在vhl配体的羟基脯氨酸中心具有反向立体化学的化合物顺式-sim1，导致丧失与vhl的结合(参见化学-材料和方法)9，10。[0218]一式三份将急性髓系白血病(acutemyeloidleukaemia，aml)mv4；11细胞用dmso、10nm的化合物sim1或10nm的化合物顺式-sim1处理4小时。在定量的5，232个蛋白质中，发现与化合物顺式-sim1相比，化合物sim1对brd2降解最显著，其次是brd3和brd4(图2d和图7d)。[0219]本发明人还观察到myc的蛋白水平轻微下降和hmox1(血红素加氧酶1)的蛋白水平轻微下降，前者是bet诱导降解的已知下游效应，后者表明凋亡的早期启动42。[0220]由于已发现增强的降解速率和/或水平与增强的泛素化相关，因此使用生物发光共振能量转移(nanobret)测定进行了细胞研究以监测bet家族成员的泛素化动力学，所述测定由表达荧光标记的halo标签-泛素的hibit-betcrispr细胞系组成31。如图2e中所示，在用10nm的化合物sim1处理之后，与brd3和brd4相比brd2的细胞泛素化动力学提高更稳健。[0221]在化合物sim1的浓度为100nm时观察到了这些相同的趋势。与mz1的比较表明了化合物sim1所导致的所有bet家族成员的泛素化水平更高，其中针对brd2观察到最大差异(图7e)。总之，这些细胞降解数据突出了化合物sim1是所研究的三价protac中最有效的bet降解剂，并且优先降解brd2。[0222]化合物sim1在功能上比二价betprotac和母体双官能抑制剂更有效[0223]为了确定与其他基于vhl的二价protac相比化合物sim1的靶标结合价的提高是否提高了降解和效力，首先确定了二价betprotacarv-771针对每个bet家族成员的动力学降解曲线37(图8a)。根据这些和之前发表的mz1分析31来计算，并对brd2(图3a)以及brd3和brd4(图8b)绘制了与化合物sim1相比的降解速率和dmax50值。这些定量比较表明化合物siml的降解速率以及dmax50值都有很大提高，降解效力提高的值的范围为：针对brd2为80至300倍(图3a)、针对brd3为2至35倍且针对brd4为10至20倍(图8b)。[0224]为了理解三价protac相对于二价betprotac对降解的提高是否可转变为增强的官能结局，本发明人接下来转向研究化合物sim1在bet敏感细胞系(前列腺癌细胞系22rv1)中的响应。在4小时的早期时间点将22rv1细胞用不同浓度的化合物处理确认了与相关的双官能bet降解剂mz1和arv-771以及非降解对照mt1和顺式-sim1相比化合物sim1的bet降解效力和cmyc水平抑制活性增强(图3b和图8c)。[0225]用vhl抑制剂vh29839和蛋白酶体抑制剂mg132共处理确认了化合物sim1诱导的降解对功能性vhle3连接酶和蛋白酶体活性的预期的机制依赖性(图8d)。[0226]bet抑制剂和降解剂导致许多靶标(包括cmyc)下调，其在用10nm的化合物sim1处理4小时之后在mv4；11的bet相关aml系中无偏蛋白质组学谱中显示下降(图2d)。为了定量该癌细胞系中cmyc的时间依赖性下降，用hibit对cmyc进行内源性标记，并在不同时间时在具有不同浓度的化合物sim1、顺式-sim1和mt1的情况下监测细胞裂解物中的蛋白质水平(图3c，左和图9a)。在1nmsim1浓度下观察到cmyc快速和完全丧失(图3c，左)，而在50至100nm处理之前，用母体mt1或顺式-sim1未实现类似水平的cmyc下降(图9a)。进行了相关的细胞生存力测定以理解每种化合物如何影响细胞死亡，并且这些结果表明，仅用1nm的sim1(而不是顺式-sim1或mt1)处理导致了6小时之后的可测量的细胞死亡(图3c，右)。在更高的化合物浓度下观察到了类似的趋势，其中发现在6小时之后任何浓度下的sim1比对照化合物的细胞毒性显著更强(图9b)。[0227]接下来，本发明人评估了sim1对22rv1癌细胞的生存力的功能作用。用10nmsim1处理24小时之后，观察到大量细胞死亡，如parp裂解测定所示(图3d和图10a)。相比之下，即使在与siml相同的浓度下处理多至48小时，mt1或mz1也未引起可观察到的parp裂解(图10b至c)。仅用1μm浓度的mt1和mz1观察到类似水平的parp裂解(图10b至c)。细胞死于凋亡(如用泛胱天蛋白酶抑制剂qvd-oph共处理时防止parp裂解所示)而不是坏死性凋亡(如用necrostatin-1共处理所示)(图3d和图10a)。[0228]对化合物处理之间的早期和晚期凋亡诱导进行了比较，并且值得注意的是，与所测试的所有二价对应物相比，即使与高10倍浓度的(r，s)-sim1、mz1或mt1相比，1nm的sim1诱导了高得多程度的早期和晚期凋亡二者(参见图17，示出了用在指定浓度的测试化合物处理24小时之后早期(fitc：apotrackergreen)和晚期(fitc：apotrackergreen和dapi)凋亡以及健康mv4；11细胞的百分比，如通过分别针对生存力和磷脂酰丝氨酸的表面存在的apotrackergreen和dapi染色，以及流式细胞术分析所分析的。数据绘制为堆叠条形图，因此不显示单个点。误差棒反映了三次生物学重复的平均值±s.d.)。总之，生物学数据支持与(r，s)-sim1和母体二价降解剂或抑制剂相比，三价降解剂sim1降解更有效且下游功能活性更大。[0229]胱天蛋白酶-glo测定确认与双官能降解剂mz1和arv-771(ec50分别为150和90nm)相比，化合物sim1(ec502nm)的活性显著更强，并且最大信号比非降解剂顺式-sim1和mt1大得多(图3e)。化合物sim1、mz1和arv-771的胱天蛋白酶-glo活性通过用vh298和q-vd-oph共处理而阻断，而仅q-vd-oph(而不是vh298共处理)阻断了顺式-sim1和mt1的活性，与它们不同的作用模式一致(图10d)。[0230]化合物sim1的优异活性在集落形成测定中得到证明，其中将22rv1细胞用10nm浓度的测试化合物处理24小时，并且将经处理的细胞重新平板接种，并随后使其生长20天。在该测定中，与载剂对照相比，仅用化合物sim1处理产生了显著的细胞毒性(图3f)。总之，生物学数据支持与基准母体二价降解剂或抑制剂相比，三价降解剂化合物sim1降解更有效且下游功能活性更大。[0231]最后，本发明人评价了在小鼠中静脉内和皮下施用之后sim1的药代动力学(pharmacokinetic，pk)(参见图18)。sim1表现出高度有利的生物利用度和稳定性，包括高auc、低清除率和长半衰期，与更典型的小分子组分(即单价jq136和二价mz1)的那些相比呈正相关(positively)(数据可在opnme.com上获得)(图18和表2)。由于sim1的大小大(分子量1，619da)，这样的有利的pk谱是显著的，并使sim1有资格作为适用于体内使用的化学探针。[0232]化合物sim1与bd1和bd2分子内接合并与vhl和brd4形成1∶1∶1三元复合物[0233]化合物sim1的显著细胞活性和效力促使本发明人探询三价protac复合物对作为代表性bet蛋白的brd4和vhl的分子识别和化学计量。先前的工作已确定二价bet抑制剂在分子内并同时与bet蛋白内的bd1和bd2布罗莫结构域接合40，41。[0234]因此，本发明人假设三价betprotacsim1也可表现顺式分子内接合以支持其作用机制。为了解决该问题，本发明人首先采用了在重组蛋白的情况下的生物物理结合测定。本发明人使用来自brd4的串联bd1-bd2构建体进行了尺寸排阻色谱(size-exclusionchromatography，sec)27实验，其为野生型(wt)因此能够进行顺式分子内结合，或在配体结合袋中保守的天冬酰胺残基处bd1或bd2中包含点突变(brd4bd1中的n140f，或brd4bd2中的n433f)以消除与两个布罗莫结构域之一的结合，从而使突变体串联不能以顺式二价方式接合41。[0235]与游离或mz1结合的brd4相比，化合物sim1能够将brd4野生型bd1-bd2串联构建体的sec谱转移至更高的洗脱体积，这与用化合物sim1形成更紧密的分子内1∶1复合物一致(如用mt1时所观察到的)(图4a)。相比之下，当使用n140f或n433f突变体串联时，我们观察到用化合物sim1和mt1二者时都显著转移至低得多的洗脱体积，与参照游离或与mz1结合的brd4相比，与溶液中较高分子量二聚体物质的形成一致，与溶液中较高分子量2∶1物质的形成一致(图4a和图11a)。[0236]已确定化合物sim1使用其二价bet配体部分以顺式分子内方式与bd1和bd2接合，本发明人接下来探寻化合物sim1是否可通过利用来自vhl配体部分的剩余结合价在bd1-bd2串联结构域和e3连接酶vhl之间形成预期的1∶1∶1复合物。实际上，包含1∶1∶1当量的化合物sim1、bd1-bd2和vhl-elonginb-elonginc复合物(vcb)的样品作为单一物质运行，并且与从包含相同当量比率的顺式-sim1、bd1-bd2串联和vcb的样品(仅可形成1∶1顺式-sim1∶bd1-bd2复合物和未结合的vcb)中观察到的两个峰中的任一个相比，洗脱体积更低(图4a)。[0237]先前用二价bet抑制剂进行的生物物理和细胞研究表明，bd1和bd2的分子内结合导致brd4的结构构象发生变化41。为了确定化合物sim1与brd4的细胞结合是否也可诱导结构变化，本发明人利用包含野生型brd4或突变体n433f的相同bd1-bd2串联结构域的nanobret生物传感器，其侧翼分别是nanoluc供体和halotag接受体(图4b)。用bd1-bd2串联wt传感器，所有化合物都显示出brd4构象的变化，表现为nanobret信号增加，达到并维持在平台期，正如对分子内接合所预期的那样(图4b)。鉴于顺式-sim1和sim1的类似模式，与vhl接合的能力没有显示出对brd4结构变化的显著影响(图4b)。作为对照，bd1-bd2n433f突变体传感器未显示出响应，表明bd1和bd2的同时结合是构象变化所需要的(图4b)。有趣的是，顺式-sim1和sim1都显示出与mt1相比更高的针对brd4接合的ec50值(图4b)。[0238]为了确定这是否是鉴于brd4分子量提高所致的渗透性降低和/或brd4结合亲和力降低所导致的，进行了nanobret靶标接合测定，所述测定测量了与hibit-brd4结合的荧光bet示踪分子的位移41。在其中渗透性不是因素的透化细胞中，本发明人观察到sim1、顺式-sim1和mt1以几乎相同的结合亲和力和ic50值与内源hibit-brd4结合(图11b)。然而，在活细胞中，与mt1相比，sim1和顺式sim1二者均显示出对brd4的结合亲和力降低，并且在构象传感器测定中观察到相同的10×位移，表明这反映了三价分子相对于母体二价抑制剂的渗透性降低(图11b)。[0239]虽然细胞通透性如此降低，但化合物sim1是高度有效的降解剂，并且这些生物化学和细胞研究揭示了其三元复合物形成模式，其中化合物sim1同时与给定的bet蛋白内的bd1和bd2接合，并募集vhl以形成1∶1∶1复合物。[0240]将(r，s)-sim1用作单齿bet结合剂对照以探寻二齿bet结合剂sim1可表现出何种程度的亲合力，即由于分子内bd1和bd2结合导致针对bet蛋白的增强的结合亲和力。使用已建立的基于噬菌体的布罗莫结构域位移测定以定量测量化合物与串联布罗莫结构域构建体的结合。二齿sim1对串联布罗莫结构域构建体brd2(1，2)、brd3(1，2)、brd4(1，2)和全长brd4表现出皮摩尔亲和力，并且与单齿(r，s)-sim1相比亲和力提高50至90×，证明了其亲合力(参见图14)。[0241]设计并合成了化合物mn674作为sim1的另一种类似物。mn674的结构与sim1的结构相同，但在连接jq1结合剂的接头中包含的peg单元少了一个。在连接jq1结合剂的接头中少一个peg单元。在剂量响应降解测定中在哺乳动物细胞系rcc4-ha-vhl中测试了mn674。该测定涉及免疫印迹(原始western印迹数据参见图21且剂量-响应曲线参见图22)，示出了用8次5倍连续稀释(500nm至6.4pm)的每种化合物的6小时处理。对brd2和brd4的蛋白水平进行量化以测量dc50值，表3中列出了这些值(图20)。图21示出了免疫印迹结果，表明在rcc4-ha-vhl中使用异三价protacsim1和mn674时，brd2和brd4的蛋白降解呈剂量依赖性。将rcc4-ha-vhl细胞暴露于八次5倍连续稀释(500nm至6.4pm)的异三价bet-bet-vhlprotacsim1和mn674以处理6小时，然后收获裂解物并进行免疫印迹分析(图21)。将bio-radmp成像系统用于对brd2(irdye800cw)、brd4长(irdye800cw)、brd4短(irdye800cw)和管家基因微管蛋白(罗丹明)进行荧光检测。使用imagelab软件测定带强度，并将所有bet蛋白强度相对于微管蛋白归一化以将它们转换为与仅0.1％dmso对照相比合理化的带强度百分比。然后在graphpadprism中绘制这些强度以用于剂量-响应[抑制]可变斜率(四个参数)分析，以生成brd2(图22a)和brd4(图22b)的曲线，从而确定表3中所示的dc50值(图20)。实验代表n＝2，即生物学重复。[0242]总体而言，mn674显示出与sim1相当的降解效力，虽然根据不同细胞系的结局略有不同。[0243]化合物sim1形成具有增强的细胞停留时间的协同稳定三元复合物[0244]为了验证三元复合物化学计量并进一步表征其形成和解离的结合热力学和动力学，本发明人接下来通过进行反向滴定使用了等温滴定量热法(isothermaltitrationcalorimetry，itc)21，32。首先，在将brd4n140f或n433f串联滴定到预形成的sim1∶vcb复合物中时，分别观察到化学计量为2∶1、摩尔结合焓为δh＝-9.1和-11.6kcal/mol以及kd＝0.12和1.2μm。相比之下，在相同条件下进行的brd4wtbd1-bd2滴定显示出结合化学计量为1∶1、大的负结合焓(δh＝-20kcal/mol)以及低得多的解离常数(kd＜20nm)(图4c)。总之，itc数据确认了在sec中观察到的化学计量，并指出vcb∶sim1对brd4-bd2的优先接合可能是分子内1∶1接合之前的第一步骤。[0245]为了研究在细胞的全长brd4的情况下在具有vhl的三元复合物中接合bd1和bd2二者的有利性，本发明人使用动力学nanobret三元复合物测定31探询了与全长brd4wt、n140f或n433f突变结合的vhl。表达与halotag-vhl的多个nanoluc-brd4融合的hek293细胞显示，在存在sim1而不是对照顺式-sim1或mt1的情况下，快速形成了具有vhl和wtbrd4的三元复合物(图4d)。然而，在brd4n140f突变的情况下显著降低了三元复合物形成，并且在n433f突变的情况下几乎消除了三元复合物形成(图4d)。这些结果确认了化合物sim1利用bd1和bd2二者以用于三元复合物形成，并表明与bd2结合优先于与bd1结合，这与itc结果以及之前在mz1的情况下发现的一致21，32。[0246]还用一组内源性标记的hibitbet家族成员评估了相比于mz1用化合物sim1的细胞nanobret三元复合物形成，并且与mz1相比观察到由化合物sim1诱导的具有vhl的brd2和brd4的更稳健和持续的三元复合物，而这在brd3的情况下没有显示出一样的延长或稳定(图11c)，同样这与之前在mz1的情况下发现的类似31，32。[0247]本发明人接下来检查了三元复合物的协同性，表明化合物sim1对于三元复合物的形成表现出正协同性α值为3.5，如竞争性alphalisa测定中所示(图4e)，其通过来自brd4bd2的生物素化的jq1位移(参考文献43)测量了单独的化合物sim1(ic50＝205nm)或sim1∶vcb二元复合物(ic50＝58nm)的结合。作为交叉验证，本发明人评价了竞争性fp测定中的协同性，所述测定其通过荧光hif-1α肽探针的位移测量了protac分子vhl末端处的结合15，32。同样，在该实验中，与单独的sim1(kd＝186nm)相比，化合物sim1表现出正协同性(α＝5.2)，这是由于其作为二元sim1∶bd1-bd2串联(kd＝33nm)的竞争性位移的增强的亲和力(图4f)。[0248]最后，本发明人在如前所述的spr结合测定32中评估了化合物sim1的三元复合物的形成。本发明人在单循环动力学形式实验中，将生物素化的vcb固定在表面芯片上并注射以过量bd1-bd2蛋白预孵育的化合物sim1的连续稀释溶液(图4g)32。sim1∶bd1-bd2与vcb以1∶1的化学计量结合，如以下所证明的：预期1∶1结合模型的实验％rmax值(64.7±2.3％)与单独的sim1滴定观察到的值(77％)相当且不超过该值(图12-表1)。化合物sim1与野生型bd1-bd2和vcb形成了高亲和力、稳定和长期存在的1∶1∶1复合物(t1/2＝119±21s；kd＝53±4nm)(图4g和图12-表1)。[0249]化合物sim1的正协同性以及先前的研究表明，二价抑制剂与其单价对应物相比表现出更长的靶标停留时间作为提高的效力的机制，促使我们探索化合物sim1的顺式结合模式是否也有助于活细胞中的靶标或三元复合物内的停留时间的任何变化。[0250]为了监测停留时间，首先将hibit-brd4crispr细胞用饱和浓度的protac或抑制剂化合物孵育，然后用竞争性bet荧光示踪剂孵育。从这种位移产生的nanobret信号可在活细胞中进行动力学监测，其速率和强度与初始化合物结合的复合物的停留时间直接相关41。与之前的研究一致，jq1的停留时间短41，而mt1显示出更长的停留时间，正如对二价抑制剂所预期的(图4h)。有趣的是，mz1显示出介于在单价和二价bet抑制剂之间的停留时间，表明即使在单价bet靶标接合的情况下，用protac也可能提高停留时间(图4h)，本发明人将这归因于其协同结合21。引人注目的是，在化合物顺式-sim1和sim1之间观察到差异，其中sim1显示出brd4上的最长停留时间，而顺式-sim1显示出与mt1相同的位移动力学(图4h)。[0251]顺式-sim1、(r，s)-sim1和sim1之间的不同行为(所有均表现出来自二价靶标接合的亲合力)表明，由于在细胞内形成高度稳定和协同的三元复合物，由sim1募集vhl显著提高了在brd4上的停留时间。总之，来自这些体外细胞研究和生物物理结合测定的结果表明，化合物sim1与vhl蛋白和bet蛋白形成协同、稳定和长效的1∶1∶1三元复合物。此外，本发明人的发现表明，这通过分子内结合得到促进，所述分子内结合导致结构变化以及与靶标的延长的化合物相互作用二者，这通过在三元复合物中接合vhl的能力甚至被进一步增强。[0252]结果的讨论[0253]本发明人已表明本发明的新三价protacsim1至sim6并且特别是sim1是非常有效和显著活性的bet蛋白降解剂。本发明人对化合物sim1的生物学和机制研究为增加protac降解剂的价(作为通过积极影响三元复合物来增强其作用模式的可行策略)提供了概念证明。为了理解化合物sim1的作用机制，进行了一系列生物物理、生物化学和细胞研究。最关键的是，这些显示出1∶1∶1的brd4∶sim1∶vhl复合化学计量，并且sim1以顺式方式分子内与brd4的bd1和bd2二者结合，诱导了构象变化(图5a)。对brd4bd1或bd2突变体的进一步研究表明，存在sim1顺序或优先bd结合到brd4中，其中bd2是更关键的第一步(图5a)，这与母体protacmz1的bd2特异性一致21，32。基于此处提供的大量数据和所有bet家族成员的降解模式，本发明人因此提出所有bet家族都以该相同的方式与化合物sim1接合。[0254]有趣的是，在一系列正交测定中发现brd2表现出家族成员中最高水平的降解和相应的最稳健水平的泛素化，这是对来自这类betprotac降解剂brd2的前所未有的偏好。尚不清楚为什么会有这种偏好，但这可反映brd2与vhl的更强亲合力和三元复合物稳定性，或者可反映与brd3或brd4相比，诱导的结构变化更好地将brd2以更有利于用于更有效泛素化的状态定位的可能性。[0255]为了通过protac发生成功降解，诱导的靶蛋白和e3连接酶之间的三元复合物不仅必须形成，而且复合物内的靶标也必须定位良好，以用于有效泛素化。为了实现这种结构上的有利性，在protac的开发中测试了许多接头，以发现在有效用于e2/e3催化的新底物泛素化的位置和几何结构中最佳地募集靶标的化合物21，34，44。对成功可以说是至关重要的另一个因素是三元复合物形成的动力学和热力学有利性，这甚至可能能够克服非最佳的结构定位。在这些情况下，protac促进e3连接酶和靶标之间的正的新相互作用，类似于单价分子胶的机制，产生稳定、协同和长期存在的三元复合物，从而驱动催化性泛素化21，31，32，45。对于不具有后者三元复合物有利性的化合物，它们的降解效力窗口将受到钩状效应的限制，因为二元复合物将比三元复合物具有更高的形成优先(图5b)17，46。另一方面，与化合物与靶标或e3连接酶的非有效的二元相互作用相比，由于复合物平衡现在向三元复合物移动，因此确实促进协同三元复合物的protac具有更广泛的降解活性窗口(图5b)。下游泛素化和降解结局将是三元复合物依赖性的，并且因此可潜在地通过合理的化学设计进行优化15。[0256]本文公开的三价protac的研究提供了证据，以支持由于过程中亲合力的提高而导致的结构、能量和动力学三元复合物有利性参数的优化(图5b)。只有当vhl可接合以形成三元复合物时，这在化合物sim1与brd4结合的细胞停留时间延长的情况下可最显著观察到。在三价protac情况下所有参数均有所改善，导致降解窗口大幅扩大，即从非常低浓度下的bet家族快速减少率到高于dmax50的10，000倍的更高浓度下观察到不具有钩状效应的最大降解速率。先前已在二价bet家族protac的情况下观察到其中一些特性，例如在mz1情况下的协同复合物9以及在dbet-638和arv-77137情况下的强降解，但尚未显示出将这些特性组合起来以在三元复合物中实现最大亲合力从而驱动显著降解。[0257]从异双官能降解剂至三价降解剂的转变不是用于改善降解结局的明显方法，特别是鉴于化学合成挑战和降解剂分子量提高会伴有细胞通透性降低或化合物完全不可渗透的假定。令人惊讶的是，本文公开和表征的式i化合物表明情况并非如此。虽然实际上三价化合物sim1和顺式sim1与它们的母体二价抑制剂相比具有降低的渗透性，但是它们仍然容易是细胞可渗透的。[0258]另外，从二价betprotac至三价betprotac的转变产生了数种非常强且有效的化合物，提高了所有bet家族成员的降解以及在相关细胞疾病测定(用于评估bet化合物用于治疗用途的潜力)中的表现。虽然三价降解剂的化学设计和合成比二价protac的复杂得多，但投入更多努力显示出显著益处，并概述了一种新的接头设计策略，用于产生支化的三官能支架，靶标和e3结合剂二者均可与该支架缀合。在克服这些已感知挑战的过程中，三价protac揭示了靶结合价的提高提供了改进的降解剂。[0259]生物学方法[0260]细胞系和培养。将hek293、22rv1和mv4；11细胞(atcc)在37℃下和5％co2下在加湿气氛中分别在dmem和rpmi(invitrogen)中培养，并补充有10％v/v胎牛血清(foetalbovineserum，fbs)(southamericanorigin，lifescienceproduction)。将稳定表达lgbit的crisprhibit-brd2、hibit-brd3和hibit-brd4hek293细胞在具有10％v/vfbs的dmem中培养，并且将crisprcmyc-hibitmv4；11细胞在具有10％v/vfbs的rpmi中培养。所有细胞在90％汇合时每周分裂1至2次，并在传代30次之后不再使用。使用mycoalert检测试剂盒(lonza)对细胞进行支原体污染常规检查。[0261]降解测定。在处理之前12至24小时将mv4；11细胞以1×106个细胞/ml接种在10cm皿。在处理之前12至24小时将22rv1和hek293细胞以2.5×105至6×105个细胞/孔接种在6孔板。按指示在有和没有抑制剂的情况下将细胞用测试化合物或等同体积的dmso处理，并在规定的时间点裂解。对于裂解，将细胞在冰冷的pbs(invitrogen)中洗涤两次，然后在包含50mmtris盐酸盐ph7.4、150mm氯化钠、1mmedtaph7.4、1％v/vtritonx-100、1×halttm蛋白酶抑制剂混合物(thermofisher)的冰冷裂解缓冲液中将mv4；11细胞以250μl/板或22rv1和hek293细胞以80μl/孔进行裂解。将裂解物进行声处理，通过在4℃下以15800xg离心10分钟来澄清，并将上清液储存在-80℃下。通过bca测定(pierce)来测定蛋白质浓度，并通过分光光度法(nanodropnd1000)来测量562nm下的吸光度。将样品使用nupagenovex4％至12％bis-tris凝胶(invitrogen)以40μg总蛋白/孔在sds-page上运行，通过湿转移转移至0.2μm孔硝酸纤维素膜(amersham)，并用0.1％tbst中的3％w/vbsa(sigma)封闭。将印迹在以下中在旋转的情况下在4℃下孵育过夜：抗brd2(1∶2000，abcam#ab139690)、抗brd3(1∶500，abcam#ab50818)、抗brd4(1∶1000，abcam#ab128874)、抗c-myc(1∶1000，abcam#32072)、抗parp(1∶1000，cst#9542s)、抗裂解的parp(1∶1000，bdpharmingen#51-9000017)、抗-胱天蛋白酶-3(1∶1000，cst#9662s)、抗-微管蛋白(1∶3，000，bio-rad#12004165)或抗-β-肌动蛋白(1∶2500，cts#4970s)抗体。然后将印迹在山羊抗小鼠或驴抗兔irdye800cw二抗(1∶10，000，licor#925-32210和#926-32213)中在旋转的情况下在室温下孵育1小时。将带使用chemidocmp成像系统(biorad)进行检测，并在每个时间点通过相对于β-肌动蛋白和dmso对照归一化来量化(imagestudiolite，版本5.2)。除非另有说明，否则数据为两次生物重复的平均值。使用prism(graphpad，版本7.03)中的单相指数衰减模型通过非线性回归绘制并拟合降解数据。[0262]细胞生存力测定。将mv4；11细胞与所期望浓度的化合物在透明底部384孔板上孵育48小时。将mv4；11细胞保存在补充有10％fbs、l-谷氨酰胺的rpmi培养基中。初始细胞密度为3×105/ml。对于每个浓度点，将细胞用不同浓度的化合物或0.05％dmso一式三份进行处理。处理之后，使用promegacelltiter-glo-glo发光细胞生存力测定试剂盒根据制造商说明来测量细胞生存力。将信号记录在具有推荐设置的bmglabtechpherastar发光板读取器上。用graphpadprism软件分析数据以获得每种测试化合物的ec50值。[0263]动力学降解和定量。使用crispr/cas9来编辑稳定表达lgbit(promega)的hek293细胞(atcc)以内源性hibit标记brd2、brd3或brd4的n端基因组基因座31。对于动力学降解测定，将细胞在100μl的生长培养基中以2×104个细胞/孔的密度平板接种在白色96孔组织培养板中，并在37℃、5％co2下孵育过夜。第二天，将培养基替换为包含1∶100稀释的endurazine(promega)的co2非依赖性培养基(gibco)，并在37℃下在5％co2中孵育2.5小时，然后添加3倍连续稀释的1μm(在brd4情况下的sim1、sim2和sim3)或10nm(在brd2、3和4情况下的sim1)最终浓度的化合物。将板与盖一起放入设定为37℃的glomaxdiscover微板读取器(promega)中，并在化合物处理之后的24小时时间段内每5至15分钟进行具有读取的连续发光测量。[0264]降解动力学的定量。从上述确定的动力学降解曲线计算出降解速率和降解平台期31。简言之，将每条动力学浓度曲线的初始降解部分拟合至以下等式：[0265][0266]其中为单位的降解速率。降解分数dmax计算为1-平台期。对于每条曲线，降解开始之前的数据点被排除在拟合之外。然后相对于浓度绘制dmax以确定dmax50值。[0267]质谱蛋白质组学。样品制备。在处理之前24小时，将rpmi(invitrogen)中的mv4；11细胞以5×106个细胞接种在100mm板上。通过添加测试化合物将细胞一式三份处理。在4小时之后，将细胞以250g离心5分钟，并用12ml的冷pbs洗涤两次。将细胞在补充有蛋白酶抑制剂混合物(roche)的500μl的100mmtrisph8.0、4％(w/v)sds中进行裂解。将裂解物短暂脉冲声处理并随后在4℃下以15，000g离心10分钟。将样品使用微bca蛋白质测定试剂盒(thermofisherscientific)进行量化，并处理200μg的每份样品，并将其使用过滤器辅助样品制备方法进行消化，然后用碘乙酰胺进行烷基化，并使用胰蛋白酶进行消化，如前所述21。然后将样品使用7mm、3mlc18spe筒柱(cartridgecolumn)(empore，3m)进行脱盐，并用tmt10plex等压标签试剂组(thermofisherscientific)按照制造商说明进行标记。标记之后，将来自9份样品的肽以相等比例合并在一起。将合并的样品在ultimate3000hplc系统(thermoscientific/dionex)上在xbridge肽beh柱(3.5μm，2.1×150mm，waters)上使用高ph反相色谱来分级。缓冲液a(水中的10mm甲酸铵，ph9)和b(90％乙腈中的10mm甲酸铵，ph9)以线性梯度为5％至60％缓冲液b在60分钟中以200μl/分钟的流量使用。然后，收集80个级分，然后基于每一级分的紫外信号串联(concatenation)成20个级分。将所有级分在genevacez-2浓缩器中干燥，并重悬于1％甲酸中以用于质谱分析。[0268]lc-ms/ms分析。在与ultimate3000rslcnano超高效hplc系统(thermoscientific)和easyspray柱(75μm×50cm，pepmaprslcc18柱，2μtm，thermoscientific)偶联的qexactivehf混合四极杆-轨道阱质谱仪(thermoscientific)上顺序地分析了级分。缓冲液a(水中的0.1％甲酸)和b(80％乙腈中的0.08％甲酸)以线性梯度为5％至35％缓冲液b在125分钟中以300nl分钟-1使用。柱温度为50℃。质谱仪以数据依赖的模式运行，并在335至1600m/z范围内进行单次质谱调查扫描，然后进行15次顺序的m/z依赖的ms2扫描。15个最强的先驱离子通过更高能量的碰撞解离而顺序地破碎。ms1分离窗口设置为0.7m/z，并且分辨率设置为120，000。ms2分辨率设置为60，000。ms1和ms2的自动增益控制(automaticgaincontrol，agc)靶标分别设置为3×106个离子和1×105个离子。归一化碰撞能量设置在32％。ms1和ms2的最大离子注射时间分别设置为50和200毫秒。[0269]肽和蛋白质鉴定。合并所有20种级分的原始质谱数据文件，并通过maxquant软件v.1.6.0.16针对uniprot-sprot-human-canonical数据库进行搜索，以用于蛋白质鉴定和tmt报道离子定量。maxquant参数设置如下：酶使用胰蛋白酶/p；最大错误切割数等于2；先驱质量公差等于10ppm；片段质量公差等于20ppm；可变修饰：氧化(m)，乙酰基(n端)，脱酰胺(nq)，gln→pyro-glu(qn端)；固定修饰：脲基甲基(c)。通过应用1％的错误发现率来过滤数据，然后排除具有少于两种独特肽的蛋白质。如果三次dmso重复之间的绝对倍数变化差异≥1.5，则过滤量化的蛋白质。[0270]监测mv4；11细胞中的cmyc下降和细胞生存力。将crisprcmyc-hibitmv4；11细胞(promega)以密度为5×104个细胞/孔平板接种在固体、白色96孔组织培养板上(corningcostar#3917)。孵育过夜后，将其用1至100nm浓度的指定化合物并在绘制的时间点进行处理，使用发光测量用nanoglohibit裂解试剂(promega)测定cmyc水平。制备了所有化合物处理的重复板，并在与蛋白质水平测量相同的时间点，使用cell-titerglo(promega)测量细胞生存力。将板在定轨振荡器上振荡10至20分钟，然后在glomaxdiscover微板读取器(promega)上读取发光。[0271]胱天蛋白酶-3/7测定。在有和没有抑制剂的情况下用测试化合物或等同体积的dmso处理24小时之前12至24小时，将22rv1细胞以10，000个细胞/孔接种在白色96孔板(corning#3917)中。添加100μl/孔的胱天蛋白酶-3/7试剂(promega)，并以500rpm振荡板30秒。将板孵育2小时，并使用pherastarfs板读取器(bmglabtech)测量发光。[0272]克隆形成测定。将22rv1细胞用10nmsim1、顺式-sim1、mt1、mz1和arv711处理24小时。次日，将细胞胰蛋白酶化并计数。将500个细胞重新平板接种，并将其在37℃和5％co2下培养20天。在孵育20天之后，将细胞用冰冷的100％(v/v)甲醇在4℃下固定30分钟。然后，除去甲醇，并将细胞用(meoh中的)500μl0.1％结晶紫染料在室温下染色30分钟。孵育之后，将细胞用dh2o洗涤并使其干燥过夜。在epsonperfectionv800照片扫描仪上扫描板。在imagej软件中进行图像分析。通过计数每种处理条件下的集落并将平均值除以平板接种的细胞数来计算平板接种效率(platingefficiency，pe)。通过将经处理细胞的pe除以未经处理细胞的pe乘以100来测定存活分数。条形图使用graphpadprism软件产生。误差棒表示平均值±s.d。进行了两个独立实验。[0273]构建体、蛋白质表达和纯化。野生型和突变体形式的人蛋白brd2(p25440)、brd3(q15059)和brd4(o60885)vhl(uniprot登记号：p40337)、elonginc(q15369)、elonginb(q15370)用于所有蛋白质表达。[0274]pet-his-sumotevbrd4串联是通过使用连接酶非依赖性克隆将包含两个布罗莫结构域的截短的brd4(第1至463位残基)克隆到母体pethis6sumotevlic克隆载体(1s)中而产生的。pethis6sumotevlic克隆载体(1s)是从scottgradia(addgene质粒#29659)获得的惠赠。按照标准操作用诱变引物在pet-his-sumobrd4串联上进行quikchange诱变，以产生位于乙酰基-赖氨酸结合口袋中的保守的天冬酰胺被替换为苯丙氨酸的突变体，即brd4n140f和brd4n433f。[0275]对于brd4串联构建体的表达，使用0.4mm异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)使n端his6标记的brd4(1至463位)或类似突变体在大肠杆菌(escherichiacoli)bl21(de3)中在18℃下表达16小时。将大肠杆菌(e.coli)细胞用压力细胞匀浆器(stanstedfluidpower)裂解，并将裂解物通过离心澄清。将his6标记的vcb在histraphp亲和柱(gehealthcare)上通过用咪唑梯度洗脱进行纯化。使用tev蛋白酶去除his6标签并将未经标记的复合物透析到低浓度咪唑缓冲液中。然后使brd4第二次流动通过histraphp柱，使杂质结合，因为洗脱的复合物没有结合。然后分别使用monos和superdex-200柱(gehealthcare)通过阴离子交换和尺寸排阻色谱另外地纯化brd4。将最终纯化的复合物储存在20mmhepes、ph7.5、100mm氯化钠和1mmtcep中。[0276]如前所述表达和纯化vcb复合物。简言之，将n端his6标记的vhl(54至213)、elonginc(17至112)和elonginb(1至104)共表达，并通过镍亲和色谱分离复合物，使用tev蛋白酶去除his6标签，并通过阴离子交换和尺寸排阻色谱进一步纯化复合物。[0277]如前所述表达和纯化bet蛋白bd21。简言之，表达了n端his6标记的brd2-bd1(71至194)、brd2-bd2(344至455)、brd3-bd1(24至146)、brd3-bd2(306至416)、brd4-bd1(44至178)和brd4-bd2(333至460)，并将这些通过镍亲和色谱和尺寸排阻色谱分离。[0278]尺寸排阻色谱(sec)。sec实验在室温下在纯系统(gehealthcare)中进行。在包含20mmhepes(ph7.5)、100mmnacl和1mmtcep的缓冲液中使用superdex200increase10/300gl柱(gehealthcare)(用已知分子量的球状蛋白质(gehealthcare，28-4038-41/42)校准)通过凝胶过滤来分析溶液中brd4bd1bd2串联蛋白的寡聚状态。注射之前，将brd4串联(25μm)与sim1(25μm)、mz1(25μm)、mt1(25μm)或dmso(0.5％)在室温下孵育30分钟。每次注射的样品体积为200μl，并且流量为0.8ml/分钟。使用在280nm下的紫外线吸光度监测峰洗脱。[0279]itc。滴定在itc200微量热计(malvern)上进行。滴定由以下组成：以120秒时间间隔以0.5μl/秒的速率19次注射在以下中的2μl串联brd4bd1-bd2构建体(wt或n140f或n433f)溶液：20mmbis-tris丙烷、100mmnacl、1mmtcep、1.6％dmso(ph7.5)。进行了蛋白质(0.4μl)的初始注射，并在数据分析期间丢弃。所有实验均在25℃下，同时以750r.p.m搅拌进行。将来自10mmdmso储备溶液的sim1和vcb在包含20mmbis-tris丙烷、100mmnacl、1mmtcep的缓冲液(ph7.5)中稀释。最终dmso浓度为1.6％v/v。将brd4蛋白(200μm，在注射器中)滴定到sim1-vcb复合物(sim116μm，vcb32μm，在细胞中)中。使用制造商提供的microcalllcitc200origin软件将数据拟合至每种brd4突变体的单结合位点模型或brd4wt的双结合位点模型以获得化学计量(n)、解离常数(kd)和结合焓(δh)。[0280]alphalisa测定。将配体针对4nmhis标记的brd4bd2和10nm生物素化的jq1进行滴定。所有试剂均在50mmhepes、100mmnacl、0.1％bsa、0.02％chaps(ph7.5)(最终浓度)中稀释。在vcb预混合的条件下，缓冲液中还包含12.5mmvcb。用11点3倍连续稀释液检测配体，从100μm开始(没有vcb)，或从10mm开始(有20mmvcb)，并且使最终dmso浓度为1％。使用抗his6抗体缀合的alphalisa接受体珠和链霉亲和素包被的供体珠(perkinelmer)(每个珠的最终浓度为10μg/ml)检测结合。滴定在白色384孔alpha板(perkinelmer)中制备，并在配备有alphalisa激发/发射模块的pherastarfs板读取器(bmg)上读取。使用graphpadprism7分析数据并产生剂量-响应曲线。每个测定孔的最终体积为25μl。首先将10μl的2.5×配体或具有vcb的2.5×配体与5μl的5×布罗莫结构域和生物素化的jq1的混合物混合，并在室温下孵育1小时。然后将测定板移至暗室，并添加5μl的5×接受体珠并孵育1小时。然后(仍在黑暗中)添加5μl的5×供体珠，在读取之前将板孵育1小时。[0281]荧光偏振测定。fp竞争性结合测定如前所述运行32，最终体积为15μl，每个孔溶液均包含15nmvcb蛋白、10nmfam标记的hif-1α肽(fam-dealahypyipmdddfqlrsf，“jc9”)以及降低浓度的protac(从50μm开始的14点2倍连续稀释)或protac∶brd4串联蛋白(从10μmprotac∶40μm单个布罗莫结构域或10μmprotac∶20μm串联布罗莫结构域开始的14点2倍连续稀释)。在384孔板(corning3575)上一式三份地制备测定物，并使用荧光激发和发射波长(λ)分别为485和520nm的pherastarfs(bmglabtech)进行所有测量。使用100mmbis-tris丙烷、100mmnacl、1mmtcep的储备溶液(ph7.5)溶解组分，并适当添加dmso以确保最终浓度为1％。包含没有化合物(零位移)的jc9和vcb或jc9(不存在蛋白质(最大位移)的情况下)的对照孔也包括在内以允许归一化。针对log[protac]绘制了归一化(％)位移值并使用prism(v.8.0.1，graphpad)通过非线性回归拟合曲线以测定每次滴定的ic50值。如前所述，从jc9的kd(约2nm，由直接结合测定)反算ki值并拟合ic50值。协同性(α)值是从二元ki值和三元ki值之比计算的，这两个值分别是由单独的sim1或sim1+brd4的jc9位移确定的。[0282]spr结合研究。如前所述，在biacoret200仪器(gehealthcare)上进行spr实验32。生物素化vcb的固定化在25℃下在预偶联的seriesssa芯片上在包含20mmtris、150mm氯化钾、2mm氯化镁、2mmtcep、0.005％tween20、1％dmso的运行缓冲液(ph8.3)中进行的。使用生物素化vhl的多个表面密度(40、80和120ru)。如前所述制备生物素化vcb32。所有相互作用实验均在9℃下在包含20mmtris、150mm氯化钾、2mm氯化镁、2mmtcep、0.005％tween20、1％dmso的运行缓冲液(ph8.3)中进行。sim1(在100％dmso中10mm)最初在具有浓度为2％的dmso的运行缓冲液中以1μm制备。在没有dmso的运行缓冲液中将该溶液与50μm的brd4串联蛋白溶液以1∶1混合，以制备在包含1％dmso的运行缓冲液中的25μmbrd4串联蛋白和500nmsim1的最终溶液。然后在包含2μm布罗莫结构域和1％dmso的运行缓冲液中连续稀释该复合物(5点5倍连续稀释液)。溶液以单循环动力学形式顺序注射，而不进行再生(每个实验重复有三个重复系列，接触时间100秒，流量100μl/分钟，解离时间800秒)，其中注射之间使用30秒的稳定时间和并进行注射器清洗(50％dmso)。高流量和多种表面密度用于使传质作用最小化。对所有单周期实验进行了两个系列的空白注射。从原始数据中减去参考表面并去除空白注射的传感图，然后使用biacoreinsight评价软件进行数据分析。为了计算缔合速率(kon)、解离速率(koff)和解离常数(kd)，使用1∶1langmuir相互作用模型(包括传质项)拟合实验。[0283]nanobret泛素化、三元复合物和生物传感器实验。对于内源性活细胞bet∶泛素和bet∶vhl测定，使用fugenehd(promega)在6孔板中将稳定表达lgbit的crisprhibit-brd2、hibit-brd3和hibit-brd4hek293细胞用2μg的halotag-ubb或halotag-vhl载体转染。对于用nanoluc-brd4wt、n433f或n140f突变体进行的完全瞬时nanobret实验，将hek293细胞(8×105)用0.02μgnanoluc-brd4和2μg的halotag-vhl载体共转染。对于用包含wt串联bd1-bd2结构域(aa44至460)或包含n433f突变的brd4nl-bdl-bd2-ht生物传感器进行的瞬时nanobret实验，将hek293细胞(8×105)用0.02μg生物传感器质粒和2μg载体dna转染。次日，在存在或不存在halotagnanobret618配体(promega)的情况下，将转染的细胞(2×104)重新平板接种到白色96孔组织培养板中，并在37℃、5％co2下孵育过夜。对于动力学实验，将培养基替换为包含1∶100稀释的vivazine(promega)的opti-mem(gibco)，并将板在37℃、5％co2下孵育1小时，然后添加dmso或最终浓度为10nm至1μm的指定化合物。然后每3分钟多至5小时在配备有设定为37℃和5％co2的大气控制单元(bmglabtech)的clariostar上进行连续bret测量。对于生物传感器实验，将细胞用10μm的指定化合物的3倍连续滴定进行处理。添加nanobretnanoglo(promega)底物，并在化合物处理之后两小时使用glomaxdiscover微板读取器(promega)测量bret。用460/80nm带通滤光片和610nm长通滤光片(接受体，halotagnanobret配体)收集双过滤发光，积分时间为0.5秒。对于所有nanobret实验，以millibret单位表示背景减去的nanobret比率由以下等式计算：[0284][0285]bret的倍数提高是通过将mbret比率相对于dmso对照的平均mbret比率归一化来计算的。[0286]nanobret靶标接合和停留时间。对于活细胞和透化细胞中的靶标接合实验，将稳定表达lgbit的crisprhibit-brd4hek293细胞以2×104个细胞/孔的密度平板接种到白色96孔组织培养板中。在进行nanobret测量之前，将细胞用能量转移探针和指定的测试化合物平衡1小时。在示踪剂稀释缓冲液(12.5mmhepes，31.25％peg-400，ph7.5)中以20×的工作浓度制备了nanobret示踪剂。将nanobretbrd示踪剂-02以0.5μm的最终浓度添加至细胞。为了测量活细胞中的nanobret，根据制造商的推荐方案添加了nanobretnanoglo底物和胞外nanoluc抑制剂(promega)，并在配备有450nmbp滤光片(供体)和600nmlp滤光片(接受体)的glomaxdiscover光度计(luminometer)上测量过滤发光，积分时间为0.3秒。为了测量透化细胞中的nanobret，将毛地黄皂苷添加至细胞以使最终浓度为50μg/ml并在检测步骤期间省略胞外nluc抑制剂。对于停留时间实验，将稳定表达lgbit的crisprhibit-brd4hek293细胞胰蛋白酶化、洗涤并重悬于opti-mem中使密度为2×105个细胞/ml，并与1μmjq1、1μmsim1、100nm顺式-sim1、100nmmt1或10μmmz1(代表活细胞形式中示踪剂位移的代表性ic80值)孵育。将细胞在15ml锥形管中在组织培养培养箱中盖松开的情况下孵育1小时。在孵育之后，将细胞以300xg旋转5分钟，用opti-mem洗涤一次，再次以300xg旋转5分钟，然后用新鲜opti-mem重悬，然后以2×104个细胞/孔平板接种。添加nanobretbrd示踪剂-02，最终浓度为0.5μm细胞，并在glomaxdiscover上收集动力学nanobret测量。nanobret比率以millibret单位表示，并根据nanobret泛素化、三元复合物和生物传感器实验部分中的等式进行计算。[0287]化学-材料和方法[0288]除非另有说明，否则所有化学品均是市售的，至少为90％纯，且无需进一步纯化即可使用。使用了市售的干燥溶剂。在预涂覆的二氧化硅板上(kieselgel60f254，bdh)进行正相tlc，并通过uv光(uv254和/或365nm)和/或碱性高锰酸钾溶液观察。使用teledyneiscocombiflashrf用预包装的rediseprf正相一次性柱进行快速柱色谱。按照规定，nmr谱以brukerascend400mhz或500mhz记录。化学位移以ppm表示并参考残留溶剂信号：[0289]1hnmrδ(ppm)＝7.26(cdcl3)，13cnmrδ(ppm)＝77.16(cdcl3)；1hnmrδ(ppm)＝5.32(cd2cl2)，13cnmrδ(ppm)＝53.84(cd2cl2)，1hnmrδ(ppm)＝2.50(dmso-d6)；1hnmrδ(ppm)＝3.31(cd3od)，13cnmrδ(ppm)＝49.00(cd3od)。信号分裂模式描述为单峰(s)、双重峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)、宽峰(br)或其组合。耦合常数(j)以赫兹(hz)测量。在brukermicrotof上记录高分辨率质谱(highresolutionmassspectra，hrms)。在与agilenttechnologies6130四极杆lc/ms连接、与agilent二极管阵列检测器连接的agilenttechnologies1200系列hplc上记录其他分辨率ms和分析hplc迹线。所用柱为watersxbridge柱(50mm×2.1mm，3.5μm颗粒尺寸)，并将化合物用梯度为5％至95％乙腈/水+0.1甲酸(“酸性法”)洗脱。hplc纯化用watersxbridgec18柱(100mm×19mm；5μm颗粒尺寸)和水中的乙腈(梯度为5％至95％)在gilsonpreparativehplc系统上进行10分钟，流量25ml/分钟，并且水相中含0.1％氨。[0290]使用的缩写：dmso表示二甲基亚砜，pmb表示对甲氧基苄基，ms表示甲磺酰基，tbu表示叔丁基，ptsoh表示对甲苯磺酸，tbab表示四丁基溴化铵，tfa表示三氟乙酸，meoh表示甲醇，dcm表示二氯甲烷，ddq表示2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌，thf表示四氢呋喃，hatu表示1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐/酯，hoat表示1-羟基-7-氮杂苯并三唑，dipea表示n，n-二异丙基乙胺，dmf表示n，n-二甲基甲酰胺，mtbe表示甲基叔丁基醚，comu表示(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-碳六氟磷酸盐。[0291]化合物sim1、sim2、sim3的合成[0292][0293](2，2，5-三甲基-1，3-二烷-5-基)甲醇(1)[0294][0295]将2-(羟甲基)-2-甲基丙烷-1，3-二醇(50.0g，0.42mol)和对甲苯磺酸(50mg)溶解于无水丙酮(500ml)中。将混合物在室温下搅拌2天。将溶液通过添加固体碳酸钾来中和，过滤，并在真空下蒸发，以得到所期望的产物(64g，96％，稠无色油状物)，其无需进一步纯化即可使用。分析数据与文献中报道的那些相匹配(ouchim.etal.j.org.chem.1987，52，2420)。[0296]2-((烯丙氧基)甲基)-2-甲基丙烷-1，3-二醇(2)[0297][0298]将h2o(1.05ml)中的氢氧化钾(1.05g，16.75mmol)、烯丙基溴(1.54ml，18.75mmol)和tbab(202mg，0.625mmol)添加至(2，2，5-三甲基-1，3-二烷-5-基)甲醇1(1.0g，6.25mmol)在甲苯(6.25ml)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌24小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释。将有机相分离并蒸发至干燥。将粗物质通过柱色谱纯化。将所得烯丙基醚溶解于甲醇(16ml)和h2o(3.2ml)中。添加三氟乙酸(287μl)之后，将混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物蒸发至干燥。将粗物质通过柱色谱纯化以得到标题化合物。产率：860mg(86％)。[0299]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)＝5.98-5.83(1h，m)，5.28(1h，dd，j＝1.4，17.3hz)，5.21(1h，dd，j＝1.2，10.5hz)，4.03-3.98(2h，m)，3.73(2h，dd，j＝4.8，11.0hz)，3.62(2h，dd，j＝5.5，10.9hz)，3.47(2h，d，j＝4.0hz)，2.70(2h，s)，0.86(3h，s).[0300]13cnmr(101mhz，cdcl3)δ(ppm)＝134.3，117.2，75.8，72.5，68.0，40.8，17.2.[0301]11-((烯丙氧基)甲基)-1，21-二叠氮基-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷(5)[0302][0303]将2-((烯丙氧基)甲基)-2-甲基丙烷-1，3-二醇2(136mg，0.85mmol)、2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)甲磺酸乙酯3(646mg，2.55mmol)溶解于1，4-二氧六环(0.85ml)中。添加tbab(55mg，0.18mmo1)、碘化钾(7.1mg，0.04mmol)和氢氧化钾粉末(143mg，2.55mmol)，并将反应物在100℃下搅拌2小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释并过滤。将有机相蒸发至干燥。在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化粗物质以得到标题化合物。产率：50mg(12％)。[0304]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝5.96-5.84(1h，m)，5.26(1h，dd，j＝1.7，17.2hz)，5.15(1h，dd，j＝1.5，10.4hz)，4.01-3.93(2h，m)，3.76-3.61(16h，m)，3.62-3.55(4h，m)，3.44-3.37(4h，m)，3.37-3.33(4h，m)，3.33-3.29(2h，m)，0.96(3h，s).[0305]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝135.3，116.0，74.0，73.0，72.3，71.1，70.8，70.7，70.5，70.0，50.7，41.0，17.4.[0306]14-((烯丙氧基)甲基)-1，27-二叠氮基-14-甲基-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷(6)[0307][0308]将2-((烯丙氧基)甲基)-2-甲基丙烷-1，3-二醇2(50mg，0.31mmol)、2-(2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲磺酸乙酯4(278mg，0.94mmol)溶解于1，4-二氧六环(0.31ml)中。添加tbab(55mg，0.18mmol)、碘化钾(2.6mg，0.016rmmol)和氢氧化钾粉末(52.5mg，0.94mmol)，并将反应物在100℃下搅拌2小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释并过滤。将有机相蒸发至干燥。在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化粗物质以得到标题化合物。产率：15mg(9％)。[0309]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝5.93-5.83(1h，m)，5.25(1h，dd，j＝1.3，17.2hz)，5.16-5.11(1h，m)，3.96-3.92(2h，m)，3.71-3.54(28h，m)，3.42-3.27(10h，m)，0.94(3h，s).[0310]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝135.5，116.2，74.2，73.2，72.4，71.2，70.9，70.8，70.6，70.2，50.9，41.2，17.6.[0311]1-((2-碘乙氧基)甲基)-4-甲氧基苯(8)[0312][0313]在0℃下将碘(180mg，0.71mmol)添加至三苯基膦(187mg，0.71mmol)和咪唑(48.6mg，0.71mmol)在二氯甲烷(3.8ml)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌5分钟。在0℃下向反应混合物添加二氯甲烷(1.3ml)中的2-((4-甲氧基苯)氧基)乙烷-1-醇7(100mg，0.55mmol)。将混合物在室温下搅拌3小时。将反应用na2so3(aq)和nahco3淬灭，然后用乙酸乙酯萃取。将有机相合并并蒸发至干燥。通过冲洗柱色谱来纯化粗物质以得到标题化合物。产率：131mg(82％)。[0314]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)＝7.28(2h，d，j＝8.8hz)，6.89(2h，d，j＝8.8hz)，4.51(2h，s)，3.81(3h，s)，3.71(2h，t，j＝7.0hz)，3.26(2h，t，j＝6.7hz)[0315]13cnmr(101mhz，cdcl3)δ(ppm)＝159.4，129.9，129.4，113.9，72.6，70.5，55.3，3.0.[0316]5-((2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙氧基)甲基)-2，2，5-三甲基-1，3-二烷(9)[0317][0318]在0℃下将矿物油中的氢化钠60％分散体(384mg，9.60mmol)添加至(2，2，5-三甲基-1，3-二烷-5-基)甲醇1(1.54g，9.60mmol)在dmf(3.0ml)中的溶液。将所得混合物在室温下搅拌30分钟。在0℃下向混合物逐滴添加dmf(0.5ml)中的1-((2-碘乙氧基)甲基)-4-甲氧基苯8(700mg，2.40mmol)。将反应混合物在130℃下搅拌45分钟。将混合物用h2o淬灭并用乙酸乙酯萃取。将有机相蒸发至干燥。通过冲洗柱色谱来纯化粗物质以得到标题化合物。产率：110mg(14％)。[0319]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)＝7.29(2h，d，j＝6.3hz)，6.90(2h，d，j＝8.8hz)，4.53(2h，s)，3.83(3h，s)，3.74(2h，d，j＝11.9hz)，3.68-3.60(4h，m)，3.56(2h，d，j＝11.7hz)，3.49(2h，s)，1.45(3h，s)，1.42(3h，s)，0.92(3h，s).[0320]13cnmr(101mhz，cdcl3)δ(ppm)＝159.3，130.7，129.4，113.9，98.0，74.3，73.0，71.3，69.2，66.7，55.4，34.6，26.4，21.5，18.5.[0321]2-((2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙氧基)甲基)-2-甲基丙烷-1，3-二醇(10)[0322][0323]将三氟乙酸(11μl，0.14mmol)添加至甲醇(0.6ml)和h2o(0.02ml)中的5-((2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙氧基)甲基)-2，2，5-三甲基-1，3-二烷9(77mg，0.24mmol)。将所得混合物在室温下搅拌16小时，并随后蒸发至干燥。通过冲洗柱色谱来纯化粗物质以得到标题化合物。产率：60mg(89％)。[0324]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝7.26(2h，d，j＝8.5hz)，6.88(2h，d，j＝8.5hz)，4.49(2h，s)，3.80(3h，s)，3.51(2h，s)，2.66(2h，s)，0.80(3h，s)[0325]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝159.5，130.1，129.6，114.0，73.1，70.9，69.0，68.3，55.4，41.0，174.[0326]1，21-二叠氮基-11-((2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷(11)[0327][0328]向2-((2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙氧基)甲基)-2-甲基丙烷-1，3-二醇10(73mg，0.26mmol)和2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)甲烷磺酸乙酯3(390mg，1.54mrmol)在1，4-二氧六环(0.51ml)中的混合物添加tbab(25mg，0.077mmol)、碘化钾(2.1mg，0.013mmol)和氢氧化钾粉末(86mg，1.54mmol)。将所得反应混合物在100℃下搅拌40小时。通过冲洗柱色谱来纯化反应混合物以得到标题化合物。产率：85mg(55％)。[0329]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)＝7.26(2h，d，j＝8.4hz)，6.87(2h，d，j＝8.4hz)，4.49(2h，s)，3.80(3h，s)，3.70-3.53(24h，m)，3.41-3.35(4h，m)，3.35—3.30(6h，m)，0.94(3h，s)[0330]13cnmr(101mhz，cdcl3)δ(ppm)＝159.3，130.8，129.3，113.9，74.1，72.9，71.2，70.9，70.8，70.7，70.2，69.3，55.4，50.9，41.2，17.5.[0331]1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13-四氧杂十五烷-15-醇(12)[0332][0333]在0℃下向1，21-二叠氮基-11-((2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷11(118mg，0.20mmol)在h2o(0.20ml)和二氯甲烷(2.0ml)中的混合物添加2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(49.2mg，0.22mmol)。将所得反应混合物在4℃下搅拌16小时。将反应混合物用nahco3(aq)淬灭并过滤以去除沉淀。蒸发滤液，并在酸性条件下将剩下的剩余物通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：86mg(91％)。[0334]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝3.71-3.61(18h，m)，3.60-3.55(4h，m)，3.55-3.51(2h，m)，3.42-3.30(10h，m)，2.48(1h，t，j＝6.2hz)，0.94(3h，s).[0335]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝74.2，73.5，72.3，71.2，70.9，70.8，70.7，70.2，61.7，50.9，41.1，17.7.[0336]11-((2-(烯丙氧基)乙氧基)甲基)-1，21-二叠氮基-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷(13)[0337][0338]向1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13-四氧杂十五烷-15-醇12(50mg，0.10mmol)在1，4-二氧六环(0.21ml)中的混合物添加烯丙基溴(26mg，0.31mmol)和氢氧化钾粉末(18mg，0.31mmol)。将所得反应混合物在80℃下搅拌6小时。将反应混合物用二氯甲烷稀释并蒸发。将剩下的剩余物通过冲洗柱色谱来纯化以得到标题化合物。产率：39mg(72％)。[0339]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝5.95-5.85(1h，m)，5.26(1h，dd，j＝1.7，17.2hz)，5.16(1h，dd，j＝1.4，10.5hz)，4.01(2h，d，j＝6.0hz)，3.73-3.59(16h，m)，3.58-3.52(8h，m)，3.40-3.35(4h，m)，3.35-3.28(6h，m)，0.93(3h，s)[0340]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝135.1，116.8，74.1，72.2，71.2，70.9，70.8，70.7，70.2，69.5，50.8，41.2，17.5.[0341]1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13-四氧杂十五烷-15-醛(14)[0342][0343]向11-((烯丙氧基)甲基)-1，21-二叠氮基-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷5(25mg，0.053mmol)在h2o(0.3ml)和1，4-二氧六环(1.0ml)中的混合物中添加2，6-卢剔啶(12.2μl，0.11mmol)、h2o中的四氧化锇4％(6.7μl，0.0011mol)、高碘酸钠(45mg，0.21mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物用na2so3(aq)淬灭并用二氯甲烷萃取。将有机层浓缩并将剩下的剩留物通过冲洗柱色谱来纯化以得到标题化合物。产率：16mg(64％)。[0344]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝9.73(1h，s)，4.02(2h，s)，3.74-3.52(20h，m)，3.46-3.26(10h，m)，098(3h，s).[0345]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝202.2，77.0，74.7，73.9，71.2，70.9，70.8，70.7，70.2，50.9，41.3，17.5.[0346]1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16-五氧杂十八烷-18-醛(15)[0347][0348]向11-((2-(烯丙氧基)乙氧基)甲基)-1，21-二叠氮基-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷13(50mg，0.096mmol)在h2o(0.6ml)和1，4-二氧六环(1.7ml)中的混合物添加2，6-卢剔啶(22.4μl，0.19mmol)、h2o中的四氧化锇4％(12.2μl，0.0019mmol)和高碘酸钠(82.5mg，0.39mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物用na2so3(aq)淬灭并用二氯甲烷萃取。将有机层浓缩并将剩下的剩余物通过冲洗柱色谱来纯化以得到标题化合物。产率：38mg(76％)。[0349]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)＝9.71(1h，s)，4.14(2h，s)，3.71-3.50(24h，m)，3.44-3.25(10h，m)，0.92(3h，s)[0350]13cnmr(101mhz，cdcl3)δ(ppm)＝201.3，77.0，73.9，73.4，71.1，70.8，70.6，70.1，55.1，50.8，41.0，17.5[0351]1-叠氮基-14-(13-叠氮基-2，5，8，11-四氧杂十三烷基)-14-甲基-3，6，9，12，16-五氧杂十八烷-18-醛(16)[0352][0353]向14-((烯丙氧基)甲基)-1，27-二叠氮基-14-甲基-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷6(35mg，0.062mmol)在h2o(0.4ml)和1，4-二氧六环(1.7ml)中的混合物添加2，6-卢剔啶(14.5μl，0.12mmol)、h2o中的四氧化锇4％(12.2μl，0.0012mmol)、高碘酸钠(53mg，0.25mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物用na2so3(aq)淬灭并用二氯甲烷萃取。将有机层浓缩并将剩下的剩余物通过冲洗柱色谱来纯化以得到标题化合物。产率：23mg(65％)。[0354]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝9.75(1h，s)，4.10-3.99(2h，m)，3.77-3.29(38h，m)，1.00(3h，s).[0355]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝202.2，74.7，73.9，71.2，70.9，70.8，70.6，70.2，50.9，41.3，17.5.[0356]1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13-四氧杂十五烷-15-酸(oicacid)(17)[0357][0358]向1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13-四氧杂十五烷-15-醛14(16mg，0.034mmol)在t-buoh(0.6ml)中的混合物添加thf(84μl，0.168mmol)中的2m2-甲基-2-丁烯、nah2po4(4.0mg，0.034mmol)、h2o(0.2ml)中的亚氯酸钠(12.1mg，0.134mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物浓缩并随后用naoh(aq)稀释。将混合物用mtbe洗涤并用2mhcl中和。用二氯甲烷萃取，将有机层通过na2so4干燥并浓缩。将剩余的粗品用于下一步，而无需进一步纯化。产率：16mg(97％)。[0359]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝405(2h，s)，3.70-3.58(20h，m)，3.45-3.33(10h，m)，0.95(3h，s).[0360]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝172.1，75.4，74.7，71.3，70.9，70.7，70.4，70.2，68.8，50.8，40.8，18.0.[0361]1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16-五氧杂十八烷-18-酸(18)[0362][0363]向1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16-五氧杂十八烷-18-醛15(35mg，0.067mmol)在叔丁醇(1.2ml)中的混合物添加thf(168μl，0.336mmol)中的2m2-甲基-2-丁烯、nah2po4(8.1mg，0.067mmol)、h2o(0.4ml)中的亚氯酸钠(24mg，0.265mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物浓缩并随后用naoh(aq)稀释。将混合物用mtbe洗涤并用2mhcl中和。用二氯甲烷萃取，将有机层通过na2so4干燥并浓缩。将剩余的粗品用于下一步，而无需进一步纯化。产率：36mg(定量)。[0364]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝4.09(2h，s)，3.71-3.47(24h，m)，3.37-3.21(10h，m)，0.87(3h，s)[0365]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝172.2，74.0，73.9，71.5，71.1，70.8，707，70.1，68.9，50.8，410，17.5.[0366]1-叠氮基-14-(13-叠氮基-2，5，8，11-四氧杂十三烷基)-14-甲基-3，6，9，12，16-五氧杂十八烷-18-酸(19)[0367][0368]向1-叠氮基-14-(13-叠氮基-2，5，8，11-四氧杂十三烷基)-14-甲基-3，6，9，12，16-五氧杂十八烷-18-醛16(14mg，0.025mmol)在叔丁醇(0.45ml)中的混合物添加thf(62μl，0.124mmol)中的2m2-甲基-2-丁烯、nah2po4(3.0mg，0.025mmol)、h2o(0.15ml)中的亚氯酸钠(8.9mg，0.099mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物浓缩并随后用naoh(aq)稀释。将混合物用mtbe洗涤并用2mhcl中和。用二氯甲烷萃取，将有机层通过na2so4干燥并浓缩。将剩余的粗品用于下一步，而无需进一步纯化。产率：8mg(56％)。[0369]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝4.04(2h，s)，3.71-3.55(28h，m)，3.45-3.32(10h，m)，0.95(3h，s)[0370]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝171.9，75.3，74.7，71.4，70.9，70.8，70.7，70.4，70.2，68.9，50.9，40.8，18.0.[0371](2s，4r)-1-((s)-1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-17-(叔丁基)-11-甲基-15-氧代-3，6，9，13-四氧杂-16-氮杂十八烷-18-酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(20)[0372][0373]将comu(10.4mg，0.024mmol)、n，n-二异丙基乙胺(14.1μl，0.081mmol)添加至1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13-四氧杂十五烷-15-酸17(10mg，0.020mmol)在dmf(0.20ml)中的混合物。将所得反应混合物在室温下搅拌2分钟。将vh032胺盐酸盐53(14.2mg，0.031mmol)添加至混合物。然后，将混合物在室温下搅拌16小时并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：10mg(54％)。[0374]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝8.68(1h，s)，7.39-7.30(5h，m)，7.10(1h，d，j＝8.5hz)，4.73(1h，t，j＝7.8hz)，4.59-4.51(2h，m)，4.48(1h，d，j＝8.7hz)，4.35(1h，dd，j＝5.5，15.0hz)，4.09(1h，d，j＝12.0hz)，3.94(2h，dd，j＝15.4，17.7hz)，3.71-3.53(21h，m)，3.46-3.30(10h，m)，2.60-2.49(1h，m)，2.51(3h，s)，2.16-2.08(1h，m)，0.96(3h，s)，0.95(9h，s).[0375]13cnmr(126mhz，cdcla)δ(ppm)＝171.5，170.8，170.7，150.5，148.6，138.3，131.8，131.1，1297，128.3，74.8，74.2，74.1，71.2，70.9，70.8，70.7，70.6，70.3，70.2，58.5，57.2，56.7，50.8，43.4，41.1，35.9，35.0，26.5，17.7，16.2.[0376]c41h65n10o11s[m+h+]的ms(esi)计算值为905.5，获得值为905.3。[0377](2s，4r)-1-((s)-21-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-2-(叔丁基)-11-甲基-4-氧代-6，9，13，16，19-五氧杂-3-氮杂二十一烷酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(21)[0378][0379]向1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16-五氧杂十八烷-18-酸18(17mg，0.032mmol)在dmf(0.32ml)中的混合物添加hatu(18mg，0.048mmol)、hoat(6.5mg，0.048mmol)、n，n-二异丙基乙胺(22μl，0.127mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌5分钟。将vh032胺盐酸盐53(22.1mg，0.032mmol)添加至混合物。然后将混合物在室温下搅拌6小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：13mg(43％)。[0380]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝8.75(1h，s)，7.44—7.34(5h，m)，7.21(1h，d，j＝8.0hz)，4.76(1h，t，j＝7.8hz)，461-4.50(3h，m)，4.38(1h，dd，j＝5.4，148hz)，4.12-3.97(3h，m)，3.74-3.55(25h，m)，3.43-3.29(10h，m)，2.61-2.51(1h，m)，2.54(3h，s)，2.17-2.10(1h，m)，0.97(9h，s)，0.94(3h，s).[0381]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝171.6，170.8，170.5，150.6，148.3，138.4，131.9，130.9，129.7，128.3，74.2，74.1，71.2，71.1，70.9，70.8，70.6，70.3，70.2，58.6，57.2，56.8，50.9，43.4，41.1，36.0，35.1，26.6，17.5，16.0.[0382]c43h69n10o12s[m+h+]的ms(esi)计算值949.5，获得值为949.4。[0383](2s，4r)-1-((s)-1-叠氮基-14-(13-叠氮基-2，5，8，11-四氧杂十三烷基)-20-(叔丁基)-14-甲基-18-氧代-3，6，9，12，16-五氧杂-19-氮杂二十一烷-21-酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(22)[0384][0385]向1-叠氮基-14-(13-叠氮基-2，5，8，11-四氧杂十三烷基)-14-甲基-3，6，9，12，16-五氧杂十八烷-18-酸19(7.1mg，0.012mrmol)在dmf(0.20ml)中的混合物添加hatu(7.0mg，0.018mmol)、hoat(2.5mg，0.018mmol)、n，n-二异丙基乙胺(8.5μl，0.127mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌5分钟。将vh032胺盐酸盐53(22.1mg，0.049mmol)添加至混合物。然后，将混合物在室温下搅拌6小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：6.2mg(51％)。[0386]1hnmr(500mhz，cd3od)δ(ppm)＝8.90(1h，s)，7.54-7.36(5h，m)，4.69(1h，d，j＝9.7hz)，4.61-4.48(3h，m)，4.36(1h，dd，j＝5.1，15.6hz)，4.00(1h，d，j＝14.8hz)，3.96(1h，d，j＝15.4hz)，3.87(1h，d，j＝11.5hz)，3.80(1h，dd，j＝3.7，10.8hz)，3.69-3.55(28h，m)，3.48(1h，d，j＝9.3hz)，3.44(1h，d，j＝9.0hz)，3.41-3.34(8h，m)，2.49(3h，s)，2.27-2.19(1h，m)，2.14-2.06(1h，m)，1.05(9h，s)，1.01(3h，s)[0387]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝174.4，171.9，171.6，152.9，149.0，140.3，133.5，131.5，130.4，129.0，75.5，74.8，74.8，72.2，71.7，71.6，71.5，71.1，60.8，58.1，51.8，43.7，42.1，38.9，37.3，27.0，18.0，15.8.[0388]c45h73n10o13s[m+h+]的ms(esi)的计算值993.5，获得值为993.4。[0389]n，n’‑(11-((2-(((s)-1-((2s，4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(sim1)[0390][0391]向(2s，4r)-1-((s)-1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-17-(叔丁基)-11-甲基-15-氧代-3，6，9，13-四氧杂-16-氮杂十八烷-18-酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺20(10mg，0.011mmol)在meoh(0.60ml)中的混合物添加10重量％钯碳(2.0mg)。将所得反应混合物在氢气氛下在室温下搅拌2小时。然后将混合物在硅藻土垫上过滤并蒸发。将(+)-jq1羧酸(12.5mg，0.031mmol)、comu(13.4mg，0.031mmol)、n，n-二异丙基乙胺(13.6μl，0.078mmol)在dmf(0.20ml)中的预搅拌混合物添加至浓缩的粗产物。然后，将混合物在室温下搅拌3小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：10mg(54％)。[0392]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝8.67(1h，s)，7.47-7.28(14h，m)，7.17(1h，d，j＝9.7hz)，4.86(1h，m)，4.83(t，1h，j＝7.9hz)，4.70-4.61(3h，m)，4.53(1h，dd，j＝5.7，15.2hz)，4.48-4.42(1h，m)，4.34(1h，dd，j＝6.0，14.9hz)，4.1(1h，d，j＝11.1hz)，4.06(1h，d，j＝15.3hz)，3.96(1h，d，j＝15.3hz)，3.70-3.24(31h，m)，3.21(1h，d，j＝8.9hz)，2.63(6h，s)，2.50(3h，s)，2.44(1h，m)，2.39(6h，s)，2.15(1h，m)，1.94-1.84(4h，m)，1.65(6h，s)，0.97(9h，s)，0.93(3h，s).[0393]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝171.5，171.2，170.8，170.7，164.0，155.9，150.4，149.9，148.6，138.5，136.9，132.3，131.1，130.9，130.7，130.1，129.6，128.8，128.2，73.7，73.6，73.5，71.2，70.8，70.7，70.6，70.4∶70.3，70.1，59.0，57.3，56.7，54.5，43.3，41.1，39.6，38.8，36.5，35.6，26.6，17.7，16.2，14.5.c79h99cl2n14o13s3[m+h+]的hrms(eesi)计算值为1617.6050，获得值为1617.6390。[0394]n，n’‑(11-((2-(2-(((s)-1-((2s，4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(sim2)[0395][0396]向(2s，4r)-1-((s)-21-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-2-(叔丁基)-11-甲基-4-氧代-6，9，13，16，19-五氧杂-3-氮杂二十一烷酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺21(13mg，0.014mmol)在meoh(0.80ml)中的混合物添加10重量％钯碳(2.5mg)。将所得反应混合物在氢气氛下在室温下搅拌2小时。然后将混合物在硅藻土垫上过滤并蒸发。将(+)-jq1羧酸(22.2mg，0.055mmol)、comu(23.7mg，0.055mmol)、n，n-二异丙基乙胺(16μl，0.092mmol)在dmf(0.20ml)中的预搅拌混合物添加至浓缩的粗品。然后，将混合物在室温下搅拌16小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：12mg(53％)。[0397]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝8.67(1h，s)，7.57(1h，t，j＝4.9hz)，7.42-7.28(12h，m)，7.25-7.15(2h，m)，4.81(1h，t，j＝7.7hz)，4.69-4.60(3h，m)，4.54-4.47(2h，m)，4.46-4.42(1h，m)，4.36(1h，dd，j＝5.8，15.3hz)，4.07(1h，d，j＝15.4hz)，4.05(1h，brd，j＝11.1hz)，3.98(1h，d，j＝15.4hz)，3.73-3.23(36h，m)，2.63(3h，s)，2.62(3h，s)，2.50(3h，s)，2.47—2.40(1h，m)，2.39(6h，s)，2.23—2.16(1h，m)，2.01—1.91(4h，m)，1.66(6h，s)，0.97(9h，s)，0.92(3h，s).[0398]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝171.4，171.2，170.7，170.2，163.9，155.9，150.3，149.9，148.6，138.5，136.9，136.8，132.3，131.8，131.1，130.9，130.7，130.0，129.6，128.8，128.2，74.0，73.8，71.2，71.1，71.0，70.7，70.6，70.1，59.0，57.2，56.8，54.5，43.3，41.2，39.6，39.0，36.5，35.8，26.6，17.6，16.2，14.5，13.2，11.9.[0399]c81h103cl2n14o14s3[m+h+]的hrms(eesi)计算值为1661.6312，获得值为1661.8200。[0400]n，n’‑(14-((2-(((s)-1-((2s，4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-14-甲基-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷-1，27-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(sim3)[0401][0402]向(2s，4r)-1-((s)-1-叠氮基-14-(13-叠氮基-2，5，8，11-四氧杂十三烷基)-20-(叔丁基)-14-甲基-18-氧代-3，6，9，12，16-五氧杂-19-氮杂二十一烷-21-酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺22(10mg，0.020mmol)在meoh(0.20ml)中的混合物添加10重量％钯碳(10.4mg)。将所得反应混合物在氢气氛下在室温下搅拌2小时。然后将混合物在硅藻土垫上过滤并蒸发。将(+)-jq1羧酸(14.8mg，0.037mmol)、hatu(14mg，0.037mmol)、hoat(5.0mg，0.037mmol)、n，n-二异丙基乙胺(12.8μl，0.074mmol)在dmf(0.12ml)中的预搅拌混合物添加至浓缩的品。然后，将混合物在室温下搅拌16小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：13mg[0403](43％)。[0404]1hnmr(500mhz，cd3od)δ(ppm)＝8.86(1h，s)，7.52-7.36(12h，m)，4.71-4.40(6h，m)，4.39-4.29(1h，m)，3.97(1h，d，j＝14.4hz)，3.93(1h，d，j＝15.6hz)，3.85(1h，d，j＝10.8hz)，3.79(1h，dd，j＝3.9，11.1hz)，3.68-3.33(41h，m)，3.28(1h，d，j＝5.1hz)，2.68(6h，s)，2.46(3h，s)，2.44(6h，s)，2.26-2.18(1h，m)，2.12-2.05(1h，m)，1.69(6h，s)，1.03(9h，s)，0.97(3h，s).[0405]13cnmr(126mhz，cd3od)δ(ppm)＝174.4，172.9，171.8，171.6，166.1，157.1，152.8，149.1，140.3，138.2，137.9，133.5，133.2，132.0，131.5，131.4，130.5，130.4，129.8，129.0，75.5，74.8，72.2，71.7，71.6，71.5，71.4，71.1，70.7，60.9，58.1，58.0，55.2，43.7，42.1，40.6，38.9，38.8，37.3，27.0，18.0，15.9，14.4，12.9，11.6.[0406]c83h107cl2n14o15s3[m+h+]的hrms(eesi)计算值为1705.6574，获得值为1705.6430。[0407]化合物sim4、sim5的合成[0408][0409]1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-n-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)-11-甲基-3，6，9，13-四氧杂十五烷-15-酰胺(23)[0410][0411]向1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13-四氧杂十五烷-15-酸17(14mg，0.0284mmol)在dmf(0.2ml)中的混合物添加comu(13.4mg，0.031mmol)、n，n-二异丙基乙胺(14.8μl，0.085mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌2分钟。将4-[(2-氨基乙基)氨基]-2-(2，6-二氧代-3-哌啶基)-1h-异吲哚-1，3(2h)-二酮54(10.8mg，0.034mmol)添加至混合物。然后，将混合物在室温下搅拌1小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：12.5mg(56％)。[0412]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝8.27(1h，s)，7.54(1h，t，j＝7.8hz)，7.14(1h，d，j＝7.1hz)，7.07(1h，d，j＝8.6hz)，6.50(1h，t，j＝5.7hz)，4.94(1h，dd，j＝5.3，12.3hz)，4.00-3.95(2h，m)，3.73-3.49(24h，m)，3.45-3.32(10h，m)，2.94-2.70(3h，m)，2.21—2.11(1h，m)，0.92(3h，s).[0413]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝171.4，171.1，169.5，168.4，167.7，147.0，136.4，132.7，117.0，112.0，110.5，75.0，74.4，71.2，70.8，70.7，70.5，70.1，50.9，49.1，42.3，40.9，38.7，31.6，22.9.[0414]c34h51n10o12[m+h+]的ms(eesi)计算值为791.4，获得值为791.3。[0415]1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-n-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)-11-甲基-3，6，9，13，16-五氧杂十八烷-18-酰胺(24)[0416][0417]向1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16-五氧杂十八烷-18-酸18(14mg，0.026mmol)在dmf(0.42ml)中的混合物添加comu(12mg，0.029mmol)、n，n-二异丙基乙胺[0418](14μl，0.078mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌2分钟。将4-[(2-氨基乙基)氨基]-2-(2，6-二氧代-3-哌啶基)-1h-异吲哚-1，3(2h)-二酮54(22.1mg，0.032mmol)添加至混合物。然后，将混合物在室温下搅拌1小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：12mg(55％)。[0419]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝8.36(1h，s)，7.53(1h，t，j＝7.8hz)，7.22(1h，t，j＝5.6hz)，7.14(1h，d，j＝6.8hz)，7.05(1h，d，j＝8.7hz)，6.49(1h，t，j＝5.7hz)，4.94(1h，dd，j＝5.2，122hz)，4.07-4.01(2h，m)，3.72-3.47(28h，m)，3.44-3.29(10h，m)，2.95-2.69(3h，m)，2.18-2.10(1h，m)，0.95(3h，s).[0420]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝171.2，169.4，168.4，167.7，146.9，136.4，132.7，116.9，112.1，110.6，74.2，74.1，71.2，71.1，70.9，70.8，70.7，70.6，70.1，50.9，49.1，42.3，41.2，38.6，31.6，22.9，17.6.[0421]c36h55n10o13[m+h+]的ms(esi)计算值为835.4，获得值为835.3。[0422]n，n’‑(11-((2-((2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(sim4)[0423][0424]向meoh(0.8ml)中的1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-n-(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)-11-甲基-3，6，9，13-四氧杂十五烷-15-酰胺23(12.5mg，0.0158mmo1)添加10重量％钯碳(2.5mg)。将所得反应混合物在氢气氛下在室温下搅拌2小时。然后将混合物在硅藻土垫上过滤并蒸发溶剂。将(+)-jq1羧酸(12.5mg，0.031mmol)、comu(13.4mg，0.031mmol)、n，n-二异丙基乙胺(13.6μl，0.078mmol)在dmf(0.20ml)中的预搅拌混合物添加至浓缩的粗产物。然后，将混合物在室温下搅拌4小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：1.3mg(5％)。[0425]1hnmr(500mhz，cd3od)δ(ppm)＝8.53(1h，s)，7.51(1h，dd，j＝7.3，8.5hz)，7.44(4h，d，j＝8.4hz)，7.39(4h，dd，j＝2.2，8.8hz)，7.08(1h，d，j＝8.6hz)，7.02(1h，d，j＝7.2hz)，4.99(1h，ddd，j＝2.0，5.5，12.6hz)，4.65-459(2h，m)，3.92-386(2h，m)，369-338(32h，m)，3.31-3.25(6h，m)，2.89-2.78(1h，m)，2.75-2.62(8h，m)，2.43(6h，s)，2.12-2.03(1h，m)，1.68(6h，s)，0.87(3h，s).[0426]13cnmr(126mhz，cd3od)δ(ppm)＝174.7，173.5，172.9，171.4，170.3，169.2，166.1，157.0，152.2，148.1，138.1，137.9，1373，133.5，133.2，1320，131.4，130.4，129.8，129.5，1180，112.1，111.3，754，74.7，72.1，71.6，71.4，70.7，55.2，42.6，41.8，40.6，39.6，38.7，32.2，30.8，23.8，18.0，14.5.[0427]c72h85cl2n14o14s2[m+2h+]/2的hrms(esi)计算值为752.2633，获得值为752.2732。[0428]n，n’‑(11-((2-(2-((2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(sim5)[0429][0430]向1-叠氮基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-n，(2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)-11-甲基-3，6，9，13，16-五氧杂十八烷-18-酰胺24(12mg，0.0144mmol)在meoh(0.80ml)中的混合物添加10重量％钯碳(2.5mg)。将所得反应混合物在氢气氛下在室温下搅拌2小时。然后将混合物在硅藻土垫上过滤并蒸发溶剂。将(+)-jq1羧酸(13.8mg，0.035mmol)、comu(14.8mg，0.035mmol)、n，n-二异丙基乙胺(15μl，0.086mmol)在dmf(0.20ml)中的预搅拌混合物添加至浓缩的粗产物。然后，将混合物在室温下搅拌16小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：1.8mg(8％)。[0431]1hnmr(500mhz，cd3od)δ(ppm)＝7.52(1h，dd，j＝7.4，8.2hz)，7.44(4h，d，j＝8.4hz)，7.39(4h，dd，j＝1.4，8.7hz)，7.10(1h，d，j＝8.6hz)，7.02(1h，d，j＝7.1hz)，5.00(1h，dd，j＝5.3，13.0hz)，4.62(2h，dd，j＝5.2，8.9hz)，3.99-3.94(2h，m)，3.67-3.38(36h，m)，3.36-3.23(7h，m)，2.88-2.78(1h，m)，2.76-2.61(2h，m)，2.68(6h，s)，2.43(6h，s)，2.12-2.04(1h，m)，1.69(6h，s)，0.88(3h，s).[0432]13cnmr(126mhz，cd3od)δ(ppm)＝174.6，173.5，172.9，1714，170.5，169.2，166.1，157.0，1522，148.0，138.1，137.9，137.3，133.5，133.2，132.0，131.4，129.8，118.1，112.1，111.4，74.8，72.1，71.9，71.7，71.6，71.4，71.3，70.7，55.2，42.6，42.0，40.6，39.4，38.7，32.2，30.8，23.7，18.0，14.5，12.9，11.6.[0433]c74h89cl2n14o15s2[m+h+]的hrms(esi)计算值为1547.5445，获得值为1547.5989。[0434]化合物sim6、顺式-sim1的合成[0435][0436]n，n’‑(11-((烯丙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(25)[0437][0438]向11-((烯丙氧基)甲基)-1，21-二叠氮基-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷5(25mg，0.053mmol)在thf(0.53ml)中的混合物添加pph3(41.7mg，0.16mmol)。将所得混合物在50℃下搅拌1小时。将h2o(0.05ml)添加至反应混合物。然后，将混合物在50℃下搅拌1小时并浓缩。将(+)-jq1羧酸(64mg，0.16mmol)、comu(20.5mg，0.16mmol)、n，n-二异丙基乙胺(55.4μl，0.32mmol)在dmf(0.42ml)中的预搅拌混合物添加至浓缩的粗品。然后，将所得混合物在室温下搅拌1小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：17mg(27％)。[0439]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)＝7.40(4h，d，j＝8.1hz)，7.31(4h，d，j＝7.9hz)，6.98-6.89(2h，m)，5.93—5.80(1h，m)，5.23(1h，d，j＝17.2hz)，5.12(1h，d，j＝11.0hz)，4.65(2h，t，j＝6.8hz)，3.93(2h，d，j＝5.2hz)，3.72-3.24(32h，m)，2.66(6h，s)，239(6h，s)，166(6h，s)，0.94(3h，s).[0440]13cnmr(101mhz，cdcl3)δ(ppm)＝170.7，164.0，155.8，150.0，136.9，136.8，135.4，132.3，131.0，130.9，130.6，130.0，116.3，74.1，73.1，72.4，71.2，70.7，70.6，70.5，70.0，54.5，41.1，39.6，39.2，17.6，14.5，13.2，119.[0441]c58h73cl2n10o9s2[m+h+]的ms(esi)计算值为1187.4，获得值为1187.4。[0442]n，n’‑(14-((烯丙氧基)甲基)-14-甲基-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷-1，27-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(26)[0443][0444]向14-((烯丙氧基)甲基)-1，27-二叠氮基-14-甲基-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷6(67mg，0.119mmol)在thf(1.2ml)中的混合物添加pph3(93.5mg，0.36mmol)。将所得混合物在50℃下搅拌1小时。将h2o(0.12ml)添加至反应混合物。然后，将混合物在50℃下下搅拌1小时并浓缩。将(+)-jq1羧酸(143mg，0.36mmol)、comu(153mg，0.36mmol)、n，n-二异丙基乙胺(124μl，0.72mmol)在dmf(0.95ml)中的预搅拌混合物添加至浓缩的粗品。然后，将所得混合物在室温下搅拌1小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：87mg(57％)。[0445]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝738(4h，d，j＝8.2hz)，7.28(4h，d，j＝8.0hz)，7.09-693(2h，m)，5.89-5.76(1h，m)，5.20(1h，d，j＝18.0hz)，5.08(1h，d，j＝10.2hz)，4.62(2h，t，j＝6.0hz)，3.89(2h，d，j＝4.8hz)，3.82-3.18(40h，m)，2.62(6h，s)，2.36(6h，s)，1.64(6h，s)，0.90(3h，s).[0446]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝170.5，163.7，155.6，149.7，136.6，135.2，132.0，130.8，130.4，129.8，128.6，116.0，73.9，72.9，72.1，71.0，70.6，70.5，70.3，69.7，54.3，40.9，39.4，38.9，17.4，14.3，13.0，11.7.[0447]c62h81cl2n10o11s2[m+h+]的ms(esi)计算值为1275.5，获得值为1275.5。[0448]n，n’‑(11-甲基-11-((2-氧代乙氧基)甲基)-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(27)[0449][0450]向n，n’‑(11-((烯丙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)25(17mg，0.014mmol)在h2o(0.09ml)和1，4-二氧六环(0.26ml)中的混合物添加2，6-卢剔啶(3.3μl，0.029mmol)、h2o中的四氧化锇4％(1.8μl，0.0003mmol)、高碘酸钠(12.2mg，0.058mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌8小时。将反应混合物用na2so3(aq)淬灭并用二氯甲烷萃取。将有机层浓缩，并将剩下的剩余物通过冲洗柱色谱来纯化以得到标题化合物。产率：14mg(82％)。[0451]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ(ppm)＝9.69(1h，s)，7.40(4h，d，j＝7.9hz)，7.31(4h，d，j＝8.0hz)，7.00-6.90(2h，m)，4.66(2h，t，j＝6.7hz)，4.04-3.98(2h，m)，3.74—3.27(32h，m)，2.65(6h，s)，2.39(6h，s)，1.66(6h，s)，097(3h，s).[0452]13cnmr(101mhz，cdcl3)δ(ppm)＝202.4，170.7，163.9，155.8，150.0，136.8，132.3，131.0，130.8，130.6，130.0，128.8，74.7，73.9，71.2，70.7，70.6，70.0，54.5，41.2，39.5，39.2，29.8，17.5，14.5，13.2，12.0.[0453]c57h71cl2n10o10s2[m+h+]的ms(esi)计算值为1189.4，获得值为1189.4。[0454]n，n’‑(14-甲基-14-((2-氧代乙氧基)甲基)-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷-1，27-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(28)[0455][0456]向n，n′‑(14-((烯丙氧基)甲基)-14-甲基-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷-1，27-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)26(87mg，0.068mmol)在h2o(0.41ml)和1，4-二氧六环(1.2ml)中的混合物添加2，6-卢剔啶(15.9μl，0.136mmol)、h2o中的四氧化锇4％(1.8μl，0.0014mmol)、高碘酸钠(58mg，0.27mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌8小时。将反应混合物用na2so3(aq)淬灭并用二氯甲烷萃取。将有机层浓缩，并将剩下的剩余物通过冲洗柱色谱来纯化以得到标题化合物。产率：74mg(85％)。[0457]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝9.70(1h，s)，7.41(4h，d，j＝8.3hz)，7.32(4h，d，j＝8.6hz)，6.93-6.85(2h，m)，4.65(2h，t，j＝6.9hz)，4.07-4.01(2h，m)，3.73-3.45(36h，m)，3.44-3.29(6h，m)，2.66(6h，s)，2.39(6h，s)，1.67(6h，s)，0.94(3h，s).[0458]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝202.0，170.6，163.7，155.7，149.8，136.7，136.7，132.2，130.9，130.7，130.4，129.9，128.6，76.9，74.6，73.8，71.0，70.6，70.5，70.4，70.3，69.8，54.4，41.0，39.4，39.0，17.4，14.3，13.0，11.8.[0459]c61h79cl2n10o12s2[m+h+]的ms(esi)计算值为1277.5，获得值为1277.5。[0460]1-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-14-(13-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-12-氧代-2，5，8-三氧杂-11-氮杂十三烷基)-14-甲基-2-氧代-6，9，12，16-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(29)[0461][0462]向n，n’‑(11-甲基-11-((2-氧代乙氧基)甲基)-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)27(14mg，0.012mmol)在t-buoh(0.21ml)中的混合物添加thf(59μl，0.12mmol)中的2m2-甲基-2-丁烯、nah2po4(1.4mg，0.012mmol)、h2o(0.07ml)中的亚氯酸钠(4.6mg，0.047mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物蒸发并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：6.2mg(44％)。[0463]′hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝7.41(4h，d，j＝8.7hz)，7.32(4h，d，j＝8.7hz)，4.68(2h，t，j＝7.1hz)，4.11-4.05(2h，m)，3.72—3.31(34h，m)，2.66(6h，s)，2.40(6h，s)，1.68(6h，s)，0.94(3h，s).[0464]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝170.7，164.0，155.8，150.0，137.0，136.7，132.1，131.1，130.9，130.0，128.9，74.4，71.4，70.8，70.6，70.1，54.6，41.0，39.6，39.1，17.8，14.5，13.2，11.9.[0465]c57h71cl2n10o11s2[m+h+]的ms(esi)计算值为1205.4，实测值为1205.4。[0466]1-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-17-(16-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-15-氧代-2，5，8，11-四氧杂-14-氮杂十六烷基)-17-甲基-2-氧代-6，9，12，15，19-五氧杂-3-氮杂二十一烷-21-酸(30)[0467][0468]向n，n’‑(14-甲基-14-((2-氧代乙氧基)甲基)-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷-1，27-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)28(74mg，0.058mmol)在叔丁醇(1.0ml)中的混合物添加thf(290μl，0.58mmol)中的2m2-甲基-2-丁烯、nah2po4(7.0mg，0.058mmol)、h2o(0.35ml)中的亚氯酸钠(22.4mg，0.23mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物蒸发并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：63mg(84％)。[0469]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝7.41(4h，d，j＝8.8hz)，7.33(4h，d，j＝8.6hz)，7.04-6.94(2h，m)，4.66(2h，t，j＝7.1hz)，4.09—4.05(2h，m)，3.74—3.43(36h，m)，3.41-3.30(6h，m)，2.67(6h，s)，2.40(6h，s)，1.68(7h，s)，0.94(3h，s).[0470]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝172.7，170.6，163.9，155.6，149.9，136.8，136.6，132.0，131.0，130.7，129.9，128.7，74.7，74.2，71.1，70.7，70.5，70.3，69.7，69.1，54.4，40.9，39.5，38.9，17.5，14.4，13.1，11.7.[0471]c61h79cl2n10o12s2[m+h+]的ms(esi)计算值为1293.5，获得值为1293.4。[0472]n，n’‑(14-((2-((2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-14-甲基-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷-1，27-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(sim6)[0473][0474]向1-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-17-(16-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-15-氧代-2，5，8，11-四氧杂-14-氮杂十六烷基)-17-甲基-2-氧代-6，9，12，15，19-五氧杂-3-氮杂二十一烷-21-酸30(10mg，0.0078mmol)在dmf(0.12ml)中的混合物添加comu(3.7mg，0.0086mmol)、n，n-二异丙基乙胺(4.1μl，0.023mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌5分钟。将混合物添加至4-[(2-氨基乙基)氨基]-2-(2，6-二氧代-3-哌啶基)-1h-异吲哚-1，3(2h)-二酮54(3.7mg，0.012mmol)。然后，将混合物在室温下搅拌1小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：5.0mg(41％)。[0475]1hnmr(500mhz，cd3od)δ(ppm)＝7.51(1h，dd，j＝7.3，6.5hz)，7.44(4h，d，j＝8.6hz)，7.39(4h，dd，j＝1.3，8.5hz)，7.09(1h，d，j＝8.6hz)，7.01(1h，d，j＝6.9hz)，5.00(1h，ddd，j＝2.3，5.3，12.8hz)，4.65-4.59(2h，m)，3.91-3.86(2h，m)，3.66-3.38(40h，m)，3.30-3.23(6h，m)，2.89-2.78(1h，m)，2.76-2.61(2h，m)，2.69(6h，s)，2.43(6h，s)，2.11-2.04(1h，m)，1.69(6h，s)，0.85(3h，s).[0476]13cnmr(126mhz，cd3od)δ(ppm)＝174.6，173.5，172.9，171.3，170.6，169.2，166.1，157.1，152.1，148.2，138.2，137.9，137.3，133.9，133.5，133.2，132.0，131.4，129.8，118.1，112.2，111.4，75.6，74.8，72.1，71.7，71.6，71.4，70.7，55.2，50.2，42.6，41.9，40.6，39.6，38.8，32.2，23.8，18.0，14.4，12.9，11.6.[0477]c76h93cl2n14o16s2[m+h+]的hrms(esi)计算值为1591.5707，获得值为1591.5343。[0478]n，n’‑(11-((2-(((s)-1-((2s，4s)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(顺式-sim1)[0479][0480]向1-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-14-(13-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-12-氧代-2，5，8-三氧杂-11-氮杂十三烷基)-14-甲基-2-氧代-6，9，12，16-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸29(5.2mg，0.0043mmol)在dmf(0.07ml)中的混合物添加comu(2.0mg，0.0047mmo1)、n，n-二异丙基乙胺(2.3μl，0.013mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌5分钟。将混合物添加至顺式-vh032胺盐酸盐9(3.0mg，0.0065mmol)。然后，将混合物在室温下搅拌1小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：4.4mg(63％)。[0481]1hnmr(500mhz，cd3od)δ(ppm)＝8.85(1h，s)，7.48-7.36(12h，m)，4.65-4.59(3h，m)，4.58-4.50(2h，m)，4.40-4.32(2h，m)，4.01-3.89(3h，m)，3.73-3.34(35h，m)，3.27(1h，d，j＝5.1hz)，2.68(6h，s)，2.46(3h，s)，2.44-2.36(1h，m)，2.43(6h，s)，1.96(1h，dt，j＝4.4，13.3hz)，1.69(6h，s)，1.02(9h，s)，0.97(3h，s).[0482]13cnmr(126mhz，cd3od)δ(ppm)＝174.8，172.9，172.0，171.8，166.1，157.1，152.8，152.1，149.1，140.0，138.2，137.9，133.5，133.2，132.0，131.4，130.4，129.8，129.1，75.4，74.8，74.7，72.2，71.7，71.5，71.4，70.7，61.0，57.9，57.6，55.2，43.9，42.1，40.6，38.8，37.8，36.8，27.0，18.0，15.9.[0483]c79h99cl2n14o13s3[m+h+]的ms(esi)计算值为1617.6050，获得值为1617.5716。[0484](r，s)-sim1的合成[0485][0486](2s，4r)-1-((17s)-1-氨基-11-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-17-(叔丁基)-11-甲基-15-氧代-3，6，9，13-四氧杂-16-氮杂十八烷-18-酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(31)[0487][0488]在室温下在3小时的时间内将乙酸乙酯(1.5ml)中的三苯基膦(15mg，0.057mmol)逐滴添加至etoac/thf/hcl1m(4ml，4∶1：5)中的化合物20(53mg，0.058mmol)。将反应混合物剧烈搅拌过夜，然后添加4mhcl(2ml)并除去乙酸乙酯层。将水层用etoac洗涤并浓缩。将粗品通过hplc(水中的5％至95％ch3cn，含0.1％氨)纯化以得到11mg的起始物质20和10mg(24％，基于回收的起始物质)的所期望的单胺31。[0489]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝8.67(1h，s)，8.52(1h，br)，7.38-7.33(4h，m)，7.17(1h，m)，4.67(1h，m)，4.55-4.47(3h，m)，4.38(1h，m)，4.07-3.94(4h，m)，3.70-3.21(31h，m)，2.98(2h，m)，2.51(3h，s)，2.31(1h，s)，2.23(1h，s)，1.02-0.93(12h，m).[0490]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝171.4，171.03，170.98，170.72，170.65，169.4，150.2，148.4，138.51，138.47，131.6，130.67，130.66，129.36，129.35，127.97，74.2，74.1，74.0，73.9，73.1，71.1，70.87，70.84，70.80，71.72，70.70，70.62，70.45，70.42，70.38，70.34，70.3，70.2，70.2，70.0，69.9，68.6，68.5，59.0，57.3，57.0，50.6，43.0，42.99，41.03，41.01，39.8，37.07，36.98，35.17，35.10，26.4，17.5，16.0[0491]c41h67n8o11s1[m+h+]+的ms(esi)计算值为879.5，获得值为879.5。[0492](2s，4r)-1-((20s)-14-((2-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-20-(叔丁基)-1-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-14-甲基-2，18-二氧代-6，9，12，16-四氧杂-3，19-二氮杂二十一烷-21-酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(32)[0493][0494]将(+)-jq1羧酸(4.5mg，0.011mmol)、hatu(4.2mg，0.011mmol)、n，n-二异丙基乙胺(5μl，0.03mmol)在dmf(0.2ml)中的预搅拌混合物添加至化合物31(10mg，0.011mmol)。将所得混合物在室温下搅拌1小时，并通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物32。产率：12mg(86％)。[0495]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝8.67(1h，s)，7.69(1h，m)，7.43-7.28(10h，m)，7.15(1h，d，j＝9.0hz)，4.82(1h，m)，4.64(2h，m)，4.54(1h，m)，4.47(1h，m)，4.35(1h，dd，j＝5.4，16.0hz)，4.10(1h，m)，4.04(1h，m)，3.95(1h，m)，3.70-3.18(38h，m)，2.62(3h，s)，2.51(3h，s)，2.48(1h，m)，2.39(3h，s)，2.14(1h，m)，1.65(3h，s)，0.97(9h，s)，0.95(1.5h，s)，0.93(1.5h，s).[0496]13cnmr(126mhz，cdcl3)δ(ppm)＝1712，171.1，170.8，170.55，170.52，1639，162.3，155.8，150.2，149.8，148.4，138.3，136.7，132.0，131.7，131.0，130.8，130.7，129.9，129.5，128.7，128.1，74.5，73.9，73.8，73.5，73.0，72.7，71.1，70.95，70.92，70.8，70.7，70.51，70.47，70.3，70.24，70.21，70.0，58.7，57.0，56.6，54.3，50.7，43.2，40.9，39.5，38.4，38.3，36.2，35.3，35.2，26.4，17.54，17.48，16.0，14.4，13.1，11.8.[0497]c60h83cin12o12s2[m+2h+]2+的ms(esi)计算值为631.3，获得值为631.8。[0498](2s，4r)-1-((20s)-20-(叔丁基)-1-((r)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-14-(13-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-12-氧代-2，5，8-三氧杂-11-氮杂十三烷基)-14-甲基-2，18-二氧代-6，9，12，16-四氧杂-3，19-二氮杂二十一烷-21-酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺((r，s)-sim1)[0499][0500]向化合物32(12mg，0.01mmol)在meoh(1ml)中的混合物添加10重量％钯碳(0.5mg)。将所得反应混合物在氢气氛下在室温下搅拌过夜。然后将混合物在硅藻土垫上过滤并蒸发。将(-)-jq1羧酸(4mg，0.01mmol)、hatu(4mg、0.01mmol)n，n-二异丙基乙胺(5μl，0.03mmol)在dmf(0.20ml)中的预搅拌混合物添加至经浓缩的粗品。将混合物在室温下搅拌1小时，并通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：4.7mg(31％)[0501]1hnmr(500mhz，cdcl3，非对映体的混合物)δ(ppm)＝8.70(1h，s)，7.57-7.28(14h，m)，7.20(1h，m)，4.76(1h，m)，4.72-4.60(3h，m)，4.58-4.44(2h，m)，4.43-4.33(1h，m)，4.14-3.95(3h，3h)，3.69-3.25(38h，m)，2.68-2.60(6h，m)，2.50(3h，s)，2.39(6h，s)，2.36-2.29(1h，m)，2.22-2.12(1h，m)，1.68-1.61(6h，m)，1.00-0.95(9h，m)，0.92(3h，s).[0502]13cnmr(126mhz，cdcl3，非对映体的混合物)δ(ppm)＝171.46，171.41，170.89，170.86，170.7(br)，1706，1644(br)，155.5，150.4，150.0，148.1，138.59，138.55，137.0(br)，136.2(br)，132.1(br)，131.9，13102(br)，131.11，131.09，130.47，130.42，130.1(br)，129.33，129.30，128.7，128.0，73.8(br)，70.92，70.86，70.61，70.58，70.4，70.2(br)，70.1，69.9，59.259.1，57.3，56.8(br)，53.9，43.0，41.0，40.8，39.3(br)，38.0(br)，36.7(br)，35.59，35.55，29.7，264，17.75，17.71，15.95，14.42，14.39，14.37，13.1，11.7[0503]c79h99cl2n14o13s3[m+h+]的hrms(esi)计算值为1617.6050，获得值为1617.6025。[0504]化合物mn674的合成[0505][0506]8-((烯丙氧基)甲基)-1，15-二叠氮基-8-甲基-3，6，10，13-四氧杂十五烷(33)[0507][0508]将2-((烯丙氧基)甲基)-2-甲基丙烷-1，3-二醇2(350mg，2.19mmol)溶解于dmf(5ml)中并冷却至0℃。添加nah(350mg，在油中60％，8.75mmol)，并将反应物在0℃下搅拌15分钟。之后，添加2-(2-叠氮乙氧基)甲磺酸乙酯(1.4g，6.5mmol)并将反应物在60℃下搅拌过夜。然后将混合物在硅藻土垫上过滤并浓缩。在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化粗物质以得到标题化合物。产率：507mg(60％)。[0509]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝5.96-5.84(1h，m)，5.29(1h，m)，5.16(1h，m)，4.00-3.95(2h，m)，3.73-3.68(4h，m)，3.68-3.63(4h，m)，3.63-3.58(4h，m)，3.42-3.36(8h，m)，3.33(2h，m)，0.98(3h，s).[0510]2-(3-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)-2-((2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)甲基)-2-甲基丙氧基)乙醛(34)[0511][0512]向8-((烯丙氧基)甲基)-1，15-二叠氮基-8-甲基-3，6，10，13-四氧杂十五烷33(507mg，1.31mmol)在h2o(4ml)和1，4-二氧六环(14ml)中的混合物添加2，6-卢剔啶(330μl，2.6mmol)、h2o的四氧化锇4％(180μl，0.01mmol)、高碘酸钠(1.2g，0.21mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物用na2so3(aq)淬灭并用二氯甲烷萃取。将有机层浓缩，并通过柱色谱纯化剩下的剩余物以得到标题化合物。产率：425mg(85％)[0513]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝9.75(1h，s)，4.02(2h，s)，3.73-3.58(14h，m)，3.46(2h，m)，3.42-3.35(10h，m)，1.01(3h，s).[0514]2-(3-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)-2-((2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)甲基)-2-甲基丙氧基)乙酸(35)[0515][0516]向2-(3-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)-2-((2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)甲基)-2-甲基丙氧基)乙醛34(425mg，1.1mmol)在t-buoh(15ml)中的混合物添加thf(2.75ml，5.5mmol)中的2m2-甲基-2-丁烯、nah2po4(132mg，1.1mmol)、h2o(3ml)中的亚氯酸钠(500mg，4.4mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物浓缩并随后用naoh(aq)稀释。将混合物用mtbe洗涤并通过2mhcl中和。用二氯甲烷萃取，将有机层通过na2so4干燥并浓缩。将剩余的粗品用于下一步，而无需进一步纯化。产率：422mg(95％)。[0517](2s，4r)-1-((s)-15-叠氮基-8-((2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)甲基)-2-(叔丁基)-8-甲基-4-氧代-6，10，13-三氧杂-3-氮杂十五烷酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺(36)[0518][0519]将hatu(194mg，0.51mmo1)和n，n-二异丙基乙胺(270μl)添加至dmf(2ml)中的2-(3-(2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)-2-((2-(2-叠氮乙氧基)乙氧基)甲基)-2-甲基丙氧基)乙酸35(200mg，0.51mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌2分钟。将vh032胺盐酸盐(240mg，0.51mmo1)添加至混合物。将混合物在室温下搅拌1小时，并在酸性条件下通过hplc(0.1％aq.hco2h中的5％至95％ch3cn)纯化以得到标题化合物。产率：312mg(75％)。[0520]1hnmr(500mhz，cdcl3)δ(ppm)＝8.70(1h，s)，7.43-7.33(5h，m)，7.13(1h，d，j＝8.5hz)，4.77(1h，t，j＝7.8hz)，4.63-4.54(2h，m)，4.47(1h，d，j＝8.7hz)，4.37(1h，dd，j＝5.5，15.0hz)，4.19-4.13(1h，m)，3.96(2h，m)，371-3.53(14h，m)，3.46-3.34(10h，m)，2.63(1h，m)，2.54(3h，s)，2.14(1h，m)，1.01(3h，s)，0.97(9h，s).[0521]c37h57n10o9s[m+h+]的ms(esi)计算值为817.4，获得值为817.9。[0522]n，n’‑(8-((2-(((s)-1-((2s，4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-8-甲基-3，6，10，13-四氧杂十五烷-1，15-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)(mn674)biologicalsystems:lmplicationsfordesignanduseofmultivalentligandsandinhibitors.angewchemintedengl37，2754-2794(1998).[0564]36.fujisawa，t.&filippakopoulos，p.functionsofbromodornain-containingproteinsandtheirrolesinhomeostasisandcancer.natrevmolcellbiol18，246-262(2017).[0565]37.raina，k.etal.protac-inducedbetproteindegradationasatherapyforcastration-resistantprpstatecancer.pnatlacadsciusa113，7124-7129(2016).[0566]38.winter，g.e.etal.betbromodomainproteinsfunctionasmastertranscriptionelongationfactorsindependentofcdk9recruitment.molcell67，5-18.e19(2017).[0567]39.frost，j.etal.potentandselectivechemicalprobeofhypoxicsignallingdownstreamofhif-αhydroxylationviavhlinhibition.natcommun7，13312(2016).[0568]40.tanaka，m.etal.designandcharacterizationofbivalentbetinhibitors.natchembiol12，1089-1096(2016).[0569]41.waring，m.jetal.potentandselectivebivalentinhibitorsofbetbromodomains.natchembiool12，1097-1104(2016).[0570]42.zhu，x.fetal.knockdownofhemeoxygenase-1promotesapoptosisandautophagyandenhancesthecytotoxicityofdoxorubicininbreastcancercells.oncollett10，2974-2980(2015).[0571]43.runcie，a.c.etal.optimizationofa‘bump-and-hole’approachtoallele-seleclivebetbromodomaininhibition.chemsci9，2452-2468(2018).[0572]44.smith，b.e.etal.differentialprotacsubstratespecifrcitydictatedbyorientationofrecruitede3ligase.natcommun10，131(2d19).[0573]45.hughes，s.j.&ciulli，a.molecularrecognitionoftemarycomplexes：anewdimensioninthestructure-guideddesignofchemicaldegraders.essaysbiochem61，505—516(2017).[0574]46.fisher.s.l.&phillips，a.j.targetedproteindegradationandtheenzymologyofdegraders.curropinchembiol44，47-55(2018).[0575]47.lucas，x.，vanmolle，l.&ciulli，a.surfaceprobingbyfragment-basedscreeningandcomputationalmethodsldentifiesligandablepocketsonthevonhippel-lindau(vhl)e3ubiquitinligase.j.med.chem.61，7387-7393(2018).[0576]48.sun，q.etal.discoveryofsmallmoleculesthatbindtok-rasandinhibitsos-mediatedactivation.angewchem/ntedengl51，6140-6143(2012).[0577]49.takahashi，d.etal.autacs：cargo-specificdegradersusingselectiveautophagy.molcell76，797—810.e10(2019).[0578]50.yamazoe，s.etal.heterobifunctionalmoleculesinducedephosphorylationofkinases-aproofofconceptstudy.j.med.chem.63，2807-2813(2020).[0579]51.banik，s.m.etal.lysosome-targetingchimaerasfordegradationofextracellularproteins.nature584，291-297(2020).[0580]52.siriwardena，s.u.etal.phosphorylation-lnducingchimericsmallmolecules.jamchemsoc142，14052-14057(2020).[0581]53.galdeano，c.etal.structure-guideddesignandoptimizationofsmallmoleculestargetingtheprotein—proteininteractionbetweenthevonhippel-lindau(vhl)e3ubiquitinligaseandthehypoxiainduciblefactor(hif)alphasubunitwithinvitronanomolaraffinities.j.med.chem.57，8657-8663(2014).[0582]54.girardini，m.etal.cereblonversusvhl：hijackinge3ligaseaagainsteachotherusingprotacs.bioorg，med.chem.27，2466—2479(2019).当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.式i化合物，或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物：其中b和d各自是与待被泛素连接酶降解的靶蛋白或多肽结合的配体；其中a是e3泛素连接酶蛋白结合配体；其中m、n和o各自独立地选自0、1、2、3、4、5和6。2.根据权利要求1所述的化合物，其中m和n独立地选自2、3、4、5和6，任选地其中m和n二者相同并且选自2、3、4、5和6。3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中m和n各自独立地选自2、3和4，任选地其中m和n二者相同并且选自2、3和4。4.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中m和n是3。5.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中o选自0和1，任选地其中o是0。6.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中以下中至少一者：b和d各自是与布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中的蛋白质结合的化学部分；b和d可各自是诱导布罗莫和额外末端(bet)蛋白质家族中的brd2、brd3和/或brd4蛋白降解的化学部分；b和d各自独立地选自：(i)(ii)
(iii)和(iv)7.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中b和d中的至少一者是8.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中b和d二者都是9.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中a选自von hippel-lindau(vhl)-e3泛素连接酶结合配体或cereblon(crbn)-e3泛素连接酶配体。10.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中a选自：(i)(ii)和
(iii)11.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中a选自：(i)和(ii)12.根据任一前述权利要求所述的化合物，其中a是13.根据任一前述权利要求所述的化合物，或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物，其中所述式i化合物具有式ia：
其中p选自2、3、4、5和6；其中q选自0、1和2。14.根据权利要求13所述的化合物，其中p可选自2、3和4，任选地其中p是3。15.根据权利要求13或14所述的化合物，其中q选自0和1，任选地其中q是0。16.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物，其中所述式i化合物具有式ib：其中r选自2、3、4、5和6；其中s选白0、1和2。17.根据权利要求16所述的化合物，其中以下中至少一者：r选自2、3和4，任选地其中r是3；
s选自0和1，任选地其中s是0。18.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物，其中所述式i化合物具有式ic：其中t选自2、3、4、5和6；其中u选自0、1和2。19.根据权利要求18所述的化合物，其中以下中至少一者：t选自2、3和4，任选地其中t是3；u选自0和1，任选地其中u是0。20.根据权利要求1至12中任一项所述的化合物，或其可药用盐、对映体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶型物，其中所述式i化合物具有式id：
二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2,3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)；(v)n，n
’‑
(11-((2-(2-((2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2,3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)；(vi)n，n
’‑
(14-((2-((2-((2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1，3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-14-甲基-3，6，9，12，16，19，22，25-八氧杂二十七烷-1，27-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2,3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂6-基)乙酰胺)；(vii)n，n
’‑
(11-((2-(((s)-1-((2s,4s)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-11-甲基-3，6，9，13，16，19-六氧杂二十一烷-1，21-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2,3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)；(viii)(2s,4r)-1-((20s)-20-(叔丁基)-1-((r)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-14-(13-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)-12-氧代-2，5，8-三氧杂-11-氮杂十三烷基)-14-甲基-2，18-二氧代-6，9，12，16-四氧杂-3，19-二氮杂二十一烷-21-酰基)-4-羟基-n-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺；(ix)n，n
’‑
(8-((2-(((s)-1-((2s,4r)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)氨甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-2-氧代乙氧基)甲基)-8-甲基-3，6，10，13-四氧杂十五烷-1，15-二基)双(2-((s)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6h-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂-6-基)乙酰胺)。23.药物组合物，其包含根据任一前述权利要求中所限定的化合物及其可药用载剂或稀释剂。24.根据权利要求1至22中任一项所述的化合物，其用作药物。25.根据权利要求1至22中任一项所述的化合物，或根据权利要求23中所限定的药物组合物，其用于预防或治疗独立地选自以下的疾病或病症：癌症；良性增殖性病症；感染或非感染性炎性事件；自身免疫病；炎性疾病；全身炎症反应综合征；病毒感染和疾病；眼科病症。

技术总结
本发明特别地涉及与布罗莫和额外末端(BET)蛋白质家族中的蛋白质结合的如本文所述的式I三官能PROTAC，并且尤其涉及包含小分子E3泛素连接酶蛋白结合配体化合物的PROTAC，所述PROTAC诱导BET蛋白质家族布罗莫结构域中BRD2蛋白的优先降解。BRD2蛋白的优先降解。BRD2蛋白的优先降解。


技术研发人员：阿莱西奥
受保护的技术使用者：普罗美加公司
技术研发日：2021.10.19
技术公布日：2023/8/24