LuAccD基因用于调节植物脂肪酸合成和耐盐抗旱性的应用

luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成和耐盐抗旱性的应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及luaccd基因，具体涉及luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成和耐盐抗旱性的应用。


背景技术：

2.乙酰辅酶a羧化酶作为脂肪酸从头合成的限速酶，广泛存在于各类生物体中，以异质型和同质型两种类型存在，且两种类型都具有生物素羧基载体蛋白亚基、生物素羧化酶亚基、羧基转移酶的α-ct亚基和β-ct亚基。在种子的脂肪酸积累过程中，乙酰辅酶a羧化酶的活性与脂肪酸合成速率呈正比。在烟草质体中过量表达编码β-ct亚基的accd基因，促进了叶片和种子脂肪酸合成。在油菜种子中特异表达编码大肠杆菌异质型乙酰辅酶a羧化酶β-ct亚基的accd基因，可显著提高油菜种子含油量。在陆地棉中accase的四个亚基相互协调，共同调控种子含油量，过量表达ghbccp1、ghbc1、ghα-ct和ghβ-ct基因均可显著提高陆地棉种子含油量。
3.亚麻的乙酰辅酶a羧化酶β-ct亚基编码基因(即亚麻的accd基因)在发育的种子中高表达，但其在植物油脂代谢和逆境响应过程中的功能尚不清楚，因此限制了亚麻accd基因的基因工程应用。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成和耐盐抗旱性的应用，解决现有技术中luaccd基因的功能尚不清楚，导致其基因工程应用受到限制的技术问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
6.luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成的应用，将luaccd基因在植物中过表达后，能够提高植物的脂肪酸合成量。
7.luaccd基因用于调节植物耐盐抗旱性的应用，将luaccd基因在植物中过表达后，能够提高植物的耐盐抗旱性。
8.所述的luaccd基因的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 1所示；luaccd基因编码的氨基酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 2所示。
9.本发明还具有如下技术特征：
10.具体的，将luaccd基因在植物中过表达后，能够提高植物油脂积累相关基因的转录水平；所述的油脂积累相关基因包括：atbccp1基因、atbccp2基因、atmcat基因、atkas1基因、atkas2基因、atssi2基因、atfad2基因、atfad3基因和atpdat2基因。
11.具体的，将luaccd基因在植物中过表达后，能够提高植物的耐盐抗旱性；所述的luaccd基因的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 1所示。
12.具体的，将luaccd基因在植物中过表达后，能够降低植物中与胁迫响应相关基因
的转录水平；所述的与胁迫响应相关基因包括：atnced3基因、atabi3基因、ataao3基因、atem1基因和atem6基因。
13.具体的，将luaccd基因在植物中过表达后，植物能够耐受150mm的氯化钠和300mm的甘露醇。
14.具体的，所述的将luaccd基因在植物中过表达的方法包括：
15.将luaccd基因连接在过表达载体pgreen-35s-6ha上，获得35s:luaccd-6ha过量表达载体，然后将35s:luaccd-6ha过量表达载体转入植物中；所述的过表达载体pgreen-35s-6ha的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 3所示。
16.具体的，所述的植物为野生型植物。
17.本发明还保护如上所述的将luaccd基因在植物中过表达的方法。
18.本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
19.(ⅰ)本发明通过探究luaccd基因在植物种子油脂代谢及响应非生物胁迫中的功能，给出了luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成和耐盐抗旱性的应用，填补了luaccd基因在基因工程应用方面的空白。
20.(ⅱ)本发明对于解析植物种子油脂代谢过程中酶活性分子的调控机制、改良亚麻脂肪酸含量及组分以及培育高抗亚麻新品种，具有重要意义。
附图说明
21.图1为luaccd基因在过表达载体pgreen-35s-6ha中插入位置的示意图。图1中：rb表示右边界，lb表示左边界，nos-pro表示启动子；nos-ter表示终止子，basta表示草铵膦抗性筛选基因，35s-pro表示35s强启动子。
22.图2为对转基因株系种子进行pcr鉴定的核酸电泳图。图2中：cas表示35s:luaccd-6ha过量表达载体。
23.图3为qrt-pcr鉴定luaccd基因在转基因株系种子中的表达水平的柱状统计图。
24.图4为野生型拟南芥种子和转基因株系种子的宏观形态图。
25.图5为野生型拟南芥种子和转基因株系种子千粒重的柱状统计图。
26.图6为野生型拟南芥种子和转基因株系种子长度和宽度的柱状统计图。
27.图7为野生型拟南芥种子和转基因株系种子中总脂肪酸含量的柱状统计图。
28.图8为野生型拟南芥种子和转基因株系种子中各脂肪酸组分含量的柱状统计图。
29.图9为qrt-pcr检测野生型拟南芥种子和转基因株系种子中油脂积累相关基因的表达水平的柱状统计图。
30.图10为盐及甘露醇胁迫下野生型拟南芥种子和转基因株系种子的萌发状态图。图10中：1/2ms表示1/2ms培养基，150mm nacl表示150mm氯化钠，300mm mannitol表示300mm甘露醇。
31.图11为盐及甘露醇胁迫下野生型拟南芥种子和转基因株系种子萌发率的柱状统计图。图11中：1/2ms表示1/2ms培养基，150mm nacl表示150mm氯化钠，300mm mannitol表示300mm甘露醇。
32.图12为盐胁迫下野生型拟南芥种子和转基因株系种子中胁迫响应相关基因的表达水平的柱状统计图。
33.以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。
具体实施方式
34.需要说明的是，本发明中的所有用到的试剂、试剂盒、酶和培养基，在没有特殊说明的情况下，均采用本领域已知的试剂、试剂盒、酶和培养基，例如：
35.植物rna提取试剂盒，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号为no.ag21019。
36.反转录试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司，货号为no.ae311。
37.高保真dna聚合酶，购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为no.r045q。
38.dna纯化回收试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为no.dp214。
39.限制性内切酶ecor i和xma i，生产自new england biolabs公司。
40.一步克隆试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，商品名为clonexpressⅱone step cloning kit。
41.质粒提取试剂盒，生产自美国omega bio-tek公司。
42.除草剂，生产自拜耳公司，商品名为basta除草剂，其有效成分为草铵膦，草铵膦的含量为20％[v/v]。
[0043]
1l的lb液体培养基中包括如下组分：胰蛋白胨为10g，酵母提取物为5g，nacl为10g；lb固体培养基则是在上述配方的基础上再加入15g琼脂。
[0044]1/2ms培养基，购自北京索莱宝科技有限公司，货号为no.m8527。
[0045]
本发明中：
[0046]
亚麻采用现有技术中已知的亚麻(胡麻)“陇亚10号”，该亚麻为甘肃省农业科学院作物研究所培育而成。
[0047]
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本技术技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
[0048]
实施例1:
[0049]
本实施例给出一种luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成的应用，该应用将luaccd基因在植物中过表达后，能够提高植物的脂肪酸合成量。
[0050]
作为本实施例的一种具体方案，将luaccd基因在植物中过表达的方法具体包括如下步骤：
[0051]
步骤一，luaccd基因克隆：
[0052]
步骤1.1，luaccd基因序列获取与特异性引物设计：
[0053]
通过拟南芥数据库tair网站获得ataccd蛋白质序列，根据拟南芥ataccd蛋白质序列在ncbi数据库中运行blast p程序比对得到亚麻中的同源序列，命名为luaccd基因，luaccd基因的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 1所示，luaccd基因编码的氨基酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 2所示。
[0054]
设计并确定luaccd基因在载体上的插入位置，如图1所示；然后利用ncbi中的primer blast程序设计特异性引物(35s:luaccd-6ha-ecor i-f和35s:luaccd-6ha-xma i-r)，同时设计载体上的验证引物(35s-f)，引物序列如表1所示。
[0055]
表1、引物序列
[0056]
引物名称引物序列(5
’→3’
)
35s:luaccd-6ha-ecor i-fgataagcttgatatcgaattcatgactagttcagatagaat 35s:luaccd-6ha-xma i-rgtatgggtaactagaactagtatgagtcaaagcgtggaga 35s-fgacccttcctctatataaggaagttc
[0057]
步骤1.2，rna提取与cdna合成：
[0058]
使用植物rna提取试剂盒提取亚麻萌发期种子总rna，以亚麻萌发期种子总rna为模板，使用反转录试剂盒合成亚麻萌发期种子的cdna。
[0059]
步骤1.3，luaccd基因克隆：
[0060]
采用步骤1.1中设计好的特异性引物，以步骤1.2中合成的亚麻萌发期种子的cdna为模板，使用高保真dna聚合酶，通过pcr技术扩增目标基因，反应体系为：10
×
pcr buffer 2.5μl、mg
2+
1μl、dntp 1μl、kod-plus 0.5μl、上下游引物各1μl、cdna模板1μl、灭菌水补齐至25μl；pcr反应条件如表2所示。
[0061]
表2、高保真pcr反应条件
[0062][0063]
pcr反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据dna marker判断目的基因大小是否正确，并迅速对大小正确的条带进行切胶，使用通用型dna纯化回收试剂盒对目的基因片段进行纯化回收。
[0064]
步骤二，植物表达载体的构建：
[0065]
步骤2.1，连接目的基因片段与线性载体：
[0066]
在37℃恒温条件下，使用限制性内切酶ecor i和xma i，对过表达载体pgreen-35s-6ha以及步骤1.3中获得的目的基因片段进行过夜酶切。酶切产物使用dna纯化回收试剂盒进行纯化回收。采用一步克隆试剂盒，将纯化后的目的片段与酶切载体按照2:1摩尔比混合，于37℃的温度下进行重组反应30分钟，完成目的基因片段与线性载体的连接。过表达载体pgreen-35s-6ha的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 3所示。
[0067]
步骤2.2，连接产物的转化：
[0068]
将步骤2.1获得的连接产物加入大肠杆菌感受态细胞dh5α中，轻轻吸打混匀放置于冰上20分钟，42℃水浴90秒，迅速置于冰上2分钟，加入700μl的lb液体培养基，放置于37℃摇床振荡培养30分钟后，将菌液涂布于含50μg
·
ml-1
卡那霉素的lb固体培养基平板上，37℃恒温培养箱倒置过夜。
[0069]
步骤2.3，单克隆筛选和鉴定：
[0070]
从步骤2.2中过夜培养的平板上单次挑取10个单克隆菌落，分别置于7μl ddh2o中混合均匀，吸取1μl菌液为模板，使用步骤1.1中设计好的引物35s-f和35s:luaccd-6ha-xma i-r，进行菌落pcr验证。pcr反应结束后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，选择2个条带正确的
单克隆菌落加入含50μg
·
ml-1
卡那霉素的lb液体培养基中，28℃，220rpm摇床振荡培养20小时。
[0071]
取培养好的菌液进行测序，测序结果与目的基因序列相同，表明已成功将luaccd基因克隆至过表达载体pgreen-35s-6ha中。
[0072]
步骤2.4，获得35s:luaccd-6ha过量表达载体：
[0073]
对步骤2.3筛选并鉴定正确的质粒菌液进行扩大培养，然后按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，获得35s:luaccd-6ha过量表达载体。
[0074]
步骤三，拟南芥遗传转化、筛选与鉴定：
[0075]
步骤3.1，转化和菌落鉴定：
[0076]
将步骤2.4中获得的35s:luaccd-6ha过量表达载体转入农杆菌感受态细胞gv3101中，挑取单克隆菌落，采用步骤1.1设计好的引物35s-f和35s:luaccd-6ha-xma i-r进行菌落pcr验证。
[0077]
步骤3.2，培养并收集阳性菌落的菌体：
[0078]
将步骤3.1中pcr验证的阳性菌落加到200ml含50μg
·
ml-1
卡那霉素和50μg
·
ml-1
利福霉素的lb液体培养基中扩大培养，直至菌液od
600
为1.8～2.0，室温4000rpm离心10分钟收集菌体。
[0079]
步骤3.3，采取农杆菌花序浸染法转染野生型拟南芥：
[0080]
将步骤3.2中收集到的菌体用拟南芥转化液重悬至od
600
值为0.8～1.0，该拟南芥转化液中含有5％[w/v]的蔗糖与0.02％[v/v]的silwet l-77表面活性剂；将整株植物的花序浸泡在拟南芥转化液中30～40秒，取出植物，侧置放入托盘中暗培养2天，然后进行正常光照培养，待其成熟后收获t0代种子。
[0081]
步骤3.4，转基因植株的筛选与鉴定：
[0082]
将步骤3.3中收获的t0代种子均匀撒播在营养土上，4℃黑暗培养2～3天后，转移至光照培养室继续培养。待长出2片真叶后，使用除草剂连续喷施幼苗约1周至筛选出仍能继续生长的抗性植株，除草剂的工作浓度为0.06％[v/v]；将筛选出的抗性植株转移至新的营养土中继续生长，待莲座叶期提取植株幼嫩叶片dna，使用步骤1.1设计好的特异性引物35s-f和35s:luaccd-6ha-xma i-r进行pcr扩增，结果如图2所示，将鉴定获得的t1代阳性转基因植株，继续培养至成熟并收获t2代种子；将t2代种子播于含有10μg
·
ml-1
草铵膦的ms培养基上继续筛选培养，最终得到t3代纯合种子。
[0083]
本实施例中，使用步骤1.1设计好的特异性引物35s-f和35s:luaccd-6ha-xma i-r对t3代纯合种子中的luaccd基因的表达水平进行了鉴定，结果如图3所示，由图3可知，t3代纯合种子中luaccd基因在转录水平上进行了表达。
[0084]
实施例1的效果验证：
[0085]
为了检验luaccd基因对植物油脂累积相关基因的影响，设计了qrt-pcr引物，qrt-pcr引物如表3所示：
[0086]
表3、油脂累积相关基因的qrt-pcr引物
[0087]
引物名称引物序列(5
’→3’
)rt-qpcr-atbccp1-ftcactcaaacctcctcgcacrt-qpcr-atbccp1-rttgtgctttcaccacagggt
pcr引物如表4所示：
[0096]
表4、与胁迫响应相关基因的qrt-pcr引物
[0097]
引物名称引物序列(5
’→3’
)rt-qpcr-atabi3-ftccattagacagcagtcaaggtttrt-qpcr-atabi3-rggtgtcaaagaactcgttgctatcrt-qpcr-ataao3-fggagtcagcgaggtggaagtrt-qpcr-ataao3-rtgctccttcggtctgtcctaart-qpcr-atnced3-faggtcgtgtgagttcttatgrt-qpcr-atnced3-rcactggtaaatctcgctctcrt-qpcr-atem1-ftagggcacgagggttatcagrt-qpcr-atem1-rcgctctccaccagatttttcrt-qpcr-atem6-fgcaaactcgaaaggagcagtrt-qpcr-atem6-rtctcgactccttcctcctca
[0098]
(e)对野生型拟南芥种子和转基因株系种子，进行了150mm氯化钠和300mm甘露醇胁迫条件下的种子萌发试验，结果如图10和图11所示。由图10和图11可知，在正常条件下，野生型拟南芥种子和转基因株系种子的萌发率无显著差异；但是，在150mm氯化钠和300mm甘露醇胁迫条件下，转基因株系种子的萌发率显著高于野生型拟南芥种子。
[0099]
(f)利用qrt-pcr技术，检测氯化钠胁迫下，野生型拟南芥种子和转基因株系种子在萌发中参与胁迫响应基因atnced3、atabi3、ataao3、atem1和atem6的表达水平，结果如图12所示。由图12可知，相比于野生型拟南芥种子，转基因株系种子中与胁迫响应相关基因atnced3、atabi3、ataao3、atem1和atem6的表达量显著降低。
[0100]
(g)综合上述(e)和(f)的分析可知，luaccd基因通过调控与胁迫响应相关基因的表达，提高了拟南芥萌发期种子对盐耐受性；在拟南芥中过表达luaccd基因，能够提高了拟南芥萌发期种子对盐和甘露醇的耐受性。
[0101]
综合实施例1和实施例2的效果验证可知，luaccd基因在提升种子脂肪酸含量方面具有巨大的潜在功能，利用转基因技术，将该基因过量表达于油料作物中，能够获得高含油量且耐盐抗旱的转基因株系。

技术特征：
1.luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成的应用，将luaccd基因在植物中过表达后，能够提高植物的脂肪酸合成量。2.如权利要求1所述的luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成的应用，其特征在于，将luaccd基因在植物中过表达后，能够提高植物油脂积累相关基因的转录水平；所述的油脂积累相关基因包括：atbccp1基因、atbccp2基因、atmcat基因、atkas1基因、atkas2基因、atssi2基因、atfad2基因、atfad3基因和atpdat2基因。3.如权利要求1所述的luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成的应用，其特征在于，所述的将luaccd基因在植物中过表达的方法包括：将luaccd基因连接在过表达载体pgreen-35s-6ha上，获得35s:luaccd-6ha过量表达载体，然后将35s:luaccd-6ha过量表达载体转入植物中；所述的过表达载体pgreen-35s-6ha的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 3所示。4.如权利要求1至3任一项所述的luaccd基因用于调节植物脂肪酸合成的应用，其特征在于，所述的植物为野生型植物。5.luaccd基因用于调节植物耐盐抗旱性的应用，将luaccd基因在植物中过表达后，能够提高植物的耐盐抗旱性。6.如权利要求5所述的luaccd基因用于调节植物耐盐抗旱性的应用，其特征在于，将luaccd基因在植物中过表达后，能够降低植物中与胁迫响应相关基因的转录水平；所述的与胁迫响应相关基因包括：atnced3基因、atabi3基因、ataao3基因、atem1基因和atem6基因。7.如权利要求5所述的luaccd基因用于调节植物耐盐抗旱性的应用，其特征在于，将luaccd基因在植物中过表达后，植物能够耐受150mm的氯化钠和300mm的甘露醇。8.如权利要求5所述的luaccd基因用于调节植物耐盐抗旱性的应用，其特征在于，所述的将luaccd基因在植物中过表达的方法包括：将luaccd基因连接在过表达载体pgreen-35s-6ha上，获得35s:luaccd-6ha过量表达载体，然后将35s:luaccd-6ha过量表达载体转入植物中；所述的过表达载体pgreen-35s-6ha的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 3所示。9.如权利要求5至8任一项所述的luaccd基因用于调节植物耐盐抗旱性的应用，其特征在于，所述的植物为野生型植物。10.一种将luaccd基因在植物中过表达的方法，其特征在于，该方法包括：将luaccd基因连接在过表达载体pgreen-35s-6ha上，获得35s:luaccd-6ha过量表达载体，然后将35s:luaccd-6ha过量表达载体转入植物中；所述的过表达载体pgreen-35s-6ha的核苷酸序列如核苷酸或氨基酸序列表中的sequence id number 3所示。

技术总结
本发明提供了LuAccD基因用于调节植物脂肪酸合成的应用，将LuAccD基因在植物中过表达后，能够提高植物的脂肪酸合成量。本发明还提供了LuAccD基因用于调节植物耐盐抗旱性的应用，将LuAccD基因在植物中过表达后，能够提高植物的耐盐抗旱性。本发明通过探究LuAccD基因在植物种子油脂代谢及响应非生物胁迫中的功能，给出了LuAccD基因用于调节植物脂肪酸合成和耐盐抗旱性的应用，填补了LuAccD基因在基因工程应用方面的空白。工程应用方面的空白。工程应用方面的空白。


技术研发人员：陈明训 刘子金 李欣叶 王建军 何双呈
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2023.04.06
技术公布日：2023/8/24