用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物、检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物、检测试剂盒。


背景技术：

2.抑郁症是现在最常见的一种心理疾病，以连续且长期的心情低落为主要的临床特征，是现代人心理疾病最重要的类型。采用抗抑郁药治疗是抑郁症治疗的一种重要手段，但抗抑郁药会引起超过80％患者的不良反应，甚至10％患者对任何抗抑郁药物治疗均无效，因此，预测患者对抗抑郁药的疗效和不良反应，对于抑郁症治疗的效果具有十分重要的意义。导致抗抑郁药物治疗出现巨大个体差异的原因，除了传统上的性别、年龄、病理、生理、身高、体重、依从性等方面外，遗传因素的差异性也是重点关注的因素之一，其中药物代谢酶、转运蛋白、受体和其他药物作用靶点的基因多态性是引起抗抑郁药物治疗个体差异的重要原因。通过用于抑郁症用药指导的检测试剂盒来检测基因多态性是预测患者对抗抑郁药的疗效和不良反应的一个有效途径，这些检测试剂盒中的引物及探针组合物会采用多重pcr扩增体系进行特异性扩增，但存在不同引物扩增效率差异大的问题。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是提出一种用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物、检测试剂盒，旨在解决现有的引物及探针组合物会采用多重pcr扩增体系进行特异性扩增，但存在不同引物扩增效率差异大的问题。
4.为实现上述目的，本发明提出一种用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，包括：
5.第一引物组，包括第一上游引物、第一下游引物及第一分子信标探针，所述第一上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述第一分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:3所示；
6.第二引物组，包括第二上游引物、第二下游引物及第二分子信标探针，所述第二上游引物的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述第二分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:6所示；
7.第三引物组，包括第三上游引物、第三下游引物及第三分子信标探针，所述第三上游引物的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述第三下游引物的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述第三分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:9所示；
8.第四引物组，包括第四上游引物、第四下游引物及第四分子信标探针，所述第四上游引物的核苷酸序列如seq id no:10所示，所述第四下游引物的核苷酸序列如seq id no:11所示，所述第四分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:12所示；
9.第五引物组，包括第五上游引物、第五下游引物及第五分子信标探针，所述第五上游引物的核苷酸序列如seq id no:13所示，所述第五下游引物的核苷酸序列如seq id no:
14所示，所述第五分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:15所示；
10.第六引物组，包括第六上游引物、第六下游引物及第六分子信标探针，所述第六上游引物的核苷酸序列如seq id no:16所示，所述第六下游引物的核苷酸序列如seq id no:17所示，所述第六分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:18所示；
11.第七引物组，包括第七上游引物、第七下游引物及第七分子信标探针，所述第七上游引物的核苷酸序列如seq id no:19所示，所述第七下游引物的核苷酸序列如seq id no:20所示，所述第七分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:21所示；
12.第八引物组，包括第八上游引物、第八下游引物及第八分子信标探针，所述第八上游引物的核苷酸序列如seq id no:22所示，所述第八下游引物的核苷酸序列如seq id no:23所示，所述第八分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:24所示；
13.第九引物组，包括第九上游引物、第九下游引物及第九分子信标探针，所述第九上游引物的核苷酸序列如seq id no:25所示，所述第九下游引物的核苷酸序列如seq id no:26所示，所述第九分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:27所示；
14.第十引物组，包括第十上游引物、第十下游引物及第十分子信标探针，所述第十上游引物的核苷酸序列如seq id no:28所示，所述第十下游引物的核苷酸序列如seq id no:29所示，所述第十分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:30所示；
15.第十一引物组，包括第十一上游引物、第十一下游引物及第十一分子信标探针，所述第十一上游引物的核苷酸序列如seq id no:31所示，所述第十一下游引物的核苷酸序列如seq id no:32所示，所述第十一分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:33所示；
16.第十二引物组，包括第十二上游引物、第十二下游引物及第十二分子信标探针，所述第十二上游引物的核苷酸序列如seq id no:34所示，所述第十二下游引物的核苷酸序列如seq id no:35所示，所述第十二分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:36所示；以及，
17.平衡引物，所述平衡引物的核苷酸序列如seq id no:37所示；
18.其中，所述第一分子信标探针、所述第二分子信标探针、所述第三分子信标探针、所述第四分子信标探针、所述第五分子信标探针、所述第六分子信标探针、所述第七分子信标探针、所述第八分子信标探针、所述第九分子信标探针、所述第十分子信标探针、所述第十一分子信标探针和所述第十二分子信标探针的5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有淬灭基团，所述第一分子信标探针、所述第二分子信标探针、所述第三分子信标探针、所述第四分子信标探针、所述第五分子信标探针、所述第六分子信标探针、所述第七分子信标探针、所述第八分子信标探针、所述第九分子信标探针、所述第十分子信标探针、所述第十一分子信标探针和所述第十二分子信标探针的茎干区均修饰有标记化合物，所述标记化合物为hoe33342-脂肪酸酯。
19.可选地，所述第一分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物；和/或，
20.所述第二分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物。
21.可选地，所述第三分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物；和/或，
22.所述第四分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基
cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物。
23.可选地，所述第五分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物；和/或，
24.所述第六分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物。
25.可选地，所述第七分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前两个碱基ct和倒数前两个碱基ag均修饰有所述标记化合物；和/或，
26.所述第八分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物。
27.可选地，所述第九分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前两个碱基ct和倒数前两个碱基ag均修饰有所述标记化合物；和/或，
28.所述第十分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前四个碱基ctag和倒数前三个碱基ctag均修饰有所述标记化合物。
29.可选地，所述第十一分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物；和/或，
30.所述第十二分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物。
31.可选地，所述第一分子信标探针、所述第二分子信标探针、所述第七分子信标探针和所述第八分子信标探针的5’端均标记有fam荧光基团，3’端均标记有dabcy1淬灭基团；和/或，
32.所述第三分子信标探针、所述第四分子信标探针、所述第十一分子信标探针和所述第十二分子信标探针的5’端均标记有vic荧光基团，3’端均标记有dabcy1淬灭基团；和/或，
33.所述第五分子信标探针、所述第六分子信标探针、所述第九分子信标探针和所述第十分子信标探针的5’端均标记有rox荧光基团，3’端均标记有dabcy1淬灭基团。
34.可选地，还包括：
35.第十三引物组，包括第十三上游引物、第十三下游引物及第十三分子信标探针，所述第十三上游引物的核苷酸序列如seq id no:38所示，所述第十三下游引物的核苷酸序列如seq id no:39所示，所述第十三分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:40所示，所述第十三分子信标探针的5’端标记有cy5荧光基团，3’端标记有dabcy1淬灭基团。
36.本发明还提出一种用于抑郁症用药指导的检测试剂盒，包括如上所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物、dn(u)tp、pcr缓冲液、ung酶以及taq酶。
37.本发明的技术方案中，各引物组对与之对应的单核苷酸多态性位点进行特异性扩增时，采用的是特异性引物+平衡引物组合扩增模式，解决了现有技术中不同引物扩增效率差异大的问题；且平衡引物的一端添加特定序列即有5个重复碱基t，有利于增加引物扩增效率与灵敏度；各探针中修饰的标记化合物hoe33342-脂肪酸酯，该标记化合物能直接嵌入dna双螺旋结构或者能够与dna双螺旋结构中的小沟结合从而形成稳定dna的双螺旋，从而提高被修饰的寡核苷酸链的tm值；与常规的分子信标探针相比，本发明的分子信标探针热稳定好，在90℃的高温下仍然能够保持发夹结构；与常规的分子信标探针相比，本发明的分
子信标探针背景荧光信号低，提高了其杂交信背比；与常规的分子信标探针相比，本发明的分子信标探针保持了分子信标的单碱基识别能力。
附图说明
38.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
39.图1为本发明提供的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物的扩增工作原理示意图；
40.图2为本发明提供的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物中各分子信标探针的工作原理示意图；
41.图3为本发明提供的用于抑郁症用药指导的检测试剂盒在进行熔解曲线分析的原理示意图；
42.图4为本发明实施例4中a管fam通道的熔解曲线图；
43.图5为本发明实施例4中a管vic通道的熔解曲线图；
44.图6为本发明实施例4中a管rox通道的熔解曲线图；
45.图7为本发明实施例4中a管cy5通道的熔解曲线图；
46.图8为本发明实施例4中b管fam通道的熔解曲线图；
47.图9为本发明实施例4中b管vic通道的熔解曲线图；
48.图10为本发明实施例4中b管rox通道的熔解曲线图；
49.图11为本发明实施例4中b管cy5通道的熔解曲线图。
50.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
51.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
52.需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
53.目前引物及探针组合物的多重pcr扩增体系多采用上下游引物不对称扩增法，这种方法在进行多重扩增时，容易造成每个靶点扩增效率不一致，相互干扰且富集速度较慢从而造成体系中出现不同引物扩增效率差异大的问题。
54.鉴于此，本发明提出一种用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，包括第一引物组、第二引物组、第三引物组、第四引物组、第五引物组、第六引物组、第七引物组、第八引物组、第九引物组、第十引物组、第十一引物组、第十二引物组以及平衡引物，所述第一引物组包括第一上游引物、第一下游引物及第一分子信标探针，所述第一上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述第一分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:3所示，所述第二引物组包括第二上游引物、第二下游引物及第二分子信标探针，所述第二上游引物的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述第二分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:6所示，所述第三引物组包括第三上游引物、第三下游引物及第三分子信标探针，所述第三上游引物的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述第三下游引物的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述第三分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:9所示，所述第四引物组包括第四上游引物、第四下游引物及第四分子信标探针，所述第四上游引物的核苷酸序列如seq id no:10所示，所述第四下游引物的核苷酸序列如seq id no:11所示，所述第四分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:12所示，所述第五引物组包括第五上游引物、第五下游引物及第五分子信标探针，所述第五上游引物的核苷酸序列如seq id no:13所示，所述第五下游引物的核苷酸序列如seq id no:14所示，所述第五分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:15所示，所述第六引物组包括第六上游引物、第六下游引物及第六分子信标探针，所述第六上游引物的核苷酸序列如seq id no:16所示，所述第六下游引物的核苷酸序列如seq id no:17所示，所述第六分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:18所示，所述第七引物组包括第七上游引物、第七下游引物及第七分子信标探针，所述第七上游引物的核苷酸序列如seq id no:19所示，所述第七下游引物的核苷酸序列如seq id no:20所示，所述第七分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:21所示，所述第八引物组包括第八上游引物、第八下游引物及第八分子信标探针，所述第八上游引物的核苷酸序列如seq id no:22所示，所述第八下游引物的核苷酸序列如seq id no:23所示，所述第八分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:24所示，所述第九引物组包括第九上游引物、第九下游引物及第九分子信标探针，所述第九上游引物的核苷酸序列如seq id no:25所示，所述第九下游引物的核苷酸序列如seq id no:26所示，所述第九分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:27所示，所述第十引物组包括第十上游引物、第十下游引物及第十分子信标探针，所述第十上游引物的核苷酸序列如seq id no:28所示，所述第十下游引物的核苷酸序列如seq id no:29所示，所述第十分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:30所示，所述第十一引物组包括第十一上游引物、第十一下游引物及第十一分子信标探针，所述第十一上游引物的核苷酸序列如seq id no:31所示，所述第十一下游引物的核苷酸序列如seq id no:32所示，所述第十一分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:33所示，所述第十二引物组包括第十二上游引物、第十二下游引物及第十二分子信标探针，所述第十二上游引物的核苷酸序列如seq id no:34所示，所述第十二下游引物的核苷酸序列如seq id no:35所示，所述第十二分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:36所示，所述平衡引物的核苷酸序列如seq id no:37所示，其中，所述第一分子信标探针、所述第二分子信标探针、所述第三分子信标探针、所述第四分子信标探针、所述第五分子信标探针、所述第六分子信标探针、所述第七分子信标探针、所述第八分子信标探针、所述第九分子信标探针、所述第十分子信标探
针、所述第十一分子信标探针和所述第十二分子信标探针的5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有淬灭基团，所述第一分子信标探针、所述第二分子信标探针、所述第三分子信标探针、所述第四分子信标探针、所述第五分子信标探针、所述第六分子信标探针、所述第七分子信标探针、所述第八分子信标探针、所述第九分子信标探针、所述第十分子信标探针、所述第十一分子信标探针和所述第十二分子信标探针的茎干区均修饰有标记化合物，所述标记化合物为hoe33342-脂肪酸酯。
55.其中，hoe33342-脂肪酸酯的制备过程如下：
56.步骤s10、将1.5ghoechst33342与1.0g氢氧化钠溶解在20ml的n,n二甲基甲酰胺中将反应混合物在50℃加热4小时，进行冷却、过滤、旋蒸，将剩余物质溶解在甲醇中，用硅胶柱纯化用洗脱剂进行洗脱后得到的化合物进行乙醇重结晶得到1.2g的2'-(4-乙基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-二-1h-苯并咪唑。
57.步骤s20、将1.2g的2'-(4-乙基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-二-1h-苯并咪唑放在5ml的br2·
h2o和铁粉中，加热到60℃反应混合物冷去后析出产物，产物过滤与洗涤得到0.5g 2'-(4-乙基-3-溴苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-二-1h-苯并咪唑。
58.步骤s30、将0.5g 2'-(4-乙基-3-溴苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-二-1h-苯并咪唑与0.56g koh放入10ml乙醇中加热60℃反应2小时，反应混合物冷却产物析出，过滤后干燥得到0.3g 2'-(4-乙基-3-羟基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-二-1h-苯并咪唑。
59.步骤s40、将0.3g 2'-(4-乙基-3-羟基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-二-1h-苯并咪唑与3g的硬脂酸(c
18h36
o2)放入8ml乙醇中65℃加热2小时，得到0.25g 2'-(4-乙基-3-羟基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2,5'-二-1h-苯并咪唑-脂肪酸酯(hoe33342-脂肪酸酯)。
60.第一引物组对cyp2c19*2c.681g》a进行扩增，第二引物组对cyp2c19*3c.636g》a进行扩增，第三引物组对cyp2c19*17c.-806c》t进行扩增，第四引物组对cyp2d6*10c.100c》t进行扩增，第五引物组对cyp2d6*4c.1846g》a进行扩增，第六引物组对cyp2d6*2*41c.2850c》t进行扩增，第七引物组对abcb1 c.2677t》a进行扩增，第八引物组对htr2a c.614-2211t》c进行扩增，第九引物组对adra2a c.-1252g》c进行扩增，第十引物组对fkbp5 c.-20+18122t》c进行扩增，第十一引物组对htr1a c.-1019g》c进行扩增，第十二引物组对abcb1 c.3435t》c进行扩增。
61.每一引物组中，上游引物或者下游引物的一条引物由两个部分组成a+b：b为靠近3’端的核苷酸序列，与靶序列完全相同，a(与平衡引物的核苷酸序列相同)为靠近5’端链接的一段人工核苷酸序列，与靶序列完全不同源，以第一引物组为例说明，第一上游引物tttttgtgacaccgatcttcggcata ttgtatctatacct中，tttttgtgacaccgatcttc为a，ggcatattgt atctatacct为b；另一条引物与靶序列完全互补。然后搭配平衡引物，组成特异性引物+平衡引物组合扩增模式，具体工作原理见图1。
62.需要说明的是，分子信标探针的设计一般包括三个部分：环状区：由15～30个可以与靶序列特异结合的核苷酸组成；茎干区：一般由5～8个可发生可逆性解离的碱基对组成；荧光基团和淬灭基团：荧光基团一般联接在信标分子的5’端，淬灭基团联接在3’端。此为分子信标探针的常规结构，本发明的分子信标探针与常规的分子信标探针相比，是在茎干区
进行特殊的化学修饰基团修饰，也即在茎干区修饰有标记化合物hoe33342-脂肪酸酯。
63.本发明的技术方案中，各引物组对与之对应的单核苷酸多态性位点进行特异性扩增时，采用的是特异性引物+平衡引物组合扩增模式，解决了现有技术中不同引物扩增效率差异大的问题；且平衡引物的一端添加特定序列即有5个重复碱基t，有利于增加引物扩增效率与灵敏度；各分子信标探针中修饰的标记化合物hoe33342-脂肪酸酯，该标记化合物能直接嵌入dna双螺旋结构或者能够与dna双螺旋结构中的小沟结合从而形成稳定dna的双螺旋(工作原理见图2)，从而提高被修饰的寡核苷酸链的tm值；与常规的分子信标探针相比，本发明的分子信标探针热稳定好，在90℃的高温下仍然能够保持发夹结构；与常规的分子信标探针相比，本发明的分子信标探针背景荧光信号低，提高了其杂交信背比；与常规的分子信标探针相比，本发明的分子信标探针保持了分子信标的单碱基识别能力。
64.每一分子信标探针上进行标记化合物hoe33342-脂肪酸酯修饰的核苷酸的数目(序列每一端被修饰的核苷酸数目)不高于4，有助于避免化学修饰而导致分子信标杂交速率低。优选地，在本发明实施例中，所述第一分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物，所述第二分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物，所述第三分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物，所述第四分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物，所述第五分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物，所述第六分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物，所述第七分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前两个碱基ct和倒数前两个碱基ag均修饰有所述标记化合物，所述第八分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物，所述第九分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前两个碱基ct和倒数前两个碱基ag均修饰有所述标记化合物，所述第十分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前四个碱基ctag和倒数前三个碱基ctag均修饰有所述标记化合物，所述第十一分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物，所述第十二分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物。
65.可以理解的是，上述各分子信标探针被修饰的核苷酸数目相关条件，可以同时满足，也可以只满足其中一个或多个，而作为本发明的优选实施例，上述条件同时满足，可使得分子信标杂交速率更高。
66.本发明对各分子信标探针所标记的荧光基团和淬灭基团类型不做限制，优选地，所述第一分子信标探针、所述第二分子信标探针、所述第七分子信标探针和所述第八分子信标探针的5’端均标记有fam荧光基团，3’端均标记有dabcy1淬灭基团，所述第三分子信标探针、所述第四分子信标探针、所述第十一分子信标探针和所述第十二分子信标探针的5’端均标记有vic荧光基团，3’端均标记有dabcy1淬灭基团，所述第五分子信标探针、所述第六分子信标探针、所述第九分子信标探针和所述第十分子信标探针的5’端均标记有rox荧
光基团，3’端均标记有dabcy1淬灭基团。
67.可以理解的是，上述各分子信标探针所标记的荧光基团和淬灭基团类型相关条件，可以同时满足，也可以只满足其中一个或多个，而作为本发明的优选实施例，上述条件同时满足，更易进行基因分型，检测效率更高。
68.所述用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物还包括第十三引物组，包括第十三上游引物、第十三下游引物及第十三分子信标探针，所述第十三上游引物的核苷酸序列如seq id no:38所示，所述第十三下游引物的核苷酸序列如seq id no:39所示，所述第十三分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:40所示，所述第十三分子信标探针的5’端标记有cy5荧光基团，3’端标记有dabcy1淬灭基团，第十三引物组用于扩增内参序列β-actin，以作为检测时的参照物，提高检测准确性。
69.本发明还提出一种用于抑郁症用药指导的检测试剂盒，包括如上所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物、dn(u)tp、pcr缓冲液、ung酶以及taq酶，所述用于抑郁症用药指导的检测试剂盒包括上述用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物的全部技术方案，因此具备上述用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物所带来的全部有益效果，在此不再一一赘述；此外，与现有的检测试剂盒相比，本检测试剂盒可以直接对全血样本进行检测、无需进行繁琐的核酸提取过程，操作时间短、成本低；根据各分子信标探针与靶序列杂交形成的杂交链的熔解温度(tm)不同，可利用熔解曲线分析，提高检测效率，满足临床大样本量的检测需求；并且，ung酶可以选择性水解断裂含有du的双链或单链dna中的尿嘧啶糖苷键，消除pcr产物污染，从而达到pcr防污染的效果。
70.熔解曲线分析原理：通过pcr扩增含检测位点的核苷酸序列，而后由从低温到高温的升温过程，荧光探针与单链靶序列形成的探针-扩增产物复合体从互补配对到解链变性，期间的荧光值变化过程记录为熔解曲线。由于snp位点的碱基突变，导致靶序列与探针的匹配程度不一，从而产生热稳定性不同的pcr产物-探针杂交复合体，导致不同snp型别具有不同特征的熔解峰图和不同的tm值。若待测个体的某snp位点只有一种等位基因，则结果中只有一个熔解峰，可凭借tm值的高低区分出不同纯合型别；若待测个体的某snp位点有两种等位基因，则结果会出现两个熔解峰，此两个熔解峰的tm值分别与两种纯合等位基因的熔解峰的tm值一致。因此，可通过对熔解峰图中熔解峰个数及对应tm值对检测snp位点基因型进行判读。具体原理见图3。
71.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
72.实施例1引物及探针组合物的设计、筛选及确定
73.(1)将genebank数据库中调取的相关基因组全序列进行比对分析，用p rimer5.0和oligo7.0设计针对其相对应基因特异扩增引物和探针。
74.(2)利用正交试验方法，在a管中同时扩增目标序列(681g》a、636g》a、-806c》t、100c》t、1846g》a、2850c》t)及内参序列(β-actin)，b管中扩增基因序列(2677t》a、-1252g》c、-20+18122t》c、-1019g》c、614-2211t》c、3435t》c)及内参序列(β-actin)，通过大量实验对比筛选引物和探针，最终确立的引物及探针组合物见序列表所示。
75.实施例2检测试剂盒的组分浓度确定
76.引物及探针组合物中各引物和各探针的终浓度选择50nm-500nm，dn(u)tp终浓度
选择100nm-300nm，taq酶终浓度选择1-7.5u/反应，ung酶选择0.05-0.3u/反应，平衡引物与上下游引物的比例经过优化验证确定，probe qp cr buffer利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的pcr反应体系见表1和表2。
77.表1a管pcr反应液配方
[0078][0079][0080]
注：a管反应液总量为23μl，加样量为2μl，反应液总反应体积为25μl。
[0081]
表2b管pcr反应液配方
[0082][0083][0084]
注：b管反应液总量为23μl，加样量为2μl，反应液总反应体积为25μl。
[0085]
实施例3反应条件的确定
[0086]
确定初步反应条件的范围见表3。
[0087]
表3本检测试剂盒使用时的反应条件范围
[0088][0089]
经过大量实验对比优化，最终确定的最佳反应条件见表4。
[0090]
表4本检测试剂盒使用时的最佳反应条件
[0091][0092]
退火温度和退火时间对pcr扩增效率和特异性扩增影响较大，优化结果显示退火温度偏低会其有非特异性扩增信号导致假阳性结果、温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到对无非特异性扩增信号，特异性好，扩增效率高，灵敏度高。检测上机前免提取可节约检测成本，总反应时间约为1.5小时，与其他方法学相比较可以就节约时间。
[0093]
实施例4结果分析
[0094]
(1)按照分析软件生成的熔解曲线图像，根据各个信号通道上的特定t m值范围内有无熔解峰来鉴定样本的基因型别。
[0095]
待检样本检测结果：fam、vic、rox、cy5通道应均为阳性，且熔解峰tm值应均在参考范围之内(详见表5、表6)，任意检测位点或内参基因β-actin出现无熔解峰或熔解峰tm值不在参考范围之内，说明该检测结果无效，建议重新检测。
[0096]
表5a管pcr反应液各位点多态性的tm值参考范围
[0097][0098]
表6b管pcr反应液各位点多态性的tm值参考范围
[0099][0100][0101]
(2)结果判读示例。
[0102]
1)对待检样本进行检测分析，得到a管pcr反应液检测结果(熔解曲线图)见图4-图7，图4为fam通道的熔解曲线图，图5为vic通道的熔解曲线图，图6为rox通道的熔解曲线图，图7为cy5通道的熔解曲线图；得到b管pcr反应液检测结果(熔解曲线图)见图8-图11，图8为fam通道的熔解曲线图，图9为vic通道的熔解曲线图，图10为rox通道的熔解曲线图，图11为cy5通道的熔解曲线图。
[0103]
2)针对图4-图11结果，结合表5和表6进行判断，得到待检样本12个基因位点的基因型见表7。
[0104]
表7待检样本12个位点基因型检测结果
[0105][0106]
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，其特征在于，包括：第一引物组，包括第一上游引物、第一下游引物及第一分子信标探针，所述第一上游引物的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述第一下游引物的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述第一分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:3所示；第二引物组，包括第二上游引物、第二下游引物及第二分子信标探针，所述第二上游引物的核苷酸序列如seq id no:4所示，所述第二下游引物的核苷酸序列如seq id no:5所示，所述第二分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:6所示；第三引物组，包括第三上游引物、第三下游引物及第三分子信标探针，所述第三上游引物的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述第三下游引物的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述第三分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:9所示；第四引物组，包括第四上游引物、第四下游引物及第四分子信标探针，所述第四上游引物的核苷酸序列如seq id no:10所示，所述第四下游引物的核苷酸序列如seq id no:11所示，所述第四分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:12所示；第五引物组，包括第五上游引物、第五下游引物及第五分子信标探针，所述第五上游引物的核苷酸序列如seq id no:13所示，所述第五下游引物的核苷酸序列如seq id no:14所示，所述第五分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:15所示；第六引物组，包括第六上游引物、第六下游引物及第六分子信标探针，所述第六上游引物的核苷酸序列如seq id no:16所示，所述第六下游引物的核苷酸序列如seq id no:17所示，所述第六分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:18所示；第七引物组，包括第七上游引物、第七下游引物及第七分子信标探针，所述第七上游引物的核苷酸序列如seq id no:19所示，所述第七下游引物的核苷酸序列如seq id no:20所示，所述第七分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:21所示；第八引物组，包括第八上游引物、第八下游引物及第八分子信标探针，所述第八上游引物的核苷酸序列如seq id no:22所示，所述第八下游引物的核苷酸序列如seq id no:23所示，所述第八分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:24所示；第九引物组，包括第九上游引物、第九下游引物及第九分子信标探针，所述第九上游引物的核苷酸序列如seq id no:25所示，所述第九下游引物的核苷酸序列如seq id no:26所示，所述第九分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:27所示；第十引物组，包括第十上游引物、第十下游引物及第十分子信标探针，所述第十上游引物的核苷酸序列如seq id no:28所示，所述第十下游引物的核苷酸序列如seq id no:29所示，所述第十分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:30所示；第十一引物组，包括第十一上游引物、第十一下游引物及第十一分子信标探针，所述第十一上游引物的核苷酸序列如seq id no:31所示，所述第十一下游引物的核苷酸序列如seq id no:32所示，所述第十一分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:33所示；第十二引物组，包括第十二上游引物、第十二下游引物及第十二分子信标探针，所述第十二上游引物的核苷酸序列如seq id no:34所示，所述第十二下游引物的核苷酸序列如seq id no:35所示，所述第十二分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:36所示；以及，平衡引物，所述平衡引物的核苷酸序列如seq id no:37所示；其中，所述第一分子信标探针、所述第二分子信标探针、所述第三分子信标探针、所述
第四分子信标探针、所述第五分子信标探针、所述第六分子信标探针、所述第七分子信标探针、所述第八分子信标探针、所述第九分子信标探针、所述第十分子信标探针、所述第十一分子信标探针和所述第十二分子信标探针的5’端均标记有荧光基团，3’端均标记有淬灭基团，所述第一分子信标探针、所述第二分子信标探针、所述第三分子信标探针、所述第四分子信标探针、所述第五分子信标探针、所述第六分子信标探针、所述第七分子信标探针、所述第八分子信标探针、所述第九分子信标探针、所述第十分子信标探针、所述第十一分子信标探针和所述第十二分子信标探针的茎干区均修饰有标记化合物，所述标记化合物为hoe33342-脂肪酸酯。2.如权利要求1所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，其特征在于，所述第一分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物；和/或，所述第二分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物。3.如权利要求1所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，其特征在于，所述第三分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物；和/或，所述第四分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物。4.如权利要求1所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，其特征在于，所述第五分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物；和/或，所述第六分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物。5.如权利要求1所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，其特征在于，所述第七分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前两个碱基ct和倒数前两个碱基ag均修饰有所述标记化合物；和/或，所述第八分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物。6.如权利要求1所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，其特征在于，所述第九分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前两个碱基ct和倒数前两个碱基ag均修饰有所述标记化合物；和/或，所述第十分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前四个碱基ctag和倒数前三个碱基ctag均修饰有所述标记化合物。7.如权利要求1所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，其特征在于，所述第十一分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数第一个碱基c和倒数第一个碱基g均修饰有所述标记化合物；和/或，所述第十二分子信标探针的核苷酸序列中，自5’端向3’端的方向，顺数前三个碱基cta和倒数前三个碱基tag均修饰有所述标记化合物。8.如权利要求1所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，其特征在于，所述第
一分子信标探针、所述第二分子信标探针、所述第七分子信标探针和所述第八分子信标探针的5’端均标记有fam荧光基团，3’端均标记有dabcy1淬灭基团；和/或，所述第三分子信标探针、所述第四分子信标探针、所述第十一分子信标探针和所述第十二分子信标探针的5’端均标记有vic荧光基团，3’端均标记有dabcy1淬灭基团；和/或，所述第五分子信标探针、所述第六分子信标探针、所述第九分子信标探针和所述第十分子信标探针的5’端均标记有rox荧光基团，3’端均标记有dabcy1淬灭基团。9.如权利要求1所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物，其特征在于，还包括：第十三引物组，包括第十三上游引物、第十三下游引物及第十三分子信标探针，所述第十三上游引物的核苷酸序列如seq id no:38所示，所述第十三下游引物的核苷酸序列如seq id no:39所示，所述第十三分子信标探针的核苷酸序列如seq id no:40所示，所述第十三分子信标探针的5’端标记有cy5荧光基团，3’端标记有dabcy1淬灭基团。10.一种用于抑郁症用药指导的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至9任意一项所述的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物、pcr缓冲液、ung酶以及taq酶。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，具体公开一种用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物、检测试剂盒，所述用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物包括第一引物组、第二引物组、第三引物组、第四引物组、第五引物组、第六引物组、第七引物组、第八引物组、第九引物组、第十引物组、第十一引物组、第十二引物组以及平衡引物。本发明提供的用于抑郁症用药指导的引物及探针组合物解决了现有技术中不同引物扩增效率差异大的问题；增加了引物扩增效率与灵敏度；提高了被修饰的寡核苷酸链的Tm值；本发明的分子信标探针在90℃的高温下仍然能够保持发夹结构；提高了杂交信背比；保持了分子信标的单碱基识别能力。碱基识别能力。碱基识别能力。


技术研发人员：孙芳 刘福平 刘晶晶 梁柔 郑建权
受保护的技术使用者：深圳会众生物技术有限公司
技术研发日：2023.03.31
技术公布日：2023/8/24